專利名稱：一種定向生物合成gamg的方法
技術領域：
本發明涉及單葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的生物合成方法，特別是 在微生物酶的作用下定向催化甘草酸合成GAMG的方法，屬于生物合成與生物 轉化技術領域。
背景技術：
甘草是豆科甘草屬植物，甘草酸是甘草中主要的有效成分之一，具有抗炎 癥、抗病毒、抗腫瘤、抗消化道潰瘍等作用。此外，甘草酸還是重要的天然甜 味劑，甜度約為蔗糖的200倍，且熱量低，因而作為食品添加劑被廣泛應用。
甘草酸(Glycyrrhizin, GL)是中藥甘草的主要有效成分之一。由五環三萜 皂甙通過2糖苷鍵和(3-1， 3糖苷鍵相連接的兩個葡萄糖醛酸組成，其中五環 三萜皂甙是主要的生物活性部分。甘草酸分子經水解去除末端的葡萄糖醛酸基， 轉化為單葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinic acid mono- glucuronide， GAMG)，可有效提高其生物活性和生物利用度。主要表現在第一，GAMG極 性介于甘草酸和甘草次酸之間，在體液中具有較好的溶解度和跨膜轉運的能力， 更容易為機體吸收，藥物作用起效快。第二， GAMG的甜度是甘草酸的5倍多， 是一種高甜度低熱量的功能性甜味劑，可作為天然食品甜味劑廣泛應用于各類 食品基質中。第三，安全性好，動物實驗研究表明，GAMG的LD50為5000mg/kg， 遠遠大于甘草酸的LD50 (805mg/kg)。由于GAMG優點突出，目前，已在國際 上引起較高的重視，被列為重要的精細化工產品。
由于甘草酸分子中的兩個糖苷鍵的鍵能是相似的，傳統的化學水解法對這 兩個糖苷鍵的選擇性很低，將甘草酸水解后可以生成GAMG和甘草次酸兩種物 質，無法將甘草酸定向水解生成GAMG。生物催化法具有高選擇性和反應條件 溫和等優點，可有效地彌補傳統化學改性法所固有的缺點，最大限度地抑制副 反應的發生，較好地控制產品質量。
發明內容
本發明的目的是提供一種定向生物合成單葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG) 的方法，以克服現有GAMG的化學合成選擇性低、催化定向性差且對環境易造成污染的不足。
本發明的目的是通過以下技術方案實現的
本發明的一種定向生物合成GAMG的方法，其具體合成步驟如下
1 )將產紫青霉菌(馮世江等，Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic.2006: 43:63-67)接入種子培養基中，20 45°C， 120 250r/min搖床培養18 45小時， 再將種子液加入到發酵培養基，20 60°C， 100 300r/min發酵72 120小時； 其中種子液與發酵培養基的體積比為1 15:100;
所述的種子培養基為每升培養基含有甘草酸0.01 10g，葡萄糖0.1 5g， NH4NO30.1 10g， KH2PO40.03 3 g， MgS04'7H20 0.015 1.5 g， KC1 0.015 1.5 g， FeSO4'7H2O0,001g，調pH3.0 8.0，種子培養基需在高壓滅菌鍋中110 125。C滅菌10 30min;
所述的發酵培養基為每升培養基含有甘草酸0.01 10 g， NH4NO30.1 10g， KH2PO40.03 3g， MgS04,7H20 0.015 1.5g， KC1 0.015 1.5g， FeS04.7H20 O.OOlg,調pH3.0 8.O，發酵培養基在在高壓滅菌鍋中110 125"C滅菌10 30min;
2) 將發酵后的發酵液加入到轉化液中，25 45r下攪拌l 25小時，用高 效液相色譜(HPLC)測甘草酸含量，當甘草酸量保持1 5小時不變時終止反 應；發酵液與轉化液的體積比為1 50:100;
3) 將上步反應后的轉化液3000-10000r/min離心5-20分鐘，除去菌體，取 上清液進行減壓濃縮，然后用非極性大孔樹脂進行吸附，用濃度為40-80%的乙 醇溶液進行洗脫，洗脫液經減壓濃縮，即可得到GAMG樣品。
所述的轉化液可以是以下任意一種
① 每500 ml濃度為0.05 0.2M pH為3.6 5.8的醋酸鈉緩沖液加入l 50g 甘草酸；
② 每500 ml濃度為0.05 0.2M pH為5.7 8.0的磷酸鈉緩沖液加入l 50g 甘草酸；③每500 ml蒸餾水加入l 50g甘草酸。
本發明所述的GAMG合成方法的有益效果主要體現在(1)用微生物酶做 催化劑，反應效率高，且無污染；(2)步驟簡單，成本低；(3)產物單一，純度咼。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步描述
實例1: GAMG的生物合成
種子培養基每升培養基含有甘草酸5g，葡萄糖3g， NH4N03 3g， KH2P04 lg， MgS04'7H200.5g， KC10.5g， FeS047H20 0.001g， 12rC滅菌20min;
發酵培養每升培養基含有甘草酸5g， NH4—N03 3g， KH2P04 lg， MgS04.7H20 0.5g， KC10.5g， FeS04.7H20 O.OOlg， 12rC滅菌20min;
轉化液甘草酸iOg， 0.05MpH7.0磷酸緩沖液定容500ml。
產紫青霉斜面菌種接入種子培養基，180r/min， 3(TC搖床培養24h。種子液 以體積比為1:10的接種量轉入發酵培養基，28°C， 180r/min搖床培養96小時得 發酵液，發酵液按50%的比例加入轉化液，轉化液中甘草酸濃度為2%，轉化液 的pH為7.5， 3(TC條件下攪拌3小時，反應后轉化液3000r/min 20分鐘，離心 除去菌體，上清液減壓濃縮，然后用NKA大孔樹脂進行吸附，用濃度為70%的 乙醇溶液進行洗脫，洗脫液經減壓濃縮，得到90。/。的GAMG，轉化率達85%。
實例2: GAMG的生物合成
種子培養基甘草酸0.5g，葡萄糖lg， NH4N03 3g， KH2P04 lg， MgS04'7H20 0.5g， KC10.5g， FeS04'7H20 0.001 g，蒸餾水1000mL， 121。C滅菌 20min;
發酵培養基甘草酸0.5g， NH4N033g， KH2P04lg， MgS04'7H20 0.5g， KC10.5g， FeS04'7H20 O.OOlg，蒸餾水1000mL， 121。C滅菌20min;
轉化液甘草酸8g， 0.05MpH7.0磷酸緩沖液定容500ml。產紫青霉斜面菌種接入種子培養基，100r/min， 25'C搖床培養20h。種子液 以體積比為1:10的接種量轉入發酵培養基，25°C， 100r/min搖床培養72小時得 發酵液，發酵液按30%的比例加入轉化液，轉化液中甘草酸濃度為1.6%，轉化 液的pH為4.5, 25'C條件下攪拌6小時，反應后轉化液3000r/min 20分鐘，離 心除去菌體，上清液減壓濃縮，然后用NKA大孔樹脂進行吸附，用濃度為70% 的乙醇溶液進行洗脫，洗脫液經減壓濃縮，得到95。/。的GAMG,轉化率達65%。
實例3: GAMG的生物合成
種子培養基甘草酸8g，葡萄糖5g， NH4N03 3g， KH2P04 lg, MgS04'7H20 0.5g， KC10.5g， FeS04.7H20 O.Olg,蒸餾水lOOOmL 121。C滅菌20min;
發酵培養基甘草酸8g， NH4N03 3g， KH2P04 lg， MgS04'7H20 0.5g， KC10.5g， FeS04-7H20 O.Olg，蒸餾水lOOOmL 121。C滅菌20min;
轉化液甘草酸40g， 0.05MpH7.0磷酸緩沖液定容500ml。
產紫青霉斜面菌種接入種子培養基，300r/min， 40。C搖床培養24h。種子液 以體積比為1:10的接種量轉入發酵培養基，40°C， 150r/min搖床培養96小時得 發酵液，發酵液按50%的比例加入轉化液，轉化液中甘草酸濃度為8%,轉化液 的pH為4.5， 3(TC條件下攪拌3小時，反應后轉化液3000r/min 20分鐘，離心 除去菌體，上清液減壓濃縮，然后用NKA大孔樹脂進行吸附，用濃度為70%的 乙醇溶液進行洗脫，洗脫液經減壓濃縮，得到85。/。的GAMG，轉化率達50%。
實例4: GAMG的生物合成
種子培養基甘草酸3g，葡萄糖2g， NH4N03 3g， KH2P04 0.8g， MgS047H20 0.5g， KC10.5g， FeS04.7H20 O.Olg，蒸餾水lOOOmL 121。C滅菌 20min;
發酵培養基甘草酸3g， NH4N033g， KH2PO40.8g， MgS04'7H20 0.5g， KC10.5g， FeS04'7H20 O.Olg,蒸餾水lOOOmL 121。C滅菌20min;
轉化液甘草酸20g， 0.05MpH7.0磷酸緩沖液定容500ml。
產紫青霉斜面菌種接入種子培養基，250r/min, 4(TC搖床培養20h。種子液 以體積比為1:10的接種量轉入發酵培養基，40°C， 250r/min搖床培養72小時得發酵液，發酵液按30%的比例加入轉化液，轉化液中甘草酸濃度為4%，轉化液 的pH為7.0， 30。C條件下攪拌3小時，反應后轉化液3000r/min 20分鐘，離心 除去菌體，上清液減壓濃縮，然后用NKA大孔樹脂進行吸附，用濃度為70%的 乙醇溶液進行洗脫，洗脫液經減壓濃縮，得到95。/o的GAMG，轉化率達68%。
權利要求
1、一種定向生物合成GAMG的方法，其特征在于具體合成步驟如下1)將產紫青霉菌接入種子培養基中，20～45℃，120～250r/min搖床培養18～45小時；再將種子液加入到發酵培養基，20～60℃，100～300r/min發酵72～120小時；其中種子液與發酵培養基的體積比為1～15∶100；所述的種子培養基為每升培養基含有甘草酸0.01～10g，葡萄糖0.1～5g，NH4NO30.1～10g，KH2PO40.03～3g，MgSO4·7H2O 0.015～1.5g，KCl 0.015～1.5g，FeSO4·7H2O 0.001g，調pH3.0～8.0；種子培養基需在高壓滅菌鍋中110～125℃滅菌10～30min；所述的發酵培養基為每升培養基含有甘草酸0.01～10g，NH4NO30.1～10g，KH2PO40.03～3g，MgSO4·7H2O 0.015～1.5g，KCl 0.015～1.5g，FeSO4·7H2O0.001g，調pH3.0～8.0，發酵培養基需在高壓滅菌鍋中110～125℃滅菌10～30min；2)將發酵后的發酵液加入到轉化液中，25～45℃下攪拌1～25小時，用高效液相色譜(HPLC)測甘草酸含量，當甘草酸量保持1～5小時不變時終止反應；發酵液與轉化液的體積比為1～50∶100；3)將上步反應后的轉化液3000-10000r/min離心5-20分鐘，除去菌體，取上清液進行減壓濃縮，然后用非極性大孔樹脂進行吸附，用濃度為40-80％的乙醇溶液進行洗脫，洗脫液經減壓濃縮，即可得到GAMG樣品；所述的轉化液可以是以下任意一種①每500ml濃度為0.05～0.2M pH為3.6～5.8的醋酸鈉緩沖液加入1～50g甘草酸；②每500ml濃度為0.05～0.2M pH為5.7～8.0的磷酸鈉緩沖液加入1～50g甘草酸；③每500ml蒸餾水加入1～50g甘草酸。
全文摘要
本發明為一種定向生物合成GAMG的方法，屬于生物合成與生物轉化技術領域。本發明的方法是利用產紫青霉菌在發酵培養基中生產相應的β-D-葡萄糖醛酸苷酶，然后將所獲的β-D-葡萄糖醛酸苷酶加入含有甘草酸底物的轉化液中，在酶的作用下定向水解甘草酸，獲得GAMG粗品，再經有機溶劑萃取、樹脂吸附、純化得到GAMG產品。本發明用微生物酶做催化劑，反應效率高，且無污染；步驟簡單，成本低；產物單一，純度高。
文檔編號C12P19/56GK101603067SQ20091008955
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月23日 優先權日2009年7月23日
發明者馮世江, 戴大章, 春 李, 王小艷, 鄒樹平 申請人:北京理工大學