專利名稱：一步純化固定化γ-內酰胺酶及拆分(±)γ-內酰胺的方法
技術領域：
本發明屬于酶工程領域，具體說是一種固定化，內酰胺水解酶新技術拆分
(±)2-氮雜雙環-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮(7-內酰胺)。
背景技術：
(-)Y-內酰胺((-)2-氮雜雙環-[2.2.1]-庚垸-5-烯-3-酮)是合成許多生物活性化
合物的重要中間體，可合成阿巴卡韋等抗艾滋病手性藥物。
通過手性化合物拆分來制備光學純手性化合物的方法，歸納起來(l)根 據起始原料分為外消旋體拆分法和不對稱合成法；(2)根據所用手段分為化學 法和生物催化兩種類型。微生物酶法拆分技術由于具有酶促催化反應的特點， 而備受科研工作者的青睞。微生物酶法拆分是利用微生物細胞內所含的酶， 或用細胞中分離出的酶作為催化劑，通過化學酶催化反應拆分外消旋體的方 法。酶拆分的獨特作用是由于它們由L-氨基酸組成。其活性中心構成了一個 不對稱環境有利于識別對映體。因而酶是高度手性的催化劑，具有高度的立 體選擇性。微生物種類及其體內生物催化反應種類繁多，因此微生物酶法拆 分手性化合物的研究具有巨大的發展潛力。
目前，國內外許多科研工作者從事利用生物轉化法拆分(士)Y-內酰胺的研 究，并取得了良好的效果。NakanoHiroto等進行了利用脂肪酶的立體選擇性， 拆分y-內酰胺的外消旋體的研究；Taylor Stephen和Talor Steve通過完整細胞轉
化實驗，利用內酰胺酶對(士)Y-內酰胺進行拆分，并取得良好的效果； Mahmoudian M等提出了一種微生物酶法拆分？內酰胺外消旋體化合物的方 法；Toogood等克隆了嗜熱的Sulfolobussolfataricus菌株中的Y-酰胺酶基因，分
離得到Y-內酰胺酶，該酶熱穩定性強，催化Y-內酰胺水解反應有很高的選擇性。
本發明將帶有硫磺礦硫化葉菌耐熱酰胺水解酶基因的質粒轉入大腸桿 菌，表達了能水解(+)Y-內酰胺，拆分(士)Y-內酰胺的酶。游離酶的空間結構易 受各種因素如物理因素(溫度、壓力、電磁場)、化學因素(氧化、還原、有 機溶劑、金屬離子、離子強度、pH)和生物因素(酶修飾和酶降解)的影響，酶 生物活力有可能喪失。游離酶即使在最適條件下，也會部分失活，隨著反應時間的延長，反應速率會逐漸下降，反應后不能回收，加大了產物提純難度， 增加生產成本。所以，對于現代工業來說，游離酶酶并很不理想。 與游離酶相比，固定化酶具有以下的優點
(1) 固定化酶極易與底物、產物分開；
(2) 可以在較長時間內進行反復分批反應和裝柱連續反應；
(3) 提高酶的穩定性；
(4) 對酶反應過程能夠嚴格控制；
(5) 產物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝；
(6) 酶的使用效率提高，成本降低。
固定化酶，是指在一定空間內呈閉鎖狀態存在的酶，能連續地進行反應， 反應后的酶可以回收重復使用，它將游離酶的催化活動完全或基本上限制在 一定空間范圍內的過程。酶的固定化方法很多，通常按照用于結合的化學反 應的類型進行分類，分別為吸附法、交聯法、共價鍵結合法和包埋法四大 類。對于蛋白一級結構已知的酶，結合蛋白一級結構的特點來采取相應固定 化方法。
金屬鰲合親和層析(Metal Chelate Affinity Chromatography, MCAC)或固定 化金屬離子親和層析(Immobilized Metal Affinity Chromatography,簡稱 IMAC)，是近30年發展起來的一項分離技術。它是利用金屬離子鰲合配體與 蛋白質表面的組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基發生親和 結合作用的原理進行蛋白質分離及純化，其中以咪唑基的結合作用最強。由 于它具有配基簡單、吸附量大、分離條件溫和、通用性強等特點，逐漸成為 分離純化蛋白質等生物工程產品最有效的技術之一。
本發明將酶一步純化固定化于金屬鰲合親和層析介質上，與傳統酶固定 化相比具有以下潛在的優勢
(1) 本發明一步完成酶的純化與固定化過程。傳統酶的純化、固定化過程， 首先經過復雜的蛋白純化過程①硫酸銨分級沉淀法除粗蛋白，②得到的蛋 白進一步透析除鹽，③相對純一點的酶進一步過DEAE-sepharose fast flow及強 陽、陰離子交換柱等等柱子獲得純酶；④然后將純酶固定于載體上。
(2) 蛋白質和金屬離子鰲合載體通過過渡金屬離子形成配位鍵，結合緊密， 在高鹽洗脫液下不被洗脫，只有在競爭性洗脫劑或高鹽ETDA存在下才能被洗脫；并且蛋白質能與金屬離子鰲合載體結合的位點少，在結合過程中不需要 交聯劑，實現酶的定向固定，有效減少酶活的損失。
發明內容
本發明的目的提供一種固定化Y-內酰胺水解酶拆分(士)Y-內酰胺制備(-)Y-內酰胺的技術。
本發明提供一步純化固定化，內酰胺酶及拆分(土)Y-內酰胺的方法，其特征 在于，包括以下步驟
(1) Y-內酰胺水解酶的固定化其特征是將N端與C端均帶組氨酸標記的Y-內酰胺水解酶的基因工程菌或N端與C端僅一端帶組氨酸標記的，內酰胺水解 酶的基因工程菌，用上樣緩沖液懸浮，然后采用超聲破碎，破碎上清液流過
Ni-NTA瓊脂糖或Ni-NTA葡聚糖填料的親和柱，將固定上該酶的親和柱用水保 存，待用。
(2) (±)，內酰胺的拆分其特征是將固定上該酶的親和柱置于30 100。C的 水浴中，在該酶最適pH值5 10下，將2 20g，L"的底物(士)Y-內酰胺連續流過的 親和柱，連續轉化。
與傳統酶的純化、固定化過程相比，本發明簡化了純化過程、降低生產 成本及減少了酶量及酶活損失。
具體實施例方式
(l)蛋白酶的表達將實驗室制備質粒導入感受態細胞內，轉化后細胞接 入3 5mLLB培養基(5g丄—，母粉，10g丄"NaCl， 10g丄"胰蛋白胨，先用去離 子水溶解，再用4.0M'L"NaOH調節PH值7.5)，在250^ 1^11-1， 37。C搖床培養 8 10h得到種子液，然后將2.5mL種子液接到250mLLB培養基中，直到250mL 搖瓶中OD6oo達到0.8左右，加入誘導劑IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)，誘導后 2 3h，將250mL培養基在5000revmin"離心10min，收集到含重組Y-內酰胺水解 酶的濕菌體。
(2)—步純化固定化重組Y-內酰胺水解酶到Ni-螯合柱上先用20mL上樣緩 沖液懸浮由步驟(l)得到的濕菌體，然后用400w的功率超聲波破碎細胞，并 12000revmin"離心破碎液，得到含該酶的破碎上清液。先用20mL上樣緩沖液 平衡Ni-NTA瓊脂糖親和柱，再將破碎上清液倒入該親和柱，上清液利用重力 作用流經該柱，而帶有組氨酸標記的重組Y-內酰胺水解酶會親和結合至親和柱上，然后用沖洗緩沖液(先用去離子水溶解50mM.L"NaH2PO4， 300mM丄"NaCl， 20mM丄"咪唑，再用4.0M丄"HCl調節pH值至8.0)洗掉吸附的雜蛋白，即得到
固定化酶柱。
(3) 柱上拆分(士)Y-內酰胺制備(-)Y-內酰胺先將固定化酶柱連上蠕動泵裝 置，柱體置于水浴中，再把用pH值為6.9 9.0的上樣緩沖液配制的10gl"底物 (士)Y-內酰胺預熱至50 70。C，然后流經柱體，使它與固定化酶進行生物轉化作
用，獲得轉化液，從而拆分(士)，內酰胺制備(-)Y-內酰胺。
(4) 手性HPLC分析產品用lmL乙酸乙酯萃取按步驟(3)獲得的轉化液 lmL，萃取后的乙酸乙酯相作為樣品，利用手性^1^法測定(+)丫-內酰胺和(-:^-內酰胺的含量，計算出e.e值及(-)Y-內酰胺的產率。
手性HPLC法采用DAICELCfflRALPAKAS-H柱(Daicel， Japan),流動 相乙腈:異丙醇-80:20(v/v)，流速O^mL.min-1,檢測波長230nm，進樣 量為20uL。手性HPLC法測得產品的e.e值最高達到99.9y。， (-)Y-內酰胺的產率 最高為46.5%(()-內酰胺理論最高產率為50%)。
實例l
4.332mg酶固定化于親和柱上，柱子于30。C水浴保溫，2g丄"底物以 0.22mL'min"流速過柱轉化，轉化率達到90%， e.e值到達99.02。/(j。 實例2
4.332mg酶固定化于親和柱上，柱子于60。C水浴保溫，20g丄"底物以 0.22mlvmin"流速過柱轉化，轉化率達到88°/。， e.e值達到99.1。/。。 實例3
4.332mg酶固定化于親和柱上，柱子于60。C水浴保溫，5g丄"底物以 0.5mL'min"流速過柱轉化，轉化率達到91%， e.e值達到99。/。。 實例4
4.332mg酶固定化于親和柱上，柱子于60。C水浴保溫，10g丄"底物以 0.22mL'min"流速過柱轉化，轉化率達到89%， e.e值達到99.48。/。。 實例5
4.332mg酶固定化于親和柱上，柱子于80。C水浴保溫，10g丄"底物以 0.22ml/min流速過柱轉化，轉化率達到80%， e.e值達到99.670/。。
權利要求
1、一步純化固定化γ-內酰胺酶及拆分(±)γ-內酰胺的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)γ-內酰胺水解酶的固定化其特征是將N端與C端均帶組氨酸標記的γ-內酰胺水解酶的基因工程菌或N端與C端僅一端帶組氨酸標記的γ-內酰胺水解酶的基因工程菌，用上樣緩沖液懸浮，然后采用超聲破碎，破碎上清液流過Ni-NTA瓊脂糖或Ni-NTA葡聚糖填料的親和柱，將固定上該酶的親和柱用水保存，待用；(2)(±)γ-內酰胺的拆分其特征是將固定上該酶的親和柱置于30～100℃的水浴中，在該酶最適pH值5～10下，將2～20g·L-1的底物(±)γ-內酰胺連續流過的親和柱，連續轉化。
全文摘要
本發明屬于酶工程領域，具體說一步純化固定化γ-內酰胺酶及拆分(±)γ-內酰胺的方法。本發明是將γ-內酰胺水解酶固定在Ni-NTA瓊脂糖親和柱上，并在柱上水解(+)γ-內酰胺，從而拆分(±)γ-內酰胺。將帶有硫磺礦硫化葉菌耐熱γ-內酰胺水解酶基因的質粒轉入大腸桿菌，構建能表達N端與C端均帶組氨酸標記的γ-內酰胺水解酶的基因工程菌或N端與C端僅一端帶組氨酸標記的γ-內酰胺水解酶的基因工程菌。然后將帶組氨酸標記的該酶一步純化固定化在Ni-NTA瓊脂糖親和柱上，并使(±)γ-內酰胺底物在pH值5～10，溫度30～100℃條件下，在柱上連續轉化，轉化率可保持在80％以上，產物的光學純度＞99％。
文檔編號C12N11/04GK101544972SQ200910084258
公開日2009年9月30日 申請日期2009年5月15日 優先權日2009年5月15日
發明者星 張, 曹燕萍, 林建東, 王建軍, 鄭國鈞 申請人:北京化工大學