專利名稱：：一種調控巴氏桿菌發育繁殖的方法及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種調控細菌發育繁殖的方法，具體地講是涉及一種調控巴氏桿菌發育繁殖的方法。
背景技術：
：巴氏桿菌(尸astei/n'aspp.)是一類寄生植物寄生線蟲、能夠產生菌絲和內生孢子的細菌，屬于真細菌中的低GC含量格蘭氏陽性菌分支。巴氏桿菌是線蟲的專性寄生物，在線蟲體內完成其生長和繁殖過程，并以芽孢形式釋放回土壤中。內生孢子在土壤中具有極強的抗逆性，在寄主線蟲經過時，其內生孢子附著在線蟲體壁上，隨線蟲發育而萌發并侵入到線蟲假體腔內，吸取它們的營養成分，破壞其組織細胞，最終導致線蟲幼蟲行動遲緩和侵染力減弱，或使雌蟲生育力下降，從而有效地降低線蟲的蟲口密度，起到防治線蟲病害的作用。穿刺巴氏桿菌作為線蟲天敵中的優勢種群，既能有效地控制線蟲的群體數量，又對其它生物無毒、無害，不破壞生態平衡；不污染環境；是生防前景廣闊的線蟲寄生菌。多年來，研究人員在溫室和大田做了大量試驗，發現巴氏桿菌能有效控制多種植物的線蟲病害(Stirling,1984;Brownetal.，1985;Bird&Brisbane,1988;Chenet.al.,1996;ChenandDickson,1997,1998,2004;Kumari&Sivakumar,2005;Pembroke&Gowen,2006;Zareenetal"2002;Waliaetal.，2005;Gogoi&Neog,2005;Darbanetal.,2005)，并且具有顯著的防治效果，能與化學殺線蟲劑及其他線蟲天敵(如淡紫擬青霉、厚壁孢輪枝菌等)混合使用以增強防效(SnghandDhawan,1994;Zakim,1991;Dele，etal.,1992)。此外，巴氏桿菌還能以芽孢形式長期保存。這些都是這類細菌可能發展成為一類新型生防制劑的優勢所在。但該菌一直未能廣泛應用到生產中，其主要原因是體外培養技術尚不成熟，主要依靠活體寄主繁殖，很難大規模生產。要攻克穿刺巴氏桿菌體外培養這一世界性難題，必須首先解決不能隨時獲得發育階段一致的接種體問題。
發明內容本發明通過控制培養溫度，從而抑制巴氏桿菌在寄主線蟲體內的發育，進而達到調控巴氏桿菌(尸s^e"r^印p.)孢子萌發、菌絲體的發育繁殖，并保持菌絲體活性的方法。本發明所提供的調控巴氏桿菌發育繁殖的方法，是將巴氏桿菌在大于等于8°C，小于2(TC的溫度范圍內進行培養。上述方法中，所述培養的溫度范圍為12°C-19°C。上述方法中，所述巴氏桿菌是通過離心將巴氏桿菌的孢子附著在線蟲上并侵染到線蟲體內得到的。所述離心的條件為3000g-9000g離心2-7min，具體可為9000g離心3rain。上述方法中，所述巴氏桿菌是侵染線蟲7-21天后獲得的。本發明方法同樣適用于巴氏桿菌屬其它種菌體的發育調控，如穿刺巴氏桿菌(7^eoris/潔z^r朋W(參考文獻為SAYRERM，STARRMP.Pasteuriapenetrans(exThorne，1940)nom.rev.，combn,sp.n.，amycelialandendospore-formingbacteriumparasiticinplant-parasiticnematodes[J].ProceedingsoftheHelminthologicalSocietyofWashington,1985，52:149-165)、巴氏桿菌尸aWe〃n'af力027ei(參考文獻為STARRMP，SAYRERM.Pasteuriathorneisp.nov.andPasteuriapenetranssensustrictoemend.,mycelialandendospore-formingbacteriaparasitic,respectively,onplant-parasiticnematodesofthegeneraPratylenchusandMeloidogyne[J].AnnInstPasteurMicrobiol，1988，139:11-31)、巴氏桿菌尸asz^wj7.s/is力i^9附e(參考文獻為SAYRERM，WERGINWP，SCHMIDTJM，etal.Pasteurianishizawaesp.nov.，amycelialandendospore—formingbactriumparasiticoncystnematodesofgeneraHeteroderaandGlobodera[J"].ResMicrobiol，1991，142(5):551-564)、巴氏桿菌尸sWe〃r^wssge(參考文獻為GIBLIN-DAVIS體，WILLIAMSDS，BEKALS，etal.'Candidatuspasteuriausgae，sp.nov.，anobligateendoparasiteofthephytoparasiticnematodeBelonolaimuslongicaudatus[J].IntJSystEvolMicrobiol，2003'53(1):197-200)或巴氏桿菌尸a5te〃T7'a力w"，eW(參考文獻為BISHOP,A.H.,G0WEN，S.R.，PEMBROKE,B.，TROTTER,J.R.，MorphologicalandmolecularcharacteristicaofanewspeciesofPasteuriaparasiticonMeloidogyneardenensis.JournalofInvertebratePathology，2007，96，28-33.)。上述巴氏桿菌屬的菌體均是從Pasteuriabioscience公司購得。4所述線蟲為根結線蟲Ofe乃i^^7/7espp.J(殷友琴，楊寶君，王秋麗.根結線蟲病的病原鑒定[J].植物保護學報，1989，(03))或胞囊線蟲(We&2w/eraspp.)(劉維志，劉曄，陳品三.東北地區部分市縣大豆胞囊線蟲生理小種的鑒定結果初報[J].沈陽農業大學學報，1984,(02))。所述根結線蟲(Meloidogynespp.)和胞囊線蟲(Heteroderaspp.)可由中國林業微生物菌種保藏管理中心(CFCC)購得。本發明的調控巴氏桿菌發育繁殖的方法可用于巴氏桿菌的體外培養及巴氏桿菌菌絲體的保存。本發明提供了一種能夠有效調控巴氏桿菌孢子萌發、菌絲體發育繁殖，并保持菌絲體活性的方法。本發明的方法可以應用于控制并保存巴氏桿菌菌絲體活性，為巴氏桿菌的體外培養提供了足夠的、發育狀況一致的接種材料，并且保證了每次接種材料的活性一致，使體外培養巴氏桿菌可以隨時進行。由于本發明方法通過調節溫度控制了巴氏桿菌的發育，克服了體外培養獲得菌絲體困難、繁瑣的問題，從材料方面保證了體外培養的順利開展，既節省了每次準備接種材料的大工作量又有效地解決了活體擴繁接種材料所需空間大的問題。利用本發明的方法可保存巴氏桿菌約30天，經本發明方法保存的巴氏桿菌轉移到正常條件下后，菌絲體的活力沒有改變，當有效積溫達到40(TC后，菌絲體可以發育形成孢子，且不會影響孢子的產量和質量。本發明方法還適用于巴氏桿菌屬其它種的發育調控及保存，也同樣適用于人工培養基中巴氏桿菌菌絲體的發育調控及保存。具體實施例方式實施例l、溫度對穿刺巴氏桿菌發育的調控一、溫度對穿刺巴氏桿菌發育的調控溫度對穿刺巴氏桿菌發育的調控，按以下步驟進行1、供試線蟲及其分離供試線蟲為根結線蟲#WoiA^72eSPp.(中國林業微生物菌種保藏管理中心)。取已感染根結線蟲的番茄植株，將番茄的根用清水洗凈，放置于0.5%次氯酸鈉溶液中30sec，快速搓洗，過篩，沖洗，收集根結線蟲的卵粒于墊有3層濾紙的線蟲分離器中，在室溫下孵化3-4天，得到根結線蟲二齡幼蟲。2、穿刺巴氏桿菌附著根結線蟲將上述步驟(1)培養的根結線蟲與穿刺巴氏桿菌孢子溶液混合，制成孢子一線蟲混合液，混合液中，根結線蟲的濃度為2000J2/ml，穿刺巴氏桿菌孢子的濃度為1.0X104個孢子/ml，將混合液吹打混勻后，平均分裝到6個離心管中，溶液體積小于離心管體積的1/2，9000g離心3min，收集沉淀備用。隨機取樣在400倍顯微鏡下計數每條線蟲體表附著的孢子數，結果表明，附著率為100%，且每條線蟲體表都附著有至少一個穿剌巴氏桿菌的孢子。3、根結線蟲的培養無菌土培育番茄苗，將苗齡為3-4周的番茄苗移入裝有滅菌細沙的杯子中，每杯2株，添加植物營養液，接種上述步驟(2)獲得的表皮已附著巴氏桿菌孢子的根結線蟲二齡幼蟲。25-35。C條件下培養2-5天，保證線蟲已侵入到番茄的根內；取出番茄苗，移栽到裝有無菌土的花盆中，相同條件下繼續培養。4、穿刺巴氏桿菌發育的調控附著在根結線蟲二齡幼蟲體表的孢子萌發并侵入到根結線蟲體內開始發育，侵染2-3周后，將上述步驟(3)的番茄植株轉移到可嚴格控制溫度的光照培養箱中，控制培養箱中的溫度為19°C。培養箱中儲藏物擺放整齊，注意通風、調節濕度和保證充足的光照。5、調控過程中的管理定期對番茄澆水，IO天左右添加一次營養液，保證番茄的根系處于良好的生長狀態。二、評價步驟一調控方法的實施效果以正常條件下培養的侵染了穿刺巴氏桿菌的根結線蟲作為對照，既對照組線蟲的培養條件與步驟一中的步驟1-3相同，然后繼續在25-35X:條件下培養而不進行低溫調控。1、穿刺巴氏桿菌的發育控制將采用上述步驟一的方法調控的穿刺巴氏桿菌于調控30天后檢查菌絲體的發育狀況，顯微鏡下測定各形態菌絲體所占的比例。同時以不進行低溫調控的穿刺巴氏桿菌作為對照。實驗設三次重復，結果表明，采用上述步驟一的方法調控的穿刺巴氏桿菌菌絲體在線蟲體內未發育，各形態菌絲體所占比例與調控前無顯著性差異，具體結果見表i。表l不同溫度條件下穿刺巴氏3仟菌的發育狀態<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、穿刺巴氏桿菌的再發育能力實驗將采用上述步驟一的方法調控的穿刺巴氏桿菌再次轉移至常規培養條件下(即培養溫度為25-35°0培養，當有效積溫達到40(TC時，穿刺巴氏桿菌產生孢子。測定孢子的活性、附著能力和再侵染能力等指標，測定穿刺巴氏桿菌各形態菌絲體所占的比例。同時以不進行低溫調控的穿剌巴氏桿菌作為對照。實驗設三次重復，結果表明，采用上述步驟一的調控方法獲得的穿刺巴氏桿菌與正常條件下培養的穿刺巴氏桿菌的孢子的活性、附著能力和再侵染能力基本保持一致。穿刺巴氏桿菌各形態菌絲體所占的比例如表2所示。表2溫度調控后穿刺巴氏桿菌再發育能力的測定<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>以上結果說明，采用上述步驟一的方法調控后的穿刺巴氏桿再恢復到常規培養溫度下，巴氏桿菌的菌絲體仍然可完成其生活史，形成成熟的孢子。3、穿刺巴氏桿菌的再繁殖能力實驗將采用上述步驟一的方法調控后的穿刺巴氏桿菌再次轉移至常規培養條件下(即培養溫度為25-35°C)培養30天，測定單頭雌蟲的產孢量。同時以不進行低溫調控的穿刺巴氏桿菌作為對照。實驗設三次重復，具體結果見表3。表3溫度調控后穿刺巴氏桿菌發育為成熟孢子的差異<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結果表明，采用上述步驟一的方法調控穿刺巴氏桿菌30天后，再將穿刺巴氏桿菌轉移到正常條件下，該菌可繼續發育形成孢子，其孢子量與對照組無明顯差異。4、穿刺巴氏桿菌的再侵染根結線蟲能力實驗將釆用上述步驟一的方法調控的穿刺巴氏桿菌再次轉移至常規培養條件下(即培養溫度為25-35'C)培養30天，收獲線蟲體內孢子，采用步驟一中穿刺巴氏桿菌附著根結線蟲的方法，測定孢子對根結線蟲的附著率、每條線蟲體表孢子數及最終單頭雌蟲產孢量。同時以不進行低溫調控的穿刺巴氏桿菌作為對照。實驗設三次重復，具體結果見表4。表4溫度調控后穿刺巴氏桿菌孢子再侵染根結線蟲能力的測定<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結果表明，采用上述步驟一的方法調控穿刺巴氏桿菌30天后，再將穿刺巴氏桿菌轉移到正常條件下，該菌可繼續發育形成孢子，其孢子量與對照組無明顯差異，且產生的孢子對根結線蟲的再附著侵染能力不受影響。實施例2、溫度對穿刺巴氏桿菌發育的調控一、溫度對穿刺巴氏桿菌發育的調控溫度對穿刺巴氏桿菌發育的調控，按以下步驟進行1、供試線蟲及其分離供試線蟲為根結線蟲ifeJwVo《j77espp.(中國林業微生物菌種保藏管理中心)。取已感染根結線蟲的番茄植株，將番茄的根用清水洗凈，放置于0.5%次氯酸鈉溶液中30sec，快速搓洗，過篩，沖洗，收集根結線蟲的卵粒于墊有3層濾紙的線蟲分離器中，在室溫下孵化3-4天，得到根結線蟲二齡幼蟲。2、穿刺巴氏桿菌附著根結線蟲將上述步驟(1)培養的根結線蟲與穿刺巴氏桿菌孢子溶液混合，制成孢子一線蟲混合液，混合液中，根結線蟲的濃度為2000J2/ml，穿刺巴氏桿菌孢子的濃度為1.0X104個孢子/ml，將混合液吹打混勻后，平均分裝到6個離心管中，溶液體積小于離心管體積的1/2，9000g離心3min，收集沉淀備用。隨機取樣在400倍顯微鏡下計數每條線蟲體表附著的孢子數，結果表明，附著率為100%，且每條線蟲體表都附著有至少一個穿刺巴氏桿菌的孢子。3、根結線蟲的培養無菌土培育番茄苗，將苗齡為3-4周的番茄苗移入裝有滅菌細沙的杯子中，每杯2株，添加植物營養液，接種上述步驟(2)獲得的表皮已附著巴氏桿菌孢子的根結線蟲二齡幼蟲。25-35。C條件下培養2-5天，保證線蟲已侵入到番茄的根內；取出番茄苗，移栽到裝有無菌土的花盆中，相同條件下繼續培養。4、穿剌巴氏桿菌發育繁殖的調控附著在根結線蟲二齡幼蟲體表的孢子萌發并侵入到根結線蟲體內開始發育，侵染2-3周后，將上述步驟(3)的番茄植株轉移到可嚴格控制溫度的光照培養箱中，控制培養箱中的溫度為10°C。培養箱中儲藏物擺放整齊，注意通風、調節濕度和保證充足的光照。5、調控過程中的管理定期對番茄澆水，10天左右添加一次營養液，保證番茄的根系處于良好的生長狀態。二、評價步驟一調控方法的實施效果以正常條件下培養的侵染了穿刺巴氏桿菌的根結線蟲作為對照，既對照組線蟲的培養條件與步驟一中的步驟1-3相同，然后繼續在25-35"C條件下培養而不進行低溫調控。1、穿刺巴氏桿菌的發育控制將采用上述步驟一的方法調控的穿刺巴氏桿菌于調控30天后檢査菌絲體的發育狀況，顯微鏡下測定各形態菌絲體所占的比例。同時以不進行低溫調控的穿刺巴氏桿菌作為對照。實驗設三次重復，結果表明，采用上述步驟一的方法調控的穿刺巴氏桿菌的菌絲體在線蟲體內未發育，各形態菌絲體所占比例與調控前無顯著性差異，具體結果見表5。表5不同溫度條件下穿刺巴氏^汗菌的發育狀態處理營養菌絲體％分化菌絲體％孢子幼體％孢子°/。調控前實驗組對照組27.62±1.6725.17±1.56038.05±1.2838.83±1.181.12±0.1410.26±0.9211.83±1.074.5±0.5624.02±1.1324.17±1.2794.38±6.322、穿刺巴氏桿菌的再發育能力實驗將采用上述步驟一的方法調控的穿剌巴氏桿菌再次轉移至常規培養條件下(即培養溫度為25-35。C)培養，當有效積溫達到40(TC時，穿刺巴氏桿菌產生孢子。測定孢子的活性、附著能力和再侵染能力等指標，測定穿刺巴氏桿菌各形態菌絲體所占的比例。同時以不進行低溫調控的穿刺巴氏桿菌作為對照。實驗設三次重復，結果表明，采用上述步驟一的調控方法獲得的穿刺巴氏桿菌與正常條件下培養的穿刺巴氏桿菌的孢子的活性、附著能力和再侵染能力基本保持一致。穿刺巴氏桿菌各形態菌絲體所占的比例如表6所示。表6溫度調控后穿刺巴氏桿菌再發育能力的測定<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>以上結果說明，采用上述步驟一的方法調控后的穿剌巴氏桿再恢復到常規培養溫度下，巴氏桿菌的菌絲體仍然可完成其生活史，形成成熟的孢子。3、穿刺巴氏桿菌的再繁殖能力實驗將采用上述步驟一的方法調控后的穿刺巴氏桿菌再次轉移至常規培養條件下(即培養溫度為25-35°C)培養30天，測定單頭雌蟲的產孢量。同時以不進行低溫調控的穿刺巴氏桿菌作為對照。實驗設三次重復，具體結果見表7。表7溫度調控后穿刺巴氏桿菌發育為成熟孢子的差異<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結果表明，采用上述步驟一的方法調控穿刺巴氏桿菌30天后，再將穿刺巴氏桿菌轉移到正常條件下，該菌可繼續發育形成孢子，其孢子量與對照組無明顯差異。4、穿刺巴氏桿菌的再侵染根結線蟲能力實驗將采用上述步驟一的方法調控的穿刺巴氏桿菌再次轉移至常規培養條件下(即培養溫度為25-35°C)培養30天，收獲線蟲體內孢子，采用步驟一中穿刺巴氏桿菌附著根結線蟲的方法，測定孢子對根結線蟲的附著率、每條線蟲體表孢子數及最終單頭雌蟲產孢量。同時以不進行低溫調控的穿刺巴氏桿菌作為對照。實驗設三次重復，具體結果見表8。表8溫度調控后穿刺巴氏桿菌孢子再侵染根結線蟲能力的測定<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結果表明，采用上述步驟一的方法調控穿剌巴氏桿菌30天后，再將穿刺巴氏桿菌轉移到正常條件下，該菌可繼續發育形成孢子，其孢子量與對照組無明顯差異，且產生的孢子對根結線蟲的再附著侵染能力不受影響。實施例3、溫度對巴氏桿菌尸a"ewrj'3//s力^a附e發育的調控一、溫度對巴氏桿菌尸aWewj^a/n'57^'za附e發育的調控溫度對巴氏桿菌尸aWewi^a/2A力h3附e的調控，按以下步驟進行1、供試線蟲及其分離供試線蟲為胞囊線蟲(#efe/w/eraspp.，)(中國林業微生物菌種保藏管理中心)。取已感染胞囊線蟲的大豆植株，體視鏡下挑取大豆根上的胞囊線蟲的新鮮胞囊，選取新鮮、飽滿、成熟的胞囊和卵囊在0.5y。NaOCl溶液中消毒3min，無菌水沖洗3次，然后在25'C于無菌水中孵化，每天及時收集新孵化出的胞囊線蟲。2、巴氏桿菌尸asteuria/is力^3附e附著胞囊線蟲將上述步驟(1)培養的胞囊線蟲與巴氏桿菌/7^力^3附e(Sayre,R.M.Wergin，W.P.Schmidt,J.M.Starr，M.P,/ksfewria/7i6^'za附e印."ok.,amycelialandendospore-formingbacteriumparasiticoncystnematodesofgenera/fe亡erooferaa/7(/67a6oofera[J].ResearchinMicrobiology.1991.142:5，55卜564.)的孢子溶液混合，制成孢子一線蟲混合液，混合液中，胞囊線蟲的濃度為2000J2/ml，巴氏桿菌尸asfewrhm'sA/zarae孢子的濃度為1.0X10"個孢子/ml，將混合液吹打混勻后，平均分裝到6個離心管中，溶液體積小于離心管體積的1/2，9000g離心3min，收集沉淀備用。隨機取樣在400倍顯微鏡下計數每條線蟲體表附著的孢子數，結果表明，附著率為100%，且每條線蟲體表都附著有至少一個巴氏桿菌尸35^eoria/2J'5"力izaFT3e的孢子。3、胞囊線蟲的培養在裝有無菌土的花盆中培育大豆苗，每盆2株，3-4周后接種上述步驟2獲得的表皮己附著巴氏桿菌尸sstewria/7i5^izs附e孢子的胞囊線蟲二齡幼蟲。25-35°C條件下培養2-5天，保證線蟲已侵入到大豆的根內。4、巴氏桿菌尸s5fe〃riaw、力iza紛e發育的調控附著在胞囊線蟲二齡幼蟲體表的孢子萌發并侵入到胞囊線蟲體內開始發育，侵染2-3周后，將上述步驟(3)的大豆植株轉移到可嚴格控制溫度的光照培養箱中，控制培養箱中的溫度為15°C。培養箱中儲藏物擺放整齊，注意通風、調節濕度和保證充足的光照。5、調控過程中的管理定期對大豆澆水，IO天左右添加一次營養液，保證大豆的根系處于良好的生長狀態。二、評價步驟一調控方法的實施效果以正常條件下培養的侵染了巴氏桿菌尸as"wr^/^Az'^3附e的胞囊線蟲作為對照，既對照組線蟲的培養條件與步驟一中的步驟l-3相同，然后繼續在25-35'C條件下培養而不進行低溫調控。1、巴氏桿菌ew^a/7^s力iz3附e發育繁殖的控制將采用上述步驟一的方法調控的巴氏桿菌尸a^ewris/^s力ha附e于調控30天后檢査菌絲體的發育狀況，顯微鏡下測定各形態菌絲體所占的比例。同時以不進行低溫調控的巴氏桿菌,ssfewr2'a/w'Wi^g附e作為對照。實驗設三次重復，結果表明，采用上述步驟一的方法調控的巴氏桿菌尸a"ewn's/^'s力&a附e的菌絲體在線蟲體內未發育，各形態菌絲體所占比例與調控前無顯著性差異，具體結果見表9。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2、巴氏桿菌尸a^ewr^y^5"力^s附e的再發育能力實驗將采用上述步驟一的方法調控的巴氏桿菌/^Wewris"is力&a附e再次轉移至常規培養條件下(即培養溫度為25-35t:)培養，當有效積溫達到400'C時，巴氏桿菌尸s^e"r^/n'Whs附e產生孢子。測定孢子的活性、附著能力和再侵染能力等指標，測定巴氏桿菌尸s^ewria;^s力ha紛e各形態菌絲體所占的比例。同時以不進行低溫調控的巴氏桿菌尸a^e"n's/H's/^z3附e作為對照。實驗設三次重復，結果表明，采用上述步驟一的調控方法獲得的巴氏桿菌尸s^ewr^/7^力"s,e與正常條件下培養的巴氏桿菌尸s^ew^g/7ish'M附e的孢子的活性、附著能力和再侵染能力基本保持一致。巴氏桿菌尸3^ewis/7^s力ha,e各形態菌絲體所占的比例如表IO所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實驗組01.57±0.226.14±0.2892.28±5.71對照組01.11±0.085.5±0,4593.38±6.09以上結果說明，采用上述步驟一的方法調控后的巴氏桿菌尸3W^/2^3"is/&3rae再恢復到常規培養溫度下，巴氏桿菌尸ssteww'3/is力^a附e的菌絲體仍然可完成其生活史，形成成熟的孢子。3、巴氏桿菌/ksz^/r^"A力i^附e的再繁殖能力實驗將采用上述步驟一的方法調控后的巴氏桿菌尸a"e"r/a/7/Wha附e再次轉移至常規培養條件下(即培養溫度為25-35'C)培養30天，測定單頭雌蟲的產孢量。同時以不進行低溫調控的巴氏桿菌尸s"etfn's/w'5^/za附e作為對照。實驗設三次重復，具體結果見表ll。表11溫度調控后巴氏桿菌尸s^e"2^'a/n'W&a附e發育為成熟孢子的差異處理雌蟲長mm雌蟲寬mm孢子量(個/頭)實驗組對照組0.52±0.09mm0.54±0.03mm0.41±0.04mm0.46±0.05mm(1.42±0.09)X105(1.49±0.08)X105結果表明，采用上述步驟一的方法調控巴氏桿菌尸a"ewj^a/^'5力^a附e30天后，再將巴氏桿菌尸a^ewria/n's力hs附e轉移到正常條件下，該菌可繼續發育形成孢子，其孢子量與對照組無明顯差異。4、巴氏桿菌尸s^ewn'a/^sh'za附e的再侵染胞囊線蟲能力實驗將采用上述步驟一的方法調控的巴氏桿菌尸s^e,ia/^s力i^3附e再次轉移至常規培養條件下(即培養溫度為25-35°C)培養30天，收獲線蟲體內孢子，采用步驟一中巴氏桿菌尸3"eww'aw'^J'^3附e附著胞囊線蟲的方法，測定孢子對胞囊線蟲的附著率、每條線蟲體表孢子數及最終單頭雌蟲產孢量。同時以不進行低溫調控的巴氏桿菌尸sWewris"^sh'^9,e作為對照。實驗設三次重復，具體結果見表12。表12溫度調控后巴氏桿菌尸s^ewriawis力izs^e孢子再侵染胞囊線蟲能力的測定處理附著率％線蟲體表孢子數孢子量(個/頭)實驗組對照組1001005.67土0.065.85±0.04(1.49±0.08)X105(1.54±0.07)X105結果表明，采用上述步驟一的調控方法對巴氏桿菌尸a^e"ris/7is力yza,e的發育進行溫度調控30天后，再將巴氏桿菌尸ssfewr/s/7i_sAi^3,e轉移到正常條件下，該菌可繼續發育形成孢子，其孢子量與對照組無明顯差異，且產生的孢子對胞囊線蟲的再附著侵染能力不受影響。通過上述實施例卜3的實驗，結果表明，本發明方法可有效的調控巴氏桿菌的發育狀態，可以用于巴氏桿菌菌絲體活力的保存，為體外培養接種材料的獲得提供便利，可以控制巴氏桿菌菌絲體發育，并保持巴氏桿菌菌絲體活力至少在30天或30天以上，將調控后的巴氏桿菌轉移到正常溫度條件下，該巴氏桿菌可繼續發育形成孢子，其孢子的數量與活力與未經過上述方法處理的巴氏桿菌的孢子無明顯差異。本發明方法也適用于巴氏桿菌屬其它種的巴氏桿菌的發育調控及保存，同樣適用于人工培養基中巴氏桿菌的發育調控及保存。權利要求1、一種調控巴氏桿菌發育繁殖的方法，是將巴氏桿菌在大于等于8℃，小于20℃的溫度范圍內進行培養。2、如權利要求l所述的方法，其特征在于所述培養的溫度范圍為12°C-19°C。3、如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述巴氏桿菌是通過離心將其孢子附著在線蟲上并侵染到線蟲體內得到的。4、如權利要求3所述的方法，其特征在于所述離心的條件為3000g-9000g離心2-7min。5、如權利要求4所述的方法，其特征在于所述離心的條件為9000g離心3rain。6、如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述巴氏桿菌是侵染線蟲7-21天后獲得的。7、如權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于，所述巴氏桿菌為穿刺巴氏桿菌(T^5^eoria/e/7"r朋5",、巴氏桿菌尸a5^ew"'atAor/ei、巴氏桿菌尸a5^e"jria/is//za『3e、巴氏桿菌尸35^ewris〃sage或巴氏桿菌尸a5^ewr/a力ai^i^s7zerY。8、如權利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于所述線蟲為根結線蟲6!/e^az'(3^g777espp.J或胞囊線蟲(v^eiWeraspp.)。9、權利要求1-8中任一所述的方法在巴氏桿菌菌絲體保存中的應用。10、權利要求1-8中任一所述的方法在巴氏桿菌體外培養中的應用。全文摘要本發明公開了一種調控巴氏桿菌發育的方法及應用。該方法是將巴氏桿菌在大于等于8℃，小于20℃的溫度范圍內進行培養。本發明方法通過調節溫度控制了巴氏桿菌的發育，克服了體外培養獲得菌絲體困難、繁瑣的問題，從材料方面保證了體外培養的順利開展，既節省了每次準備接種材料的大工作量又有效地解決了活體擴繁接種材料所需空間大的問題。利用本發明方法可保存巴氏桿菌約30天，經本發明方法調控的巴氏桿菌轉移到正常條件下后，菌絲體的活力沒有改變，當有效積溫達到400℃后，菌絲體可以發育形成孢子，且不會影響孢子的產量和質量。本發明方法還適用于巴氏桿菌屬其它種巴氏桿菌的發育調控及保存，同樣適用于人工培養基中巴氏桿菌的發育調控及保存。文檔編號C12N1/04GK101580811SQ20091008789公開日2009年11月18日申請日期2009年6月25日優先權日2009年6月25日發明者強何,倩劉,卜祥霞,恒簡,陳忠孝申請人:中國農業大學