專利名稱：一種植酸酶及其生產菌株、生產方法
技術領域：
本發明涉及一種植酸酶及其生產菌株、生產方法，具體涉及一種采用無花果曲霉 Aspergillus ficuum生產的植酸酶以及相應的生產方法。
背景技術：
植酸(phytic acid)，即肌醇六磷酸，是植物籽實中磷的主要貯存形式，其中 60% 70%的磷是以植酸鹽的形式存在的。單胃動物消化道中由于缺乏植酸鹽分解酶，必 須在飼料中添加價格昂貴的無機磷酸鹽，不僅提高了飼料成本，而且不能消化吸收的無機 磷隨糞便排出，造成環境污染；此外，植酸鹽能螯合蛋白質、礦物等營養因子，降低了營養因 子的利用率，被認為是抗營養因子。植酸酶(phytase)可以將植物性飼料中的植酸及其鹽 分解為肌醇和磷酸，增加可利用磷的含量，降低植酸對礦物質和蛋白質的螯合，解除植酸的 抗營養作用，增加動物對蛋白質和某些金屬離子的吸收能力。目前，飼料中添加植酸酶的效 果已經在世界范圍內得到了確證。但是目前植酸酶在飼料中的推廣和應用還相當有限，主 要原因在于植酸酶在天然材料中的含量太低，難以大量生產；很多植酸酶產品不能夠耐受 動物胃腸道中低PH值的生理環境而影響其活性；同時，由于植酸酶的熱不穩定性，其在飼 料加工、貯藏、使用過程中活性會降低。
發明內容
因此，本發明的目的是尋找一株性狀優良的植酸酶生產菌株，并通過該菌株的發 酵大量生產植酸酶，得到的植酸酶對動物胃腸道酸性生理環境具有良好的耐受性，可以有 效發揮其酶學功能，同時對飼料加工過程中的熱處理具有良好耐受性。本發明提供了一種植酸酶生產菌株，該菌株的保藏編號為CGMCC No. 2980。該菌株 屬于曲霉屬，命名為無花果曲霉(Aspergillus ficuum)NTG-23，于2009年3月27日保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCCJia 北京市朝陽區大屯路中國 科學院微生物研究所)。本發明還提供了由上述植酸酶生產菌株生產的植酸酶。該植酸酶的最適PH值為 1.3，最適溫度為67V。本發明還提供了一種生產植酸酶的方法，該方法包括采用上述植酸酶生產菌株通 過液體發酵生產植酸酶。具體來說，上述方法包括以下步驟(1)將上述植酸酶生產菌株在馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PD培養基)中培養；(2)收集菌絲體加水后破碎，離心取上清液；(3)上清液經純化得植酸酶。其中，步驟(1)中的培養條件優選為27°C下，150rpm振蕩培養4天。其中，步驟(2)中破碎后在4°C下靜置4小時后再離心。其中，步驟(3)可以包括以下步驟
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(I)DEAE-纖維素(DEAE-Cellulose)陰離子交換柱層析；(2)CM_纖維素(CM-Cellulose)離子交換柱層析。優選地，上述DEAE-Cellulose陰離子交換柱層析采用pH為9. 4的IOmM NH4HCO3 水溶液、300mM NaCl水溶液、IM NaCl水溶液分段洗脫，流速為5ml/3分鐘；優選地，上述 CM-Cellulose離子交換柱層析采用pH為4. O的IOmM NaAc水溶液、O 0. 8M NaCl水溶液 進行線性洗脫，流速為Iml/分鐘。本發明還進一步提供了一種飼料添加劑，該添加劑中包含上述植酸酶。本發明提供的無花果曲霉(Aspergillus ficuum)NTG-23菌株，可以通過微生物發 酵技術大量生產植酸酶，并且該植酸酶對動物胃腸道酸性生理環境具有良好的耐受(最適 PH值為1.3，)，可以有效發揮其酶學功能，同時對飼料加工過程中的熱處理具有良好耐受 (最適溫度為67°C )，是一株性狀優良的植酸酶生產菌株。實驗表明，本發明的植酸酶生產 菌株在37°C、pH 2. 5(50mM Gly-HCl緩沖液)條件下，以植酸鈉為底物，酶活高達48. 5U/mg。本發明提供的植酸酶生產菌株為無花果曲霉(Aspergillus ficuum)NTG-23，于 2009年3月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCCJia 北 京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCC No. 2980。
以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中 圖1為700nm處植酸酶檢測溶液的光吸收值(A 700nm)與無機磷的濃度([P043—]) 關系的標準曲線，其中以KH2PO4為標準品，回歸方程為Y = O. 106X+0. 5624(R2 = 0. 9977)；圖2為無花果曲霉植酸酶DEAE-Cellulose離子交換柱層析洗脫曲線(IOmM pH 9. 4NH4HC03 水溶液)；圖3為無花果曲霉植酸酶CM-Cellulose離子交換柱層析洗脫曲線(IOmM pH 4. ONaAC水溶液)；圖4為無花果曲霉植酸酶最適pH值曲線，從中得到其最適pH值為1.3;圖5為無花果曲霉植酸酶最適溫度值曲線，從中得到其最適溫度為67°C。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。實施例1植酸酶的制備1、實驗材料無花果曲霉(Aspergillusficuum) 二甲雙胍(NTG)突變株 NTG23 ；PD培養基馬鈴薯200克，去皮切成1厘米見方，置于1000毫升水中，煮沸30分 鐘，八層紗布過濾，收集濾液，加葡萄糖20克，補水至1000毫升，pH值自然，分裝后121°C濕 熱滅菌30分鐘。2、技術路線(1)植酸酶活性檢測方法硫酸亞鐵-鉬藍法(Ferrous sulfate-molybdenum blue method ；Huang,2008)。
(2)純化路線通過液體培養獲得無花果曲霉菌絲，經過組織破碎、去離子水抽 提，獲得植酸酶粗提液，利用離子交換柱層析、凝膠過濾層析、SDS-PAGE凝膠電泳等手段，獲 得純化的植酸酶；3、實驗方法(1)植酸酶粗樣品溶液的獲得A. ficuum于PD培養基，27°C下，150rpm振蕩培養4天I8，OOOrpm離心15分鐘，收集菌絲I組織破碎，加4倍量蒸餾水，4 °C下提取4小時I10，OOOrpm離心15分鐘，收集上清液I即為植酸酶粗樣品溶液(2)離子交換柱層析①DEAE-Cellulose陰離子交換柱層析(D3為活性組分)IOmM NH4HCO3 (pH 9.4)水緩沖液平衡 DEAE-Cellulose層析柱(2. 5 X IOcm)，上粗樣品(調pH 9. 4)I用IOmM NH4HCO3 (pH 9. 4)水溶液，+300mM，IM NaCl 水溶液進行分段洗脫，流速5ml/3分鐘I部分收集器收集洗脫液，每管5ml，測定各管洗脫液的A 280nmI測定各分段洗脫部分洗脫液的植酸酶活性合并有植酸酶活性的洗脫液I充分透析，超濾濃縮I得到D3組分(活性組分)②CM-CelIulose離子交換柱層析(D3C2為活性組分)IOmM NaAc (pH4. 0)水緩沖液平衡 CM-Cellulose層析柱(1. OX 15cm)，上樣(D3 組分，pH 4. 0)I以IOmM NaAc (pH4. 0)水溶液洗去不吸附組分后，進行 IOmM NaAc (ρΗ4· 0)水溶液0 0. 8Μ NaCl水溶液線性洗脫，流速Iml/分鐘I
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部分收集器收集洗脫液，每管3ml，測定各管洗脫液的A 280nmI測定各分段洗脫部分洗脫液的植酸酶活性合并具有植酸酶活性的洗脫液I充分透析，超濾濃縮I得到D3C2組分(3)植酸酶檢測方法(硫酸亞鐵-鉬藍法)取酶液50μ 1，加入950μ 15mM植酸鈉 溶液(以50mM、pH 2. 5Gly_HCl緩沖液配制)，37°C水浴反應30分鐘，加Iml 10%三氯乙酸 (TCA)終止反應，再加2ml顯色液顯色5分鐘，測定A700nm光吸收值。顯色液組分1 %鉬 酸銨、3. 2%硫酸亞鐵和7. 2%硫酸。對照組在水浴反應前以TCA終止反應。酶活單位(U) 定義為37°C下每分鐘釋放1 μ mol無機磷所需要的酶量。實施例2棺酸酶件質的表征利用純化的植酸酶，研究其最適溫度、pH值、離子對植酸酶活性的影響、底物多樣 性等酶學性質。(1)植酸酶最適溫度的測定檢測方法硫酸亞鐵-鉬藍法，分別在30 V、40°C、50 V、60°C、70 V、80 V下檢測植 酸酶活性。圖5為無花果曲霉植酸酶最適溫度值曲線，從中得到其最適溫度為67°C。(2)植酸酶最適pH值的測定檢測方法硫酸亞鐵_鉬藍法，分別以不同pH值緩沖液配制植酸鈉溶液，在37°C 下反應并檢測活性。圖4為無花果曲霉植酸酶最適pH值曲線，從中得到其最適pH值為1.3。(3)離子對無花果曲霉植酸酶活性的影響將25 μ 1植酸酶與等體積20mM、10mM、5mM和2. 5mM的不同離子(Ca2+、Mg2+、Zn2+等) 在4°C下孵育2小時，硫酸亞鐵-鉬藍法檢測其活性，以同體積去蒸餾水替代離子作為空白 對照。表1不同濃度離子對植酸酶活性的影響
6 由表1可知，不同濃度離子對植酸酶活性無明顯作用，但1. 25 IOmM的EDTA_2Na 對無花果曲霉植酸酶活性有10%左右的促進作用。(4)底物多樣性研究用50mM、pH 1. 5Gly_HCl緩沖液分別配制5mM不同底物(植酸鈉、三磷酸腺 苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、單磷酸腺苷(AMP)、6_磷酸葡萄糖(G-6-P)、6_磷酸果糖 (F-6-P)、4_硝基苯基磷酸二鈉(pNPP)和β -甘油磷酸鈉)，取50 μ 1酶液，加入950 μ 1相 應底物溶液，37°C水浴反應30分鐘，硫酸亞鐵-鉬藍法測定酶活性，以同體積去蒸餾水替代 底物作為空白對照。無花果曲霉植酸酶底物多樣性結果見表2，無花果曲霉植酸酶對各底物 均有降解活性。表2無花果曲霉植酸酶對各底物的相對活性
(5)無花果曲霉植酸酶回收率、純化倍數見表3，37°C、pH 2. 5 (50mM Gly-HCl緩沖 液)條件下，以植酸鈉為底物，以50g新鮮菌絲體為材料，純化的植酸酶活性為48. 5U/mg。表3無花果曲霉植酸酶回收率、純化倍數
權利要求
一種植酸酶生產菌株，該菌株的保藏編號為CGMCC No.2980。
2.一種由權利要求1所述的植酸酶生產菌株生產的植酸酶。
3.根據權利要求2所述的植酸酶，其特征在于，所述植酸酶的最適pH值為1.3，最適溫 度為67V。
4.一種生產植酸酶的方法，該方法包括采用權利要求1所述的植酸酶生產菌株通過液 體發酵生產植酸酶。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)將權利要求1所述的植酸酶生產菌株在PD培養基中培養；(2)收集菌絲體加水后破碎，離心取上清液；(3)上清液經純化得植酸酶。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的培養條件為27°C下， 150rpm振蕩培養4天。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中破碎后在4°C下靜置4小 時后再離心。
8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)包括以下步驟(1)DEAE-纖維素陰離子交換柱層析；(2)CM-纖維素離子交換柱層析。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述DEAE-纖維素陰離子交換柱層析采 用pH為9. 4的IOmM NH4HCO3水溶液、300mM NaCl水溶液、IM NaCl水溶液分段洗脫，流速 為5ml/3分鐘；所述CM-纖維素離子交換柱層析采用pH為4. 0的IOmM醋酸鈉水溶液、0 0. 8M NaCl水溶液進行線性洗脫，流速為Iml/分鐘。
10.一種飼料添加劑，該飼料添加劑包含權利要求2或3所述的植酸酶。
全文摘要
本發明提供一種植酸酶及其生產菌株、生產方法，該植酸酶是由保藏編號為CGMCC No.2980的植酸酶生產菌株通過液體發酵生產的。本發明提供的植酸酶生產菌株無花果曲霉Aspergillus ficuum NTG-23菌株，可以通過微生物發酵技術而大量生產植酸酶，并且該植酸酶對動物胃腸道酸性生理環境具有良好的耐受(最適pH值為1.3，)，可以有效發揮其酶學功能，同時對飼料加工過程中的熱處理具有良好耐受(最適溫度為67℃)，是一株性狀優良的植酸酶生產菌株。實驗表明，本發明的植酸酶生產菌株在37℃、pH 2.5(50mM Gly-HCl緩沖液)條件下，以植酸鈉為底物，酶活高達48.5U/mg。
文檔編號C12R1/66GK101906387SQ20091008651
公開日2010年12月8日 申請日期2009年6月4日 優先權日2009年6月4日
發明者佟建明, 吳瑩瑩, 張國慶, 張琪, 王志紅, 董曉芳 申請人:中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所