專利名稱：基于pH的反饋補料生產賴氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及發酵法生產賴氨酸的方法，具體地說涉及一種基于PH的反饋控制補 加碳源和氮源發酵生產賴氨酸的方法。
背景技術：
L-賴氨酸(以下簡稱賴氨酸)是八種人體必需氨基酸中最重要的一種，它對調節 生物體內代謝平衡，提高生物對谷類蛋白質的吸收，改善人類膳食營養和動物營養，促進生 長發育均有重要作用。賴氨酸被廣泛用作動物飼料添加劑、食品添加劑、藥品等。2006年全 球賴氨酸的消費量達到85萬噸，其中90%的賴氨酸用作飼料添加劑，約5%用作食品添加 劑，5%用作醫藥中間體。賴氨酸的工業生產始于1958年，日本木下祝郎、中山清等采用紫外線照射谷氨酸 棒桿菌得到了一株營養缺陷型突變株，其L-賴氨酸生成量達到工業生產水平。目前，微生 物發酵法已成為生產賴氨酸的主要方法，工業生產規模逐年擴大。近年來，隨著原材料價格 的上漲和市場的激烈競爭，為了提高賴氨酸產率和降低生產成本，仍有大量關于賴氨酸發 酵方面的研究報道，主要集中在選育高產賴氨酸菌株、改進發酵工藝和開發新資源等方面。賴氨酸產生菌屬于具有多重遺傳標記的突變株，能在胞外大量積累賴氨酸是由于 菌體的代謝調節處于異常狀態，對環境條件非常敏感。發酵條件如碳源、氮源、無機鹽、PH及 溶解氧等對賴氨酸的合成有重要影響。其中，底物(葡萄糖)濃度是影響菌體代謝的一個 重要參數，它主要通過控制相關酶的合成或活性影響菌體的代謝途徑，通常稱作葡萄糖效 應(俞俊棠，《新編生物工藝學》，化學工業出版社，2003年，110頁)。葡萄糖可通過“葡萄 糖效應”阻遏、抑制多種酶的合成，如氨基酸合成酶等，這種阻遏作用主要是其分解代謝物 引起的。在以葡萄糖為碳源的賴氨酸發酵中，葡萄糖的分解代謝物阻遏會引起多種副產物 如丙氨酸等的積累，從而影響糖對賴氨酸的轉化率(張克旭，《代謝控制發酵》，中國輕工業 出版社，1998年，299頁)。目前，賴氨酸發酵主要采用的是批式發酵模式。在菌體生長階段需要提供一定 濃度的葡萄糖以獲得足夠濃度的菌體，而在菌體產酸階段需要維持較低的葡萄糖濃度，這 樣能夠激活賴氨酸合成途徑的關鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，從而強化二氧化碳固定反 應，提高賴氨酸產率。為了實現上述發酵模式，在賴氨酸的生產過程中一般采用補料的方 法，但是現有的補料方法主要是按照預定程序流加，屬于無反饋的流加，雖然操作比較簡 單，但是不能真實反映發酵過程中葡萄糖濃度的變化；或者靠人工定時取樣分析再調整流 加速率，糖濃度的控制滯后，導致葡萄糖濃度波動大。另外，由于在線測定葡萄糖濃度有困 難，所以目前無法實現在線測定發酵液中葡萄糖的濃度并及時反饋控制。因此在賴氨酸發 酵生產過程中，其補料具有盲目性，發酵生產的重復性也較差。在賴氨酸發酵生產過程中，準確控制及時補加氮源也是十分重要的。在賴氨酸發 酵生產的不同階段，菌體內的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的二氧化碳固定反應與丙酮酸 激酶催化生成丙酮酸的途徑的分配系數直接影響賴氨酸的得率。由于發酵液中銨根和硫酸根的存在能夠激活賴氨酸合成途徑中關鍵酶天冬氨酸激酶(文獻Agric. Biol. Chem.， 1979，43 (12)，P. 2480)，有利于解除天冬氨酸對于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反饋抑制，增 加二氧化碳固定反應的代謝流量，從而達到強化賴氨酸合成途徑的效果，所以發酵液中的 硫酸銨濃度與上述的分配系數直接有關，維持適宜的硫酸銨濃度是調節上述兩個途徑分配 系數的關鍵。因此在賴氨酸的發酵生產中還需要流加氮源硫酸銨和氨，既維持了適宜的PH 值，又能夠提高賴氨酸的產量。在賴氨酸的發酵生產中目前普遍采用的是按照預定程序或 人工定時取樣分析后流加硫酸銨，用發酵液的PH值作為反饋信號控制氨的流加。這種方式 導致硫酸銨濃度(相當于銨離子摩爾濃度的二分之一，在發酵的PH下，發酵液中氨的存在 形態主要是銨離子)的控制也不精確并且重復性差，影響賴氨酸的發酵生產。
發明內容
本發明的目的之一在于克服現有的賴氨酸生產方法在補料時具有盲目性，影響生 產控制，使得發酵產量低的缺陷。提供一種通過檢測發酵液中的PH變化，利用pH值反饋控 制補料，維持一定的葡萄糖濃度和/或維持一定的硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比，從而簡化 生產工藝，在不增加額外設備的情況下使賴氨酸的發酵產量大幅度提高的PH反饋補料生 產賴氨酸的方法。本發明的目的之二在于上述維持一定葡萄糖濃度和/或維持一定的硫酸銨與賴 氨酸摩爾濃度比的基礎上，提出了分段控制賴氨酸發酵生產的方法，進一步促進賴氨酸的 發酵生產。本發明的目的是通過如下技術方案實現的本發明提供的基于pH的反饋補料生產賴氨酸的方法，包括使用常規方法制備生 產賴氨酸的種液，然后進行賴氨酸好氧發酵；本發明是在賴氨酸好氧發酵進行過程中，按照 賴氨酸好氧發酵過程中葡萄糖消耗速率和氨消耗速率之間的比例關系(該比例關系可以 由本領域技術人員針對不同的發酵菌種自行測定得到)，配制葡萄糖和氨的混合溶液，通過 向發酵液中流加該混合溶液來控制發酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動， 使之既不產生葡萄糖抑制，也不構成限制，達到維持一定的葡萄糖濃度，從而提高賴氨酸發 酵產量的目的。此時硫酸銨的流加可采用常規方法；或，在賴氨酸好氧發酵進行過程中，按照賴氨酸好氧發酵過程中所需的硫酸銨添 加速率(由賴氨酸合成速率乘以擬維持的發酵液中的硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比得到)和 氨消耗速率之間的比例關系(該比例關系可以由本領域技術人員針對不同的發酵菌種自 行測定得到)，配制硫酸銨和氨的混合溶液，通過向發酵液中流加該混合溶液來控制發酵液 的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動，使之既不產生硫酸銨抑制，也不構成限制， 達到維持一定的硫酸銨與產生的賴氨酸摩爾濃度比，從而提高賴氨酸發酵產量的目的。此 時葡萄糖的流加可采用常規方法；或，在賴氨酸好氧發酵進行過程中，按照賴氨酸好氧發酵過程中葡萄糖消耗速率、 所需的硫酸銨添加速率(由賴氨酸合成速率乘以擬維持的發酵液中的硫酸銨與賴氨酸摩 爾濃度比得到)和氨消耗速率之間的比例關系(該比例關系可以由本領域技術人員針對不 同的發酵菌種自行測定得到)，配制葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，通過向發酵液中流加 該混合溶液來控制發酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動，使之既不產生葡萄糖抑制和硫酸銨抑制，也不構成限制，達到維持發酵液中一定的葡萄糖濃度和維持一定 的硫酸銨與產生的賴氨酸摩爾濃度比，從而提高賴氨酸發酵產量的目的；或，將上述3種控制發酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動的技術 方案聯合使用，來控制發酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動。本發明的基于pH的反饋補料生產賴氨酸的方法具體包括以下步驟(1)按常規方法制備生產賴氨酸的種液配制生產賴氨酸的種子培養基，按常規 方法滅菌；將生產賴氨酸的菌種接入生產賴氨酸的種子培養基中；在適宜的溫度下搖床培 養至對數期得到生產賴氨酸的種液；(2)好氧發酵將步驟(1)制得的生產賴氨酸的種液接入經常規方法滅菌的生產 賴氨酸的發酵培養基中，得到發酵液，其中生產賴氨酸的種液的接種量為生產賴氨酸的發 酵培養基質量的8% 18%，發酵液中的初始葡萄糖濃度為40克/升 180克/升；在好 氧發酵的過程中控制發酵液的溫度為30°C 34°C，利用pH的反饋來控制發酵液的pH在
6.5 7. 5之間的任意一個值附近波動；通過在好氧發酵過程中調節向發酵液中通入的空 氣量及調節對發酵液的攪拌轉速，使得發酵液中的溶解氧保持在 20%飽和度。所述的控制發酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動是(1)按照賴氨酸好氧發酵過程中葡萄糖消耗速率和氨消耗速率之間的比例關系， 配制葡萄糖和氨的混合溶液，通過向發酵液中流加該混合溶液來控制發酵液的PH在6. 5
7.5之間的任意一個值附近波動；或(2)按照賴氨酸好氧發酵過程中所需的硫酸銨添加速率和氨消耗速率之間的比例 關系，配制硫酸銨和氨的混合溶液，通過向發酵液中流加該混合溶液來控制發酵液的PH在 6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動；或(3)按照賴氨酸好氧發酵過程中葡萄糖消耗速率、所需的硫酸銨添加速率和氨消 耗速率之間的比例關系，配制葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，通過向發酵液中流加該混合 溶液來控制發酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動；或(4)將上述(1)、(2)和(3)所述的3種控制發酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任 意一個值附近波動的技術方案聯合使用，來控制發酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個 值附近波動。在好氧發酵開始進行時所加的流加液是氨水或液氨。采用常規的手動或自動的pH 控制方法，通過向發酵液中流加氨水或液氨，來控制發酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意 一個值；此時，發酵液中葡萄糖的濃度、發酵液中硫酸銨與產生的賴氨酸的摩爾濃度比在持 續降低。此后，當發酵液中葡萄糖的濃度降低到預先設定點時，將流加液換成葡萄糖和氨的混合 溶液，采用常規的手動或自動的PH控制方法，通過向發酵液中流加該混合溶液，來控制發 酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動，從而間接維持了發酵液中葡萄糖的濃 度在預先設定點附近波動；在發酵結束前1 2小時，將流加液改為氨水或液氨。采用常 規的手動或自動的PH控制方法，通過向發酵液中流加氨水或液氨，來控制發酵液的pH在 6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動，直到消耗殘余葡萄糖到所需濃度，發酵結束；或當發酵液中硫酸銨與產生的賴氨酸的摩爾濃度比降低到預先設定的發酵液中硫 酸銨與產生的賴氨酸的摩爾濃度比的預先設定點時，將流加液換成硫酸銨和氨的混合溶液，采用常規的手動或自動的PH控制方法，通過向發酵液中流加該混合溶液，來控制發酵 液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動，從而間接維持了發酵液中硫酸銨與產生 的賴氨酸的摩爾濃度比在預先設定點附近波動；在發酵結束前1 2小時，將流加液改為 氨水或液氨。采用常規的手動或自動的PH控制方法，通過向發酵液中流加氨水或液氨，來 控制發酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動，直到消耗殘余葡萄糖到所需濃 度，發酵結束；或當發酵液中葡萄糖的濃度降低到預先設定的發酵液中葡萄糖的濃度的預先設定 點，并且，發酵液中硫酸銨與產生的賴氨酸的摩爾濃度比降低到預先設定的發酵液中硫酸 銨與產生的賴氨酸的摩爾濃度比的預先設定點時，將流加液換成葡萄糖、硫酸銨和氨的混 合溶液，采用常規的手動或自動的PH控制方法，通過向發酵液中流加該混合溶液，來控制 發酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動，從而間接維持了發酵液中葡萄糖的 濃度在預先設定點附近波動，并且，發酵液中硫酸銨與產生的賴氨酸的摩爾濃度比在預先 設定點附近波動；在發酵結束前1 2小時，將流加液改為氨水或液氨。采用常規的手動或 自動的PH控制方法，通過向發酵液中流加氨水或液氨，來控制發酵液的pH在6. 5 7. 5之 間的任意一個值附近波動，直到消耗殘余葡萄糖到所需濃度，發酵結束。所述的葡萄糖和氨的混合溶液中葡萄糖與氨的質量濃度比為8 1 15 1之 間的任意一個值，葡萄糖的濃度為400克/升 600克/升；所述的發酵液中葡萄糖的濃度 降低到預先設定點，其預先設定點為葡萄糖的濃度為5克/升 20克/升之間的任意一個 值。所述的硫酸銨和氨的混合溶液中硫酸銨與氨的質量濃度比為2 1 4 1之間 的任意一個值，硫酸銨的濃度為100克/升 200克/升；所述的發酵液中硫酸銨與產生的 賴氨酸的摩爾濃度比的預先設定點為12 14之間的任意一個值。所述的葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液中，葡萄糖硫酸銨氨的質量濃度比為 8 15 2 4 1，葡萄糖的濃度為400克/升 600克/升；所述的發酵液中葡萄糖的 濃度的預先設定點為5克/升 20克/升之間的任意一個值，所述的發酵液中硫酸銨與產 生的賴氨酸的摩爾濃度比的預先設定點為12 14之間的任意一個值。本發明中pH值的反饋控制可通過市售的pH電極(傳感器)、儀表和執行機構完 成，或由人工完成。本發明中所述的生產賴氨酸的種子培養基和發酵培養基，本領域人員可根據現有 技術，按照生產賴氨酸時各種不同菌種所需種子培養基和發酵培養基，采用常規培養基配 方進行配制。本發明的方法對于這些種子培養基和發酵培養基均適用。所述的菌種可以是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌 (Brevibacterium flavum)、乳糖發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)或鈍齒棒 Iflif (Corynebacterium crenatum)等。所述的谷氨酸棒桿菌可以是谷氨酸棒桿菌FERM-P 1709、谷氨酸棒桿菌DSM 5714、谷氨酸棒桿菌DSM 12866、谷氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5101、中國科學院過程工程 研究所的谷氨酸棒桿菌TK26、天津科技大學的谷氨酸棒桿菌TK12或上海工業微生物研究 所的谷氨酸棒桿菌ΠΠ28等。所述的黃色短桿菌可以是黃色短桿菌FERM-P 1708、黃色短桿菌FERM-P6463、黃色短桿菌FERM-P 6464、江南大學的黃色短桿菌XQ-8、江南大學的黃色短桿菌WSH-L 1或江 南大學的黃色短桿菌FB42等。所述的乳糖發酵短桿菌可以是乳糖發酵短桿菌FERM-P 1712或江南大學的乳糖 發酵短桿菌AL039等。所述的鈍齒棒桿菌可以是沈陽藥科大學的鈍齒棒桿菌D6ch95等。本發明提供的基于pH的反饋補料生產賴氨酸的方法，是基于這樣的構思在賴氨 酸好氧發酵過程中，需要補加氨水或液氨，在調節PH的同時，氨能夠提供菌體生長和賴氨 酸合成所需的氮源。由于好氧發酵過程的氨消耗速率與葡萄糖消耗速率存在一定的比例關 系，可以考慮補加氨水或液氨調節PH的同時補加葡萄糖，利用pH來控制葡萄糖的流加速率 從而間接維持發酵液中葡萄糖的濃度一定；另一方面，賴氨酸合成速率與氨消耗速率之間 存在比例關系，由此可計算得到為了維持一定的發酵液中硫酸銨與產生的賴氨酸的摩爾濃 度比所需的硫酸銨添加速率。本發明根據葡萄糖消耗速率、所需的硫酸銨添加速率和氨消 耗速率的關系，將葡萄糖、硫酸銨和氨按此關系配制在同一溶液中，用該混合溶液調節發酵 液的PH值。在向發酵液中流加該混合溶液以調節pH的過程中，通過將pH控制在很窄的范 圍內，使得加入的氨(按當量計)與合成賴氨酸消耗的氨量相等，所以流加該混合溶液控制 PH的同時，隨同氨加入發酵液中的葡萄糖量正好補充了消耗的葡萄糖量，和/或隨同氨加 入發酵液的硫酸銨與合成的賴氨酸成一定比例。因而，只要將PH控制在很窄的范圍內，就 可以保證發酵液中葡萄糖的濃度和/或發酵液中硫酸銨與產生的賴氨酸的摩爾濃度比只 在很窄的范圍內波動。這樣的方法可以在不改變生產設備的情況下，僅在補料罐中加入葡 萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，就能夠通過PH信號的反饋來間接控制葡萄糖和/或硫酸銨 的補加，即，在控制發酵液的PH的同時實現發酵液中葡萄糖濃度和/或發酵液中硫酸銨與 產生的賴氨酸的摩爾濃度比的控制。而PH的控制是很成熟的技術，可以很方便地使用市售 的PH電極(傳感器)、控制儀表和執行機構來完成，也可以人工控制。與現有技術相比，本發明提供的基于pH的反饋補料生產賴氨酸的方法的優點在 于通過利用PH信號反饋控制葡萄糖和/或硫酸銨的補加，從而間接控制了發酵液中葡萄 糖的濃度和/或發酵液中硫酸銨與產生的賴氨酸的摩爾濃度比，達到較準確的控制葡萄糖 濃度和/或發酵液中硫酸銨與產生的賴氨酸的摩爾濃度比的目的，并且可以提高目的產物 賴氨酸的產量。在發酵過程中不需要增加額外設備，操作簡單，適合于工業化生產。
具體實施例方式下面結合實施例進一步說明實施例1使用谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum) DSM 12866 進行 pH 反饋控制 補料發酵生產賴氨酸，所用培養基如下1)種子培養基(g/L)蔗糖 25.0，玉米漿 30. OmL，(NH4)2SO4 2.0，乙酸銨 6.0， MgSO4 ·7Η20 0. 4，KH2PO4 · 3H2O 1. 0，L-丙氨酸 0. 35，味精 0. 1，FeSO4 · 7Η20 0. 01 ,MnSO4 · H2O 0. 01，生物素50 μ g，菸酰胺5mg，硫胺素0. 2mg, ρΗ7· O 7· 2，0· 075MPa壓力滅菌15分鐘。2)發酵培養基(g/L)葡萄糖 50. 0，玉米漿 40. OmL, (NH4) 2S0425. 0，KH2PO4 · 3H20 3. 0，MgSO4 · 7H20 1. 5，FeSO4 · 7H20 0· 015，MnSO4 · H2O 0· 015，生物素 0. 8mg,菸酰胺 0. 8mg,硫胺素0. 45mg, ρΗ7· 0 7· 2,0. 075MPa壓力滅菌15分鐘。從生長良好的活化斜面刮一滿環菌苔轉入裝有30mL種子培養基的500mL三角瓶 中，9層紗布封口，31. 5°C、200rpm搖床培養22小時，按8%的接種量接入含有3L發酵培養 基的5升自動控制發酵罐Biotech-2002 (上海保興生物設備工程有限公司)中，發酵罐帶 有溫度、PH、溶解氧自動控制功能。在發酵過程中，發酵溫度控制在31. 5°C，通過調節通氣 量和攪拌轉速控制溶解氧在5 10%飽和度之間。開始階段通過pH反饋用蠕動泵自動流 加質量濃度為25%的氨水控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為6. 5 6. 6。發酵8小時， 發酵液中殘余葡萄糖濃度降至20克/升，停止流加質量濃度為25%的氨水，開始向發酵液 中流加葡萄糖和氨的混合溶液控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為6. 5 6. 6，流加的混 合溶液中葡萄糖濃度為500克/升，氨濃度為50克/升。發酵12小時，發酵液中硫酸銨濃 度降至10克/升，開始采用恒速補料的方式流加硫酸銨溶液，流加速率為8mL/h，流加的硫 酸銨溶液濃度為500克/升，在27小時停止流加硫酸銨。在28小時停止流加葡萄糖和氨 的混合溶液，改為流加質量濃度為25%的氨水控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為6. 5 6. 6，直至30小時結束發酵。發酵過程中pH始終維持在6. 5 6. 6 ；在流加葡萄糖和氨的混合溶液期間發酵液 中葡萄糖濃度維持在18. 5克/升 21. 5克/升。發酵結束時，發酵液中殘余葡萄糖濃度為 5克/升，總葡萄糖糖消耗180克/升，賴氨酸產量為66. 1克/升，對葡萄糖得率為36. 7%。 與不補料的分批發酵(初始葡萄糖濃度為180克/升，賴氨酸產量53. 9克/升，發酵40小 時)相比，產量提高了 23%，發酵周期縮短了 25%。實施例2其它發酵條件同實施例1。其中菌種采用黃色短桿菌(Brevibacterium flavum) FERM-P 1708，接種量為10%，發酵培養基中初始葡萄糖濃度為60克/升，初始硫酸銨濃度 為22克/升，發酵溫度為30°C。開始階段通過pH反饋用蠕動泵自動流加質量濃度為25% 的氨水控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為7. 4 7. 5。發酵9小時，發酵液中殘余葡萄糖 濃度降至10克/升，開始采用恒速補料的方式流加葡萄糖溶液，流加速率為30mL/h，流加的 葡萄糖溶液濃度為600克/升，此時仍然在流加質量濃度為25%的氨水。發酵13小時，發 酵液中硫酸銨濃度降至5克/升，賴氨酸濃度升至15克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比 是1 2.8，停止流加質量濃度為25%的氨水，開始向發酵液中流加硫酸銨和氨的混合溶液 控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為7. 4 7. 5，流加的混合溶液中硫酸銨濃度為200克/ 升，氨濃度為100克/升。在29小時停止流加葡萄糖溶液以及硫酸銨和氨的混合溶液，改 為流加質量濃度為25%的氨水控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為7.4 7. 5，直至30小 時結束發酵。發酵過程中pH始終維持在7. 4 7. 5 ；在流加硫酸銨和氨的混合溶液期間發酵液 中硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比維持在1 2.8 1 3. 2之間。發酵結束時，發酵液中殘 余葡萄糖濃度為3克/升，總葡萄糖糖消耗180克/升，賴氨酸產量為67. 5克/升，對葡萄 糖得率為37.5%。與不補料的分批發酵(初始葡萄糖濃度為180克/升，賴氨酸產量53. 9 克/升，發酵40小時)相比，產量提高了 25%，發酵周期縮短了 25%。實施例3其它發酵條件同實施例1。其中菌種采用谷氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5101，發酵培養基中初始葡萄糖濃度為40克/升，初始硫酸銨濃度為10克/升，發酵溫度為34°C。 開始階段通過PH反饋用蠕動泵自動流加質量濃度為25%的氨水控制發酵液的pH，pH控制 范圍設定為6. 95 7. 05。發酵6小時，發酵液中殘余葡萄糖濃度降至15克/升，硫酸銨濃 度降至3克/升，賴氨酸濃度升至6克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比是1 1.8，停止 流加質量濃度為25%的氨水，開始向發酵液中流加葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液控制發 酵液的pH，pH控制范圍設定為6. 95 7. 05，流加的混合溶液中葡萄糖濃度為400克/升， 硫酸銨濃度為200克/升，氨濃度為50克/升。在28小時停止流加葡萄糖、硫酸銨和氨的 混合溶液，改為流加質量濃度為25%的氨水控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為6. 95 7. 05，直至30小時結束發酵。發酵過程中pH始終維持在6. 95 7. 05 ；在流加葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液 期間，發酵液中殘余葡萄糖濃度維持在13. 5克/升 16. 5克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃 度比維持在1 1.8 1 2.2。發酵結束時，發酵液中殘余葡萄糖濃度為2克/升，總葡 萄糖糖消耗180克/升，賴氨酸產量為66. 5克/升，對葡萄糖得率為36. 9%。與不補料的 分批發酵(初始葡萄糖濃度為180克/升，賴氨酸產量53.9克/升，發酵40小時)相比， 產量提高了 23. 4%，發酵周期縮短了 25%。實施例4其它發酵條件同實施例1。其中采用的菌種為江南大學的乳糖發酵短桿菌 (Brevibacterium lactofermentum) AL039，接種量為18 %，發酵培養基中初始葡萄糖濃度 為90克/升，初始硫酸銨濃度為35克/升。開始階段(第一階段)通過pH反饋用蠕動泵 自動流加質量濃度為25%的氨水控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為6. 95 7. 05。發酵8 小時，發酵液中殘余葡萄糖濃度降至5克/升，停止流加質量濃度為25%的氨水，開始第二 階段，向發酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為6. 95 7. 05，流加的混合溶液中葡萄糖濃度為600克/升，氨濃度為40克/升。發酵到20小時， 發酵液中硫酸銨濃度降到8克/升，賴氨酸濃度升至35克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度 比是1 3. 95，停止流加葡萄糖和氨的混合溶液，開始第三階段，向發酵液中流加葡萄糖、 硫酸銨和氨的混合溶液控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為6. 95 7. 05，流加的混合溶 液中葡萄糖濃度為600克/升，硫酸銨濃度為180克/升，氨濃度為60克/升。在64小時 停止流加葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，改為流加質量濃度為25%的氨水控制發酵液的 pH，pH控制范圍設定為6. 95 7. 05，直至65小時結束發酵。在第一階段，pH維持在6. 95 7. 05 ；在第二階段，pH維持在6. 95 7. 05，葡萄糖 濃度維持在3. 5克/升 6. 5克/升；在第三階段，pH維持在6. 95 7. 05，葡萄糖濃度維 持在3.5克/升 6.5克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比維持在1 3.8 1 4. 2。發 酵結束時，殘余葡萄糖濃度為5克/升，總葡萄糖糖消耗272克/升，賴氨酸產量為109克 /升，對葡萄糖得率為40%。與葡萄糖、硫酸銨獨立補料的常規發酵方式(通過pH反饋用 蠕動泵自動流加質量濃度為25 %的氨水控制發酵液的pH ；當殘余葡萄糖濃度在5克/升左 右、硫酸銨濃度在8克/升左右時開始流加，定時人工取樣分析，將擬流加的葡萄糖和硫酸 銨分8批加入。總葡萄糖糖消耗250克/升，賴氨酸產量95克/升，對葡萄糖得率為38% ) 相比，產量提高了 15%，對葡萄糖得率提高了 5%。實施例5
其它發酵條件同實施例1。其中采用的菌種為上海工業微生物研究所的谷氨酸 棒桿菌Π1128，接種量為8%，發酵培養基中初始葡萄糖濃度為60克/升，初始硫酸銨濃度 為40克/升。在發酵過程中，發酵溫度控制在32°C，通過調節通氣量和攪拌轉速控制溶解 氧在1 5%飽和度之間。開始階段(第一階段)通過PH反饋用蠕動泵自動流加質量濃 度為25%的氨水控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為6. 95 7. 05。發酵到9小時，發酵 液中殘余葡萄糖濃度降至10克/升，停止流加質量濃度為25%的氨水，開始第二階段，向 發酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為6. 95 7. 05， 流加的混合溶液中葡萄糖濃度為500克/升，氨 濃度為38克/升。發酵到25小時，發酵液 中硫酸銨濃度降到15克/升，賴氨酸濃度升至49. 8克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比是 1 3，停止流加葡萄糖和氨的混合溶液，開始第三階段，向發酵液中流加葡萄糖、硫酸銨和 氨的混合溶液控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為6. 95 7. 05，流加的混合溶液中葡萄 糖濃度為500克/升，硫酸銨濃度為100克/升，氨濃度為50克/升。在64小時停止流加 葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，改為流加質量濃度為25%的氨水控制發酵液的pH，pH控 制范圍設定為6. 95 7. 05，直至65小時結束發酵。在第一階段，pH維持在6. 95 7. 05 ；在第二階段，pH維持在6. 95 7. 05，葡萄 糖濃度維持在8. 5克/升 10. 5克/升；在第三階段，pH維持在6. 95 7. 05，葡萄糖濃度 維持在8.5克/升 10.5克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比維持在1 2.8 1 3.2。 發酵結束時，殘余葡萄糖濃度為5克/升，總葡萄糖糖消耗266克/升，賴氨酸產量為109 克/升，對葡萄糖得率為41%。與葡萄糖、硫酸銨獨立補料的常規發酵方式(通過pH反饋 用蠕動泵自動流加質量濃度為25%的氨水控制發酵液的pH，當殘余葡萄糖濃度在10克/ 升、硫酸銨濃度在15克/升時開始流加，定時人工取樣分析，將擬流加的葡萄糖和硫酸銨分 8批加入。總葡萄糖糖消耗250克/升，賴氨酸產量95克/升，對葡萄糖得率為38 % )相 比，產量提高了 15%，對葡萄糖得率提高了 8%。實施例6其它發酵條件同實施例1。其中采用的菌種為中國科學院過程工程研究所的谷 氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) TK26，接種量為10%，發酵培養基中初始葡萄 糖濃度為100克/升，初始硫酸銨濃度為35克/升，在發酵過程中，通過調節通氣量和攪拌 轉速控制溶解氧在10 15%飽和度之間。開始階段(第一階段)通過pH反饋用蠕動泵 自動流加質量濃度為25%的氨水控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為6. 95 7. 05。發酵 到15小時，發酵液中殘余葡萄糖濃度降至10克/升，停止流加質量濃度為25%的氨水，開 始第二階段，向發酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為 6. 95 7. 05，流加的混合溶液中葡萄糖濃度為400克/升，氨濃度為27克/升。發酵到23 小時，發酵液中硫酸銨濃度降到20克/升，賴氨酸濃度升至44克/升，硫酸銨與賴氨酸摩 爾濃度比是1 2，停止流加葡萄糖和氨的混合溶液，開始第三階段，向發酵液中流加葡萄 糖、硫酸銨和氨的混合溶液控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為6. 95 7. 05，流加的混合 溶液中葡萄糖濃度為400克/升，硫酸銨濃度為120克/升，氨濃度為30克/升。在67小 時停止流加葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，改為流加質量濃度為25%的氨水控制發酵液 的pH，pH控制范圍設定為6. 95 7. 05，直至68小時結束發酵。在第一階段，pH維持在6. 95 7. 05 ；在第二階段，pH維持在6. 95 7. 05，葡萄糖濃度維持在8. 5克/升 10. 5克/升；在第三階段，pH維持在6. 95 7. 05，葡萄糖濃度 維持在8.5克/升 10.5克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比維持在1 1.8 1 2.2。 發酵結束時，殘余葡萄糖濃度為3克/升，總葡萄糖糖消耗300克/升，賴氨酸產量為135克 /升，對葡萄糖得率為45%。與葡萄糖、硫酸銨獨立補料的常規發酵方式(通過pH反饋用 蠕動泵自動流加質量濃度為25%的氨水控制發酵液的pH，當殘余葡萄糖濃度在10克/升、 硫酸銨濃度在20克/升時開始流加，定時人工取樣分析，將擬流加的葡萄糖和硫酸銨分10 批加入。總葡萄糖糖消耗302. 5克/升，賴氨酸產量121克/升，對葡萄糖得率為40% )相 比，產量提高了 11%，對葡萄糖得率提高了 1 2.5%。實施例7其它發酵條件同實施例1。其中采用的菌種為沈陽藥科大學的鈍齒棒桿菌D6ch95, 接種量為10%，發酵培養基中初始葡萄糖濃度為80克/升，初始硫酸銨濃度為42克/升， 在發酵過程中，通過調節通氣量和攪拌轉速控制溶解氧在15 20%飽和度之間。開始階 段(第一階段)通過PH反饋用蠕動泵自動流加質量濃度為25%的氨水控制發酵液的pH， PH控制范圍設定為6. 95 7. 05。發酵到12小時，發酵液中殘余葡萄糖濃度降至10克/ 升，停止流加質量濃度為25%的氨水，開始第二階段，向發酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶 液控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為6. 95 7. 05，流加的混合溶液中葡萄糖濃度為500 克/升，氨濃度為36克/升。發酵到21小時，發酵液中硫酸銨濃度降到15克/升，賴氨酸 濃度升至49克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比是1 2. 95，停止流加葡萄糖和氨的混合 溶液，開始第三階段，向發酵液中流加葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液控制發酵液的pH，pH 控制范圍設定為6. 95 7. 05，流加的混合溶液中葡萄糖濃度為500克/升，硫酸銨濃度為 100克/升，氨濃度為45克/升。在67小時停止流加葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，改 為流加質量濃度為25%的氨水控制發酵液的pH，pH控制范圍設定為6. 95 7. 05，直至68 小時結束發酵。在第一階段，pH維持在6. 95 7. 05 ；在第二階段，pH維持在6. 95 7. 05，葡萄 糖濃度維持在8. 5克/升 10. 5克/升；在第三階段，pH維持在6. 95 7. 05，葡萄糖濃度 維持在8.5克/升 10.5克/升，硫酸銨與賴氨酸摩爾濃度比維持在1 2.8 1 3.2。 發酵結束時，殘余葡萄糖濃度為5克/升，總葡萄糖糖消耗290克/升，賴氨酸產量為145克 /升，對葡萄糖得率為50%。與葡萄糖、硫酸銨獨立補料的常規發酵方式(通過pH反饋用 蠕動泵自動流加質量濃度為25%的氨水控制發酵液的pH，當殘余葡萄糖濃度在10克/升、 硫酸銨濃度在15克/升時開始流加，定時人工取樣分析，將擬流加的葡萄糖和硫酸銨分10 批加入。總葡萄糖糖消耗298克/升，賴氨酸產量128克/升，對葡萄糖得率為43 % )相 比，產量提高了 14%，對葡萄糖得率提高了 16.3%。
權利要求
一種基于pH的反饋補料生產賴氨酸的方法，其特征是在賴氨酸好氧發酵進行過程中，利用pH的反饋來控制發酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個值附近波動；所述的控制發酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個值附近波動是(1)按照賴氨酸好氧發酵過程中葡萄糖消耗速率和氨消耗速率之間的比例關系，配制葡萄糖和氨的混合溶液，通過向發酵液中流加該混合溶液來控制發酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個值附近波動；或(2)按照賴氨酸好氧發酵過程中所需的硫酸銨添加速率和氨消耗速率之間的比例關系，配制硫酸銨和氨的混合溶液，通過向發酵液中流加該混合溶液來控制發酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個值附近波動；或(3)按照賴氨酸好氧發酵過程中葡萄糖消耗速率、所需的硫酸銨添加速率和氨消耗速率之間的比例關系，配制葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，通過向發酵液中流加該混合溶液來控制發酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個值附近波動；或(4)將上述(1)、(2)和(3)所述的3種控制發酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個值附近波動的技術方案聯合使用，來控制發酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個值附近波動。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述的向發酵液中流加葡萄糖和氨的混合 溶液來控制發酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動，是當發酵液中葡萄糖的 濃度降低到預先設定點時，通過向發酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液，來控制發酵液的 pH在6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動，從而間接維持了發酵液中葡萄糖的濃度在預 先設定點附近波動。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述的向發酵液中流加硫酸銨和氨的混合 溶液來控制發酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動，是當發酵液中硫酸銨 與產生的賴氨酸的摩爾濃度比降低到預先設定的發酵液中硫酸銨與產生的賴氨酸的摩爾 濃度比的預先設定點時，向發酵液中流加硫酸銨和氨的混合溶液，來控制發酵液的PH在 6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動，從而間接維持了發酵液中硫酸銨與產生的賴氨酸 的摩爾濃度比在預先設定點附近波動。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述的向發酵液中流加葡萄糖、硫酸銨和氨 的混合溶液來控制發酵液的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動，是當發酵液中葡 萄糖的濃度降低到預先設定的發酵液中葡萄糖的濃度的預先設定點，并且，發酵液中硫酸 銨與產生的賴氨酸的摩爾濃度比降低到預先設定的發酵液中硫酸銨與產生的賴氨酸的摩 爾濃度比的預先設定點時，向發酵液中流加葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液，來控制發酵液 的pH在6. 5 7. 5之間的任意一個值附近波動，從而間接維持了發酵液中葡萄糖的濃度在 預先設定點附近波動，并且，發酵液中硫酸銨與產生的賴氨酸的摩爾濃度比在預先設定點 附近波動。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征是所述的葡萄糖和氨的混合溶液中葡萄糖與 氨的質量濃度比為8 1 15 1之間的任意一個值，葡萄糖的濃度為400克/升 600 克/升；所述的發酵液中葡萄糖的濃度降低到預先設定點，其預先設定點為葡萄糖的濃度 為5克/升 20克/升之間的任意一個值。
6.根據權利要求3所述的方法，其特征是所述的硫酸銨和氨的混合溶液中硫酸銨與氨的質量濃度比為2 1 4 1之間的任意一個值，硫酸銨的濃度為100克/升 200克 /升；所述的發酵液中硫酸銨與產生的賴氨酸的摩爾濃度比的預先設定點為1 2 1 4 之間的任意一個值。
7.根據權利要求4所述的方法，其特征是所述的葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液中， 葡萄糖硫酸銨氨的質量濃度比為8 15 2 4 1，葡萄糖的濃度為400克/升 600克/升；所述的發酵液中葡萄糖的濃度的預先設定點為5克/升 20克/升之間的任 意一個值，所述的發酵液中硫酸銨與產生的賴氨酸的摩爾濃度比的預先設定點為1 2 1 4之間的任意一個值。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征是生產賴氨酸的菌種是谷氨酸棒桿菌、黃色短 桿菌、乳糖發酵短桿菌或鈍齒棒桿菌。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征是在賴氨酸好氧發酵開始進行時向發酵液 中所加的流加液是氨水或液氨，通過向發酵液中流加氨水或液氨，來控制發酵液的PH在 6. 5 7. 5之間的任意一個值。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征是在賴氨酸好氧發酵結束前1 2小時，將 流加液改為氨水或液氨，通過向發酵液中流加氨水或液氨，來控制發酵液的PH在6. 5 7. 5 之間的任意一個值附近波動，直到消耗殘余葡萄糖到所需濃度。
全文摘要
本發明涉及發酵法生產賴氨酸，具體涉及基于pH的反饋控制補加碳源和氮源發酵生產賴氨酸的方法。在賴氨酸好氧發酵進行過程中，利用pH的反饋來控制發酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個值附近波動；所述控制包括向發酵液中流加葡萄糖和氨的混合溶液、硫酸銨和氨的混合溶液、或葡萄糖、硫酸銨和氨的混合溶液來控制發酵液的pH在6.5～7.5之間的任意一個值附近波動；從而分別間接維持了發酵液中葡萄糖的濃度在預先設定點附近波動、間接維持了發酵液中硫酸銨與產生的賴氨酸的摩爾濃度比在預先設定點附近波動、間接維持了發酵液中葡萄糖的濃度在預先設定點附近波動，且發酵液中硫酸銨與產生的賴氨酸的摩爾濃度比在預先設定點附近波動。
文檔編號C12P13/08GK101967501SQ20091008987
公開日2011年2月9日 申請日期2009年7月27日 優先權日2009年7月27日
發明者叢威, 劉輝, 張勇, 邢宇 申請人:中國科學院過程工程研究所