專利名稱：昆蟲病原線蟲共生菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種昆蟲病原線蟲共生菌及其應用，特別涉及一種昆蟲病原線蟲共生 菌及其在生產殺蟲和/或殺卵劑中的應用。
背景技術：
昆蟲病原線蟲共生菌是存在于昆蟲病原線蟲腸道內的一類革蘭氏陰性細菌， 屬腸桿菌禾斗(Enterobacteriaceae) (Hominick WM. Wallingford:CABI Publishing UK, 2002. 266-264)，包括致病桿菌屬(Xenorhabdus)和光桿狀菌屬(Photorhabdus)，其分別與 斯氏線蟲屬(Steinernema)和異小桿線蟲屬(Heterorhabditis)的線蟲共生(Chalabaev S.，Turlin E.，Bay S.，et al. Applied and Environmental Microbiology,2008,74 1717-1725 ；Forst S., Dowds B., Boemare N. , et al. Annual review of microbiogy, 1997,51 47-72.)。在自然界，此類細菌存在于3齡侵染期線蟲的腸道內，隨著線蟲對昆蟲的侵染，共 生菌被攜帶到昆蟲體內并釋放到寄主血腔中，共生菌在昆蟲血腔中大量繁殖，產生毒素，在 48h之內就能殺死寄主昆蟲。此外，共生菌也能分解昆蟲組織，并產生多種抑菌物質，為線蟲 的生長與繁殖提供營養和良好的環境。線蟲經幾代的繁殖，侵染期線蟲攜帶著共生菌從寄 主昆蟲尸體內鉆出，重新尋找新寄主。昆蟲病原線蟲共生菌在離體人工培養時，也能夠產生多種物質。隨著對昆蟲病原 線蟲共生菌研究的不斷深入，這些產物的功能亦不斷被發現(Webster J. Μ. et al.，(2002) Bacterial Metabolites. In :Gaugler, R. (Ed·), Entomopathogenic Nematology. CAB International, Wallingford UK, pp99_lll.)。共生菌產生多種抗生素，對多種動植物及 人類病原菌有廣泛的抑菌活性(楊懷文，張志明，楊秀芬等.中國生物防治，2000，16(3) 111-113 ；楊秀芬，楊懷文，簡恒.大豆科學，2002，24(1) =52-55.) 0共生菌可分泌產生一 些抗腫瘤物質，對人類多種腫瘤細胞有較強的抑制作用，為研制抗癌新藥物提供了新材料 (Jarosz J. Parasitology，1996，112 =545-552 ；呂秋軍，簡恒，劉衛京等·中國新藥雜志， 2002,11 850-852 ；Paik S. , Park S.，et al.，Bull koreanchem. Soc 2001，22 :372_374)。 某些昆蟲病原線蟲共生菌可以產生對昆蟲具有口服殺蟲活性的Tc或Xpt蛋白毒素等 (Bowen D,Rocheleau T. A. ,Blackburn Μ. ,et al. Science, 1998,280 :2129_2132 ；Morgan, J. A. W. ,Sergeant,Μ. ,Ellis,D.,Ousley, M. and Jarrett,P. Appilied and Environmental Microbiology,2001,2062-2069 ；ffench-Constant, R. H. ， Dowling A.and Waterfield N. R. TOXicOn，2007，49，436-451.)，共生菌口服殺蟲毒素的發現為開發生物殺蟲劑提供了 新的途徑。昆蟲病原線蟲共生菌已成為一類新型的具有開發潛力和應用前景的能夠殺蟲防 病的生物資源。所有已發表或公開的文獻指出，昆蟲病原線蟲的共生細菌或共生細菌分泌 的殺蟲蛋白對昆蟲有口服殺蟲活性，但是仍不清楚其殺蟲譜，特別是未發現這類細菌的上 清代謝產物具有殺昆蟲或螨類卵的活性。
發明內容
本發明的目的在于提供一種昆蟲病原線蟲共生菌及其應用。本發明的昆蟲病原線蟲共生菌，為致病桿菌屬Xenorhabdus嗜線蟲致病桿菌 (Xenorhabdus nematophila)HB408。上述嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophila)HB408,已于2009年4月8日保 藏于中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝 陽區大屯路)，保藏號為CGMCC Na . 3004。本發明提供的昆蟲病原線蟲共生菌的應用是嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophila) CGMCC Na . 3004在生產殺蟲和/或殺卵劑中的應用。本發明還提供一種殺蟲和/或殺蟲劑，該殺蟲和/或殺蟲劑的活性成分為嗜線蟲 致病桿菌CGMCC Na . 3004的發酵液和/或嗜線蟲致病桿菌CGMCC Na . 3004的發酵液上清 液和/或嗜線蟲致病桿菌CGMCC Na . 3004菌體和/或嗜線蟲致病桿菌CGMCC Na . 3004的 發酵液上清液的乙酸乙酯萃取物。所述嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發酵液的獲得方法為將嗜線蟲致病桿菌 CGMCC Na . 3004接種于液體培養基中，在28°C 30°C培養36 48小時得到發酵液。所述嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發酵液菌體的獲得方法為嗜線蟲致病桿 菌CGMCC Na . 3004接種于液體培養基中，在28°C 30°C培養36 48小時得到發酵液，然 后將發酵液過濾和/或離心得到濾渣或沉淀部分，即為嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的 發酵液菌體。所述嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發酵液上清液的獲得方法為嗜線蟲致病 桿菌CGMCC Na . 3004接種于液體培養基中，在28°C 30°C培養36 48小時得到發酵液， 然后將發酵液過濾和/或離心得到液體部分，即為嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發酵
液上清液。所述嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發酵液上清液的乙酸乙酯萃取物的獲得 方法為嗜線蟲致病桿菌CGMCC Na . 3004接種于液體培養基中，在28°C 30°C培養36 48 小時得到發酵液，然后將發酵液過濾或者離心收集液體，將液體中加入乙酸乙酯萃取收集 有機相，得到嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發酵液上清液的乙酸乙酯萃取物。所述液體培養基為含牛肉蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉5g/L的培養基。上述殺蟲和/或殺卵劑中還可加入可接受的輔劑如防腐劑、粘著劑、引誘劑、保護 劑和增效劑，配制成水劑、可濕性粉劑、顆粒劑、油劑和濃縮劑等不同的劑型。上述殺蟲和/或殺卵劑是對鱗翅目昆蟲和/或鞘翅目昆蟲和/或直翅目昆蟲和/ 或膜翅目昆蟲和/或螨類的殺蟲和/或殺卵劑。本發明的嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發酵液具有對多種農業害蟲的殺蟲 殺卵作用。利用該菌株的發酵液制備的殺蟲殺卵劑可用于植物表面和生長環境中，防治鱗 翅目、鞘翅目、直翅目、膜翅目和螨類等多種農業害蟲。施用量和施用次數根據所防治害蟲 的發生期、發生數量以及氣候條件等而定。
具體實施例方式下列實例是進一步對本發明的說明，不應當成為對本發明的限制。
下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中，所述百分含量如無特殊說明，均為質量百分含量。
實施例1、嗜線蟲致病桿菌HB408菌株的獲得本發明人自1997年-2006年，利用大蠟螟誘集法從采自河北省不同地區的土樣 中分離出多個昆蟲病原線蟲品系。按下列方法分離初生型的共生細菌用昆蟲病原線蟲感 染大蠟螟5齡幼蟲，蟲體死亡后，用75% (體積百分濃度)酒精浸泡IOmin后，用無菌水沖 洗3遍，并用滅菌濾紙吸干蟲體上的水分。用滅菌鑷子將蟲體的頭和尾夾起，再用滅菌的 剪子剪去一只腹足，將流出的體液直接滴到NBTA鑒別培養基(營養瓊脂45g，氯化三本基 四氮唑0.04g，溴百里酚藍0.025g，水IOOOmL, pH 7. 2-7.4)上，用接種環劃線后，放于28°C 生化培養箱中培養48h 72h時，挑取藍色單菌落為初生型共生菌。應用生物測定的方法 對這些菌株的殺蟲活性行進到了測定，發現其中HB408菌株對小菜蛾、菜粉蝶等多種供試 昆蟲的幼蟲的口服殺蟲活性最強。根據Akhurst (1980) (Akhurst R. J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp. ,bacteria symbiotically associate with the instect pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis[J]. Journal of General Microbiology, 1980,121 303-309)描述的方法結合部分 16s rDNA 序列測定 對HB408菌株進行種類鑒定，確定該菌株為嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophila)。 其中，HB408菌株的生理生化特征如表1所示，16s rDNA序列如序列表中序列1。表1 HB408菌株主要生理生化特征 注+，陽性；-，陰性；U，奶酪色。上述致嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophila)HB408菌株，已于2009年4 月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國 北京市朝陽區大屯路)，保藏號為CGMCC Na . 3004。
5
實施例2、嗜線蟲致病桿菌HB408菌株的口服殺蟲活性及殺蟲譜的測定將嗜線蟲致病桿菌HB408菌種劃線于NBTA培養基(營養瓊脂45g，氯化三本基四 氮唑0. 04g，溴百里酚藍0. 025g，水1000mL，pH 7. 2-7. 4)平板上，在28°C -30°C培養36h 48h，挑取初生型單菌落接入20mL牛肉湯培養基(牛肉蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，水 IOOOmL, pH 7. 2-7. 4，121°C下高壓滅菌 30min)中，置于 28°C -30°C、200rpm/min 恒溫振蕩 培養過夜，得到種子菌液。然后將種子菌液按(體積比1 100)接菌量轉接于200mL 牛肉湯培養基中，繼續振蕩培養48h，得到的HB408發酵菌液，直接用于殺蟲活性的測定。以室內飼養的云斑粉蝶、菜粉蝶、小菜蛾、楊扇舟蛾、黃翅菜葉蜂、蘋掌舟蛾、馬鈴 薯二十八星瓢蟲、東亞飛蝗、枸杞負泥蟲、蓼藍齒脛葉甲和月季葉蜂幼蟲為試蟲，采用浸葉 法進行生測；具體方法為以上述嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004HB408菌液為處理樣品 (樣品中含0. 3%的土溫-80)，設無菌牛肉湯培養基為對照(樣品中含0. 3%的土溫-80)， 取新鮮的寄主植物葉片在HB408發酵上清液或無菌牛肉湯培養基中浸漬10s，自然晾干，放 入無菌的6. 5cmX IOcm塑料養蟲盒內，每盒根據試蟲大小接入5 20頭(具體蟲態如表1 所示)，置于(27士 l)°C、14h光照的生化培養箱中。每個處理設3個重復，每個重復不少于 20頭試蟲。每天檢查死亡蟲數，最后記錄活蟲數并稱量活蟲體重。以棉鈴蟲、甜菜夜蛾、玉米螟、粘蟲、甘藍夜蛾和黃地老虎(具體蟲態如表1所示) 為試蟲，以嗜線蟲致病桿菌HB408發酵液為處理樣品，以無菌牛肉湯培養基為對照。每一處 理設三個重復，每個重復24頭幼蟲。按照ImL IOg的比例將嗜線蟲致病桿菌HB408發酵 液或無菌牛肉湯培養基分別與各試蟲的人工飼料混合作為飼喂食物(棉鈴蟲、甘藍夜蛾、 黃地老虎和芳香木蠹蛾人工飼料配方玉米粉20g，黃豆粉10g，酵母粉9g，山梨酸0. 2g，尼 泊金0. 2g，Vc 0. 6g，復合Vb 3. 14g，蔗糖5g，瓊脂2g，無菌水IOOmL ；甜菜夜蛾人工飼料的 配方玉米粉10g，黃豆粉15g，酵母粉8g，麥麩5g，菜葉粉lg，防微靈0. 6g，干酪素0. 5g，Vc 0. 4g，復合Vb 3. 77g，紅霉素0. 006g,山梨酸0. 3g，尼泊金0. 2g，檸檬酸0. 3g，膽固醇0. Ig, 氯化膽堿0. lg，蔗糖lg，瓊脂2g，水IlOmL;玉米螟人工飼料配方玉米糝19g，酵母粉9g， 大豆糝15g，多維葡萄糖7. 5g，山梨酸0. 5g，瓊脂2g，甲醛0. 2mL，水IlOmL ；粘蟲人工飼料配 方玉米葉粉6g，黃豆粉3. 4g，酵母粉6. Sg,干酪素1. 5g，膽固醇0. 7g，抗壞血酸0. 5g，山 梨酸0. 15g，尼泊金0. 3g，復合Vb3. 93g，蔗糖2. 8g，瓊脂2. 5g，水IOOmL)，混勻后分裝于24 孔培養板內，每孔放一頭供試幼蟲，為防止試蟲逃逸，先覆一層保鮮膜，然后蓋上盒蓋，置于 (26士 1) °C、14h光照的生化培養箱中。每天記錄死亡蟲數，72h或120h時記錄活蟲數并稱 量活蟲體重。按Ig麥麩加150 μ L嗜線蟲致病桿菌ΗΒ408發酵液或無菌牛肉湯培養基，拌勻后 分裝入IOcmX6. 5cm的塑料養蟲盒內，每盒放10頭2齡黃粉蟲幼蟲，每個處理60頭，放入 (26士 1) °C、14h光照的生化培養箱中，每天記錄死亡蟲數，最后稱量活蟲體重。校正死亡率=(處理組死亡率_對照組死亡率)/ (1-對照組死亡率)X 100%。用上述方法對嗜線蟲致病桿菌HB408發酵液的口服殺蟲活性的生測結果如表1所 示。由表2可以看出嗜線蟲致病桿菌HB408發酵液對鱗翅目、鞘翅目和膜翅目中的18種昆 蟲都顯示了一定程度的口服殺蟲活性，但是不同昆蟲對嗜線蟲致病桿菌HB408的敏感性差 異比較大，小菜蛾2齡幼蟲、云斑粉蝶1齡幼蟲、馬鈴薯瓢蟲1齡幼蟲、枸杞負泥蟲2齡幼蟲、 黃翅菜葉蜂2齡幼蟲、月季葉蜂2齡幼蟲對嗜線蟲致病桿菌HB408敏感性強，在飼毒72h時這幾種試蟲的校正死亡率均達到100 %，其次是菜粉蝶1齡幼蟲、葉甲、舟形毛蟲1齡幼蟲和 東亞飛蝗2齡蝗蝻，在飼毒72h時死亡率也達到55. 51% 91. 52%。盡管對芳香木蠹蛾、 甜菜夜蛾、棉鈴蟲、粘蟲、玉米螟、甘藍夜蛾初孵幼蟲、楊扇舟蛾2齡幼蟲和黃地老虎的致死 作用較低(0 39. 24% )，但是對這些幼蟲的生長有較高抑制作用，對活蟲的相對生長抑制 率分別為 15. 21%,93. 87%,97. 24%,52. 75%,85. 43%,68. 52%,72. 60%和 32. 53%;對黃 粉蟲也有一定的活性，處理120h時對其相對生長抑制率達到29. 39%。
表2. HB408菌株對18種昆蟲的口服胃毒活性 實施例3、嗜線蟲致病桿菌HB408的發酵液中的上清液和菌體的殺蟲活性按實施例2中的方法制備嗜線蟲致病桿菌HB408菌液，然后將部分HB408菌液在 10000r/min、4°C條件下離心15min，吸取上清經0. 45 μ m濾膜過濾后得到ΗΒ408菌液上清液 備用。離心后所得沉淀加適量的PBS緩沖液(0. 02mol/L，pH為7. 4)在10000r/min、4°C離 心15min洗滌2次后，所得菌體用PBS緩沖液(0. 02mol/L,pH為7. 4)重新懸浮至與HB408 原菌液同樣的體積的菌體細胞懸液備用。
將甘藍葉片(飼喂小菜蛾幼蟲)或玉米葉片(飼喂東亞飛蝗)分別在供試HB408 菌液、HB408菌液上清液、菌體細胞懸液或無菌水(內含0.3% (質量含量)的土溫80，CK) 中浸漬5s，自然涼干后分別放入養蟲盒內，盒內再放入供試昆蟲，每個處理重復3次，每個 重復20頭幼蟲，放入(26士 1)°C、光照時間為14h的光照培養箱內，每隔24h檢查其死亡情 況，連續檢查3d。結果如表3所示，結果表明HB408菌液、HB408菌液上清液、菌體細胞懸液 對小菜蛾幼蟲和東亞飛蝗均有很高的殺蟲活性。表3嗜線蟲致病桿菌HB408菌液及其不同組分對小菜蛾的殺蟲活性(72h) 實施例4、嗜線蟲致病桿菌HB408菌液殺卵活性測定采用浸漬法檢測嗜線蟲致病桿菌HB408發酵液昆蟲卵或螨類卵的殺卵活性。實驗 所用昆蟲的卵為新產1日齡的小菜蛾卵、菜粉蝶卵、山楂葉螨卵和朱砂葉螨卵，將這些蟲卵 分別在按實施例2中的方法制備嗜線蟲致病桿菌HB408菌液中浸泡5s，取出后室溫條件下 待其自然晾干，然后將其放入經過滅菌且有透氣孔內裝有甘藍葉的養蟲盒(Φ =9cm)中， 置于(25士 1) °C、14h光照培養箱中培養，每個處理進行3次重復(每個重復約30粒卵)。 本實驗同時設滅菌水和無菌牛肉湯培養基對照，所有供試樣品以及滅菌水和無菌牛肉湯培 養基對照中均加入0.3% (質量百分含量)的土溫-80。處理后定期檢查小菜蛾、菜青蟲、 朱砂葉螨和山楂葉螨的孵化蟲數并計算孵化率。結果如表4所示，實驗證明，用嗜線蟲致病桿菌HB408培養的菌液對小菜蛾、菜粉 蝶、朱砂葉螨和山楂葉螨卵有明顯的觸殺作用。120h后(表4)，發現未經過HB408菌液處 理的小菜蛾、菜粉蝶、山楂葉螨和朱砂葉螨卵已經全部孵化，而經過HB408菌液處理的小菜 蛾、菜粉蝶、山楂葉螨和朱砂葉螨、卵還完全沒有孵化，孵化率分別為3. 33%U8. 33%,0% 和0%，由此可見HB408菌液對小菜蛾、菜粉蝶、山楂葉螨和朱砂葉螨卵具有很好的觸殺作 用。表4. HB408發酵液對不同卵的活性測定(120h) 實施例5、嗜線蟲致病桿菌HB408的菌液不同組分的的殺卵活性
將按照實施例3所述方法獲得的嗜線蟲致病桿菌HB408發酵上清液，用0. 45 μ m 濾膜過濾，澄清液用等體積的乙酸乙酯進行萃取，連續萃取3次，然后將有機相合并后減壓 濃縮得到萃取浸膏，用乙酸乙酯溶解后濃度為20mg/mL作為昆蟲的殺卵劑，按照實施例4所 述的方法進行殺卵活性檢測。同時將按照實施例3所述方法獲得的嗜線蟲致病桿菌HB408 發酵液，HB408發酵上清液，HB408菌體懸液，作為殺卵劑，它們原始菌液體積和作為殺卵劑 的體積與上述乙酸乙酯萃取得到的殺卵劑相同，進行同樣的殺卵活性檢測。以無菌水和無 菌牛肉湯培養基為對照。結果表5所示，結果證明，嗜線蟲致病桿菌HB408菌液的上清液用乙酸乙酯萃取 后，所得的萃取物及其各組分處理小菜蛾的卵，在96h后嗜線蟲致病桿菌HB408菌液，上清 液及其上清液的乙酸乙酯提取物使小菜蛾卵不能正常發育，孵化率分別為4. 54%,3. 33% 和0%，和對照有明顯的差異，而經細胞處理96h孵化率為76. 51 %，可見其殺卵作用的物質 主要存在于發酵液的上清液中，對小菜蛾的卵有明顯的抑制生長發育作用。表5. HB408發酵液各組分對小菜蛾卵的活性(96h) 序列表
<160>1
<210>1
<211>432
<212>DNA
<213>嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophila)
<400>1
gccagggggccgccttcgccaccggtattc ctccacatctctacgcatttcaccgctaca60
cgtggaattctacccccctctacgagactc cagccaaccagtcttggatgCCgttCCCgg120
gttaagcccggggatttcacatccaactta attgaccgcctgcgtgcgctttacgcccag180
taattccgattaacgcttgcaccctccgta ttaccgcggctgctggcacggagttagccg240
gtgcttcttctgcgggtaacgtcaatcgta agccctgttcagacttacgccttcctcccc300
gctgaaagtactttacaacccgaaggcctt cttcatacacgcggcatggctgcatcaggc360
ttgcgcccat tgtgcaatat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc 420agtcccagtg ta43權利要求
嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophila)CGMCC №.3004。
2.嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdusnematophila) CGMCC Ns . 3004在生產殺蟲和/或殺 卵劑中的應用。
3.—種殺蟲和/或殺卵劑，其活性成分為嗜線蟲致病桿菌CGMCC N2. 3004的發酵 液和/或嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發酵液上清液和/或嗜線蟲致病桿菌CGMCC Na . 3004菌體和/或嗜線蟲致病桿菌CGMCC Na . 3004的發酵液上清液的乙酸乙酯萃取物。
4.根據權利要求3所述的殺蟲和/或殺卵劑，其特征在于所述嗜線蟲致病桿菌CGMCC Na . 3004的發酵液的獲得方法為將嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004接種于液體培養基中， 在28°C 30°C培養36 48小時得到發酵液。
5.根據權利要求3所述的殺蟲劑，其特征在于所述嗜線蟲致病桿菌CGMCCNo . 3004 的發酵液上清液和菌體的獲得方法為嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004接種于液體培養基 中，在28°C 30°C培養36 48小時得到發酵液，然后將發酵液過濾和/或離心，得到液體 部分即為嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發酵液上清液，得到濾渣或沉淀部分即為嗜線 蟲致病桿菌CGMCC Na . 3004的發酵液菌體。
6.根據權利要求3所述的殺卵劑，其特征在于所述嗜線蟲致病桿菌CGMCCNo . 3004 的發酵液上清液的乙酸乙酯萃取物的獲得方法為嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004接種于 液體培養基中，在28°C 30°C培養36 48小時得到發酵液，然后將發酵液過濾或者離心 收集液體，將液體中加入乙酸乙酯萃取收集有機相，得到嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004 的發酵液上清液的乙酸乙酯萃取物。
7.根據權利要求4-6中任意一項所述的殺蟲和/或殺卵劑，其特征在于所述液體培 養基為含牛肉蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉5g/L的培養基。
全文摘要
本發明公開了一種昆蟲病原線蟲共生菌及其應用。具體該昆蟲病原線蟲共生菌，為嗜線蟲致病桿菌CGMCC №.3004。該菌株的發酵液、發酵液上清液、菌體或其發酵液上清液的乙酸乙酯萃取物具有對多種農業害蟲的殺蟲或殺卵作用。
文檔編號C12N1/20GK101892170SQ20091008428
公開日2010年11月24日 申請日期2009年5月20日 優先權日2009年5月20日
發明者南宮自艷, 孔繁芳, 宋萍, 曹克強, 王勤英 申請人:河北農業大學