專利名稱：：一種檢測傳染病病原體的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及分子生物學，特別是涉及檢測傳染病病原體的方法及試劑盒。
背景技術：
：在傳染病流行的初期，準確、快速、便捷地對傳染病的病原體進行;險測，是控制傳染病流行的關鍵。雖然國內和國際上已經建立了傳染病的監測系統，但是現有的檢測手段各有局限性。血清學檢查利用相應的抗體與抗原結合檢測到病原體，此方法診斷快速，簡單、易于操作，但必須制備出針對該病原體的抗體后才能夠進行;險測，尤其是在還沒有抗體來源的情況下不適用于傳染病的早期診斷。病原體分離法是通過直接對病原體進行分離培養，檢測鑒定病原體。此方法靈敏度高、特異性強，但操作復雜、費時(至少要花費一周時間)，對實驗室生物安全條件要求非常高，所以很難在疫情發生現場采用，而且不是所有的病原體都能通過病原體分離法獲得。核酸檢測技術操作簡便，反應快速，尤其是近年來發展的實時熒光定量PCR(RealtimePCR),靈敏度高，且能夠監控整個反應進程，但一直存在DNA污染造成的假陽性率高的問題，而且由于其臨界值不明顯，因此檢測結果灰區較寬，無法標準化，而且由于儀器要求高，投入大，對操作人員要求高，需要進行專業技能培訓，，還限制了多重檢測的應用。同時該方法對于病原體含量極低的樣本仍然無法;險測。NASBA(Nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA，列的擴增技術)是一項連續、等溫、基于酶反應的核酸擴增技術。該技術的反應體系包括反轉錄酶、核糖核酸酶H、噬菌體T7核糖核酸聚合酶和兩條特別設計的寡核苷酸引物，其上游引物3'末端與模板的3'末端互補，5，末端含有噬菌體T7的依賴于DNA的RNA聚合酶的啟動子序列，下游引物3'末端序列與模板的5'末端序列一致，5，末端含有與捕獲探針互補的序列。在擴增起始階段，上游引物與正義RNA模板結合后，在反轉錄酶的作用下合成與耙標RNA互補的反義cDNA，而原來的的RNA模板則被RnaseH降解。接著下游引物與cDNA雜交，在反轉錄酶的DNA聚合酶特性的作用下合成雙鏈cDNA，即對應耙標RNA的雙鏈cDNA拷貝。由于雙鏈cDNA—端包含有T7RNApolymerase的啟動子序列，從而誘導了RNA聚合酶的活性，合成大量的與耙標序列互補的反義RNA鏈。如此循環反復，RNA拷貝數被不斷放大。同時由于雙鏈cDNA的另一末端還整合了與捕獲探針互補的序列，因此所產生的互補RNA又能特異的結合捕獲探針，以用于下一步的檢測。酶連接寡核苷酸捕獲技術原理是NASBA擴增產物首先特異性地與捕獲探針一端結合，后者的另一端能固定連接在微孔板上，然后加入病原體特異性檢測探針及反應底物，檢測產生的比色信號，這一檢測讀數與RNA的擴增產物量成正比，以此來檢測NASBA擴增產物總量，判斷病毒模板的感染情況。此方法操作簡單，特異性強，適用于大量樣品的快速檢測。肺炎衣原體、流感嗜血桿菌、.肺炎支原體、肺炎鏈球菌和嗜肺軍團桿菌引起的呼吸道傳染病均表現為發熱、咳嗽等流感癥狀明顯，胸透顯示肺炎癥狀明顯，主要經呼吸道傳播，鼻咽分泌物含病原體多，這些病原體致病性高并且難以區分，極易延誤診斷和治療的最佳時機。目前尚未見報道同時能檢測及鑒別上述五種傳染病病原體的檢測方法，也沒有相應的臨床檢測試劑盒上市。
發明內容本發明目的是克服現有技術不能同時檢測多種傳染病病原體的缺陷，提供一種對可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進行;險測的方法，包括(i)擴增生物樣品的核酸片段，所述核酸片段為以下的一種或一種以上的組合肺炎衣原體的外膜蛋白A基因的如SEQIDNO.l所示的核酸片段；流感嗜血桿菌外膜蛋白P6基因的如SEQIDNO.2所示的核酸片段；肺炎支原體粘附蛋白Pl基因的如SEQIDNO.3所示的核酸片段；肺炎鏈球菌溶血素基因的如SEQIDNO.4所示的核酸片段；嗜肺軍團桿菌的巨噬細胞感染增強蛋白基因的如SEQIDNO.5所示的核酸片段；(ii)用探針進行檢測，所述探針與步驟(i)擴增產物中的一種特異性雜交。本發明的一個優選實施方案是所述步驟(i)利用NASBA技術擴增樣品的核S交片I殳。NASBA優選的運行條件為41。C45。C溫育90150分鐘。本發明步驟(ii)中優選的是所述纟笨針與步驟(i)所得擴增產物的雜交在固體支持物上進行。可以固定探針和核酸片,殳的一種或多種，例如，固定在反應板上。術語"固體支持物"是指保持其雜交特性前提下寡核苷酸探針可以偶聯的固體底物，通常，固體底物是尼龍末、纖維素膜、微珠、芯片或反應板。在固定之前，可以修飾探針，以促進固定或提高雜交效率。這樣的修飾包括同聚物加尾，與順2基團或生物素、半抗原偶聯。或者，探針和核酸片段都是不固定的，雜交可以在液體介質中進行，其檢測可以用流式細胞術進行。本發明還提供步驟(i)使用的引物，其核苷酸序列如下所示第1組引物用于擴增如SEQIDNO.l所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；第2組引物用于擴增如SEQIDN0.2所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；第3組引物用于擴增如SEQIDN0.3所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.13所示；第4組引物用于擴增如SEQIDNO.4所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.15所示，下游引物核香酸序列如SEQIDNO.16所示；第5組引物用于擴增如SEQIDN0.5所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.18所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDN0.19所示。上述第1組至第5組引物分別對應片企測肺炎衣原體、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎鏈球菌、嗜肺軍團桿菌。在實際應用中，還有一種可能是使用上述引物組別中的任意一種或一種以上的組合，來擴增并檢測肺炎衣原體、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎鏈球菌和嗜肺軍團桿菌中的某一種或幾種，如使用第l組和第4組的序列進行肺炎衣原體和肺炎鏈球菌的檢測等。本發明還提供所述步驟(ii)使用的捕獲探針，其核苷酸序列如SEQIDNO.21所示，其直接或間接的連接在固體支持物上，且與步驟(i)所得擴增產物雜交。本發明還提供步驟(ii)中使用的檢測探針序列1如SEQIDNO.8所示，檢測如SEQIDNO.l所示的核酸片段；序列2如SEQIDNO.ll所示，才全測如SEQIDNO.2所示的核酸片H序列3如SEQIDNO.14所示，檢測如SEQIDNO.3所示的核酸片段；序列4如SEQIDN0.17所示，檢測如SEQIDNO.4所示的核酸片段；序列5如SEQIDNO.20所示，檢測如SEQIDNO.5所示的核酸片段。上述序列15分別對應檢測擴增后的肺炎衣原體、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎鏈球菌、嗜肺軍團桿菌。檢測探針可用多種生物方法進行檢測。優選地，所述檢測探針由生物素或地高辛標記，加入底物，經過終止反應步驟后經分光光度計讀取吸光度值進行結果判定。本發明優選地實施方案是由多個反應管在同一時間進行步驟(ii)所述檢測步驟，每個反應管使用的檢測探針為序列1至序列5中的一種且與步驟(i)所使用的引物對應共同檢測某一種病原體的存在。上述方法的吸光度結果處理可以采取如下方案測試K個陰性對照樣品，取其吸光度值，按以下公式確定臨界值m+KxSD，m為陰性對照吸光度算術平均值，SD為陰性對照吸光度標準偏差，K依據不同實驗條件而定，如檢測的群體數或樣本數。檢測讀數大于臨界值則判定為檢測結果"陽性"；檢測讀數小于臨界值則判定為檢測結果"陰性"。本發明的術語"引物"指作為合成引物延伸產物的起始位點的單鏈寡核苷酸序列，其與待復制的核酸鏈互補，長度和序列必須適合于延伸產物的合成。本發明術語"探針"指單鏈寡核苷酸，用于與核酸片段特異性雜交。"特異性雜交"指所述探針與核酸的整個區域或一部分在特定的實驗條件下形成雙鏈體，且在這些條件下，所述探針不與待檢測樣品中存在的其他核酸或核酸的其他區域形成雙鏈體。探針和核酸片段雜交后，可以通過任意合適的方式，進行雜交的檢測，例如可以檢測的標記探針和/或核酸片段，為了輔助檢測，優選耙核酸片段進行NASBA擴增或PCR擴增。本發明還提供一種對可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進行檢測的試劑盒，其包含用于擴增肺炎衣原體的外膜蛋白A基因如SEQIDNO.l所示核酸片段的的引物、用于擴增流感嗜血桿菌外膜蛋白P6基因如SEQIDNO.2所示核酸片段的引物、用于擴增肺炎支原體粘附蛋白Pl基因如SEQIDN0.3所示核酸片段的引物、用于擴增肺炎鏈球菌溶血素基因如SEQIDNO.4所示核酸片段的引物和用于擴增嗜肺軍團桿菌的巨噬細胞感染增強蛋白基因如SEQIDNO.5所示核酸片段的引物中的一組或一組以上的組合。優選地，本發明所述試劑盒的引物選自以下5組引物第l組引物用于擴增如SEQIDNO.l所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；第2組引物用于擴增如SEQIDN0.2所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；第3組引物用于擴增如SEQIDNO.3所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.13所示；第4組引物用于擴增如SEQIDN0.4所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.15所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.16所示；第5組引物用于擴增如SEQIDN0.5所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.18所示，下游引物核苷^列如SEQIDNO.19所示。優選地，本發明所述試劑盒還包含如核苷酸序列SEQIDNO.21所示的捕獲探針。更優選地，本發明所述試劑盒還包含以下至少一種與引物對應的檢測探針序列1如SEQIDNO.8所示，檢測如SEQIDNO.l所示的核酸片段；序列2如SEQIDNO.U所示，檢測如SEQIDN0.2所示的核酸片段；序列3如SEQIDNO.14所示，檢測如SEQIDNO.3所示的核酸片段；序列4如SEQIDN0.17所示，檢測如SEQIDNO.4所示的核酸片段；序列5如SEQIDNO.20所示，檢測如SEQIDNO.5所示的核酸片段。本發明所述試劑盒還可以包含一種或多種下述組分雜交緩沖液或制備所述雜交緩沖液的說明書；洗滌溶液或制備所述洗滌溶液的說明書；檢測形成的雜交體的組分；用于將纟笨針附著到固體支持物上的組分。本發明所述對可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進行檢測的方法，對比現有技術的優點在于(1)檢測速度快，效率高，可根據需要，隨機兩重、三重或多重組合同時檢測多種致病病原體，也可檢測單個病原體；(2)靈敏度高，NASBA可檢測到病毒的最小濃度為IO"1pM，高于經典的病原分離法的敏感性；(3)特異性強，由于外來雙鏈DNA無T7啟動子序列，不能被擴增，這就顯著提高了NASBA反應的特異性；由于擴增過程中的引物和檢測過程中的探針雙重作用，再次保證了病原體檢測的特異性，而且NASBA的反應條件溫和，且比PCR反應需要的時間短，因此轉錄更加忠實于模板，進一步減少了錯配率；(4)操作簡單，結果穩定，整個檢測過程只需要酶標儀這種常規的儀器；(5)適用于早期診斷，適用于不明原因發熱引起的重大傳染疾病的早期快速^r測、多種病原體的隨機組合檢測以及大量樣品的檢驗。(6)適用范圍廣，取樣簡單。樣品中DNA、肝素、EDTA、檸檬酸鹽、血紅蛋白、白蛋白和脂質等的污染將不會對結果造成影響，因而適用于各種待檢樣品如咽喉拭子、糞便、血液等。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，本領域的技術人員可以對其進行各種改造和修改，這些等價形式同樣落入本發明的保護范圍。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1設計和制備引物、探針序列。根據NCBI搜索選取肺炎衣原體、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎鏈球、嗜肺軍團桿菌的特異性基因序列，它們分別是肺炎衣原體的外膜蛋白A基因序列，GENEBANK登錄號為AY555078,選取序列高度保守部分作為靶核酸序列，本發明選取的靶序列是外膜蛋白A基因660-893,其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示；流感嗜血桿菌外膜蛋白P6基因序列，GENEBANK登錄號為M19391,本發明選取的耙核酸序列為外膜蛋白P6基因的173-372,其核苷酸序列如SEQIDN0.2所示；肺炎支原體粘附蛋白Pl基因序列，GENEBANK登錄號為M21519，本發明選取的靶核^列是核衣殼蛋白基因的3667-3780,其核苷S臾序列如SEQIDNO.3所示；肺炎鏈^求菌溶血素基因序列，GENEBANK登錄號為M17717,本發明選耳又的把核酸序列是核衣殼蛋白基因的464-623，其核香酸序列如SEQIDN0.4所示；嗜肺軍團桿菌的巨噬細胞感染增強蛋白基因序列，GENEBANK登錄號為AF095230,本發明選取的靶核酸序列是巨噬細胞感染增強蛋白基因基因的406-563,其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；分析上述病毒特異性基因的信息，經序列分析軟件DNAman進行引物間/內二聚體的排除，并經BLAST驗證引物的特異性和與相近病原體的同源性，設計出針對上述病原體4全測的NASBA引物和探針。捕獲探針的核苷酸序列如SEQIDNO.21所示；引物及對應的4企測4笨針如下所示第1組用于擴增肺炎衣原體的外膜蛋白A基因如SEQIDNO.l所示的核酸片^:的上游引物核苷酉踏列如SEQIDNO.6所示、下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.7所示、檢測探針如SEQIDNO.8所示；第2組用于擴增流感嗜血桿菌外膜蛋白P6基因如SEQIDNO.2所示的核酸片段的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.9所示、下游引物核苷臥l/f列如SEQIDNO.10所示、檢測探針如SEQIDNO.11所示；第3組用于擴增肺炎支原體粘附蛋白PI基因如SEQIDNO.3所示的核酸片段的上游引物核苷酸序列如SEQIDN0.12所示、下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.13所示、檢測探針如SEQIDNO.14所示；第4組用于擴增肺炎鏈球菌溶血素基因如SEQIDN0.4所示的核酸片，敬的上游引物核香酸序列如SEQIDNO.15所示、下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.16所示、檢測探針如SEQIDNO.17所示；第5組用于擴增嗜肺軍團桿菌的巨噬細胞感染增強蛋白基因如SEQIDNO.5所示的核酸片l殳的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.18所示、下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.19所示、檢測探針如SEQIDNO.20所示。實施例2制備本發明所述試劑盒。組成為1、擴增體系引物(5組)每組10uMTris/HCl10-100mM氯化鉀1-10mMBSA1-5g/ml二碌^蘇糖醇1-5mM三磷酸核苦與脫氧三磷酸核苷等濃度混合物200-1000uM反轉錄酶5-300U核糖核酸酶HRNaseH5-300U噬菌體T7核糖核酸聚合酶5-300U陰性對照為無RNA酶水陽性對照是5pM人工合成的禽流感病毒H5亞型HA基因序列、禽流感病毒H7亞型HA基因、SARS冠狀病毒的核衣殼蛋白基因、漢坦病毒核衣殼蛋白基因序列、耶氏鼠疫菌pPCPl基因序列、炭疽桿菌假定蛋白基因序列。2、4企測體系檢測探針(5組，均由地高辛標記)26(aM捕獲探針(生物素標記)26pM清洗緩沖液lxTBS雜交緩沖液10mg/mlBSA,50mMTris-HCl(pH7.5)牙企測緩沖液lxTBS:1.4MNaCl，30mMKCl，260mM;險測濃縮液石威性磷酸酶標記的抗地高辛的抗體終止液3MNaOH底物10mM對硝基苯磷酸鹽纟容液陰性對照為無RNA酶水；陽性對照是5pM人工合成的肺炎衣原體的外膜蛋白A基因序列、流感嗜血桿菌外膜蛋白P6基因序列、肺炎支原體粘附蛋白Pl基因序列、肺炎鏈球菌溶血素基因序列、嗜肺軍團桿菌的巨噬細胞感染增強蛋白基因序列。實施例3:對可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進行^r測的方法，同時也是本發明所述試劑盒的使用方法。1、核酸提取取待測痰液樣品，離心取上清，加入1ml異硫氰酸胍，混勻后再加入1mlTRIZOL,振蕩混勻，冰浴中放置5分鐘.加入350ul氯仿，充分振蕩混勻，靜止分層后，立即于4。C,12000r/min離心20分鐘.將上清轉移至另一離心管，加等體積的異丙醇(4。C預冷)混勻.-20。C放置lh,4。C,12000r/分鐘離心20分鐘，沉淀即總RNA.加入0.5ml75%乙醇洗滌，4°C，12000r/分鐘離心10分鐘，小心倒掉乙醇，室溫放置10分鐘，加適量DEPC處理過的水溶解沉淀，即得到待測核酸樣品，-80"保存備用。2、NASBA擴增反應在0.5ml無RNA酶的滅菌離心管中配制如下所示的20plNASBA擴增反應體系，在41°C溫育90分鐘，核酸擴增產物用于后續檢測。NASBA擴增反應體系(20^1)的終濃度具體為:待測核酸樣品200jaM引物lpMAMV10URNaseH10UT7RNA聚合酶10UTris/HC110mM氯化鉀1mMBSA100mg/ml二硫蘇糖醇1mM三磷酸核苷與脫氧三磷酸核苷等濃度混合物200uM3、NASBA擴增產物4企測取步驟2所得5nlNASBA產物，加1pl檢測探針溶液(每孔各加一種)和1jil捕獲探針溶液，和43pi雜交緩沖液混勻后加入包被了抗生物素蛋白鏈菌素的微孔板(購自Thermofisherscientific)每個獨立的孔中，在45。C溫育l小時，以250^1lxTBS，pH7.4清洗小孔三次。每次傾去溶液后要拍干微孔板，每孔力。lOO[il檢測緩沖液與檢測濃縮液的混合物(按檢測濃縮液檢測緩沖液=1:500稀釋)，檢測濃縮液購自Sigma,P/NN7653,在室溫下溫育30分鐘，以250pllxTBS，pH7.4清洗小孔三次，每次傾去溶液后要拍干微孔板，微孔加100pl底物，避光室溫溫育5分鐘，lOOjjl終止液并輕輕搖動來終止顯色反應，將纟鼓孔板和纟鼓孔板板框放入標準96孔微孔板分光光度計并讀取405nm吸光度。100pl底物加100pl終止液作為背景參照。4、檢測結果分析上述吸光度結果處理采取如下方案測試8個陰性對照樣品測定其吸光度值，按以下公式確定臨界值m+8xSD,m為陰性對照吸光度算術平均值，SD為陰性對照吸光度標準偏差。臨界值為0.15+0.035x8=0.43。才企測讀數大于臨界值則判定為"陽性"；檢測讀數小于臨界值則判定為"陰性"。實施例4:對可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進行4全測的方法，同時也是本發明所述試劑盒的使用方法。1、核酸提取取待測血液樣品，取新鮮全血2ml力卩1ml3%檸檬酸鈉，混勾后4。C,3000r/分鐘離心，10分鐘，取上清，加入lml異疏氰酸胍，混勻后再加入1mlTRIZOL，振蕩混勻，冰浴中放置5分鐘.加入350ul氯仿，充分振蕩混勻，靜止分層后，立即于4。C,12000r/分鐘離心20分鐘.將上清轉移至另一離心管，加等體積的異丙醇(4。C預冷)混勻.-20"》文置1h,4。C，12000r/min離心20分鐘，沉淀即總RNA.力口入0.5ml75%乙醇洗滌，4°C，12000r/min離心10分鐘，小心倒掉乙醇，室溫放置10分鐘，加適量DEPC處理過的水溶解沉淀，即得到待測核酸樣品，-80匸保存備用。2、NASBA擴增在0.5ml無RNA酶的滅菌離心管中配制如下所示的20plNASBA擴增反應體系，在41°C溫育90分鐘，核酸擴增產物用于后續才企測。NASBA擴增反應體系的終濃度具體為待測核酸樣品600uM引物2uMAMV150U腦aseH150UT7RNA聚合酶150UTris/HCl10mM氯化鉀ImMBSA200mg/ml二》克蘇糖醇3mM三磷酸核苷與脫氧三磷酸核苷等濃度混合物600uM3、NASBA擴增產物4企測取步驟2所得5nlNASBA產物，力。1|ji檢測探針溶液(每孔各加一種)和1(al捕獲探針溶液，和43^雜交緩沖液混勻并加入包被了抗生物素蛋白鏈菌素的微孔板(購自Thermofisherscientific公司)每個獨立的孔中，在45。C溫育1小時，以250lxTBS,pH7.4清洗小孔三次。每次傾去溶液后要拍干微孔板，每孔加100^1檢測緩沖液和檢測緩沖液的混合物(按檢測濃縮液檢測緩沖液=1:500配置)，在室溫下溫育30分鐘，以250pilxTBS，pH7.4清洗小孔三次，每次傾去溶液后要拍干微孔板，微孔加lOOpl10mMTris/HC1，避光室溫溫育5分鐘，力口lOOpl終止液并輕輕搖動來終止顯色反應，將微孔板和微孔板板框放入標準96孔微孔板分光光度計并讀取405nm吸光度，使用100|il10mMTris/HCl力。lOOpl終止液作為背景參照。當檢測待測樣品中是否含有某3種病原體時，只需在配制擴增體系時，分別在3個反應管加入該3種病原體對應的引物，檢測時加入該3種病原體對應的探針溶液，其他步驟同。4、；險測結果分析測定10個已知的陰性樣品的吸光度，臨界值是m(陰性對照吸光度算術平均值)+lOxSD(陰性對照吸光度標準偏差)，臨界值通常為0.15+0.03x10=0.45。檢測讀數大于臨界值則判定為檢測結果"陽性"；檢測讀數小于臨界值則判定為檢測結果"陰性"。實施例5:檢測嗜肺軍團桿菌的靈敏度實驗1、核酸擴增取lml嗜肺軍團桿菌標準品加入lml異硫氰酸胍，混勻后再加入lmlTRIZOL，4展蕩混勻，水浴中》文置5分鐘.加入350ul氯仿，充分振蕩混勻，靜止分層后，立即于4°C,12000r/min離心20分鐘.將上清轉移至另一離心管，加等體積的異丙醇(4。C預冷)混勻.-20。C^:置lh，4。C,12000r/min離心20分鐘，沉淀即總RNA.加入0.5ml75%乙醇洗滌，4°C，12000r/min離心10分鐘，小心倒掉乙醇，室溫放置10分鐘，加適量DEPC處理過的水溶解沉淀，即得到待測核酸樣品，測定其濃度。在0.5ml無RNA酶的滅菌離心管中分別標記，配制如下所示的20|ilNASBA擴增反應體系，并同時設置兩個陰性對照，嗜肺軍團桿菌RNA配制為l(T9pm、10-'。pm、10"'pm、l(r12pm的終濃度，每種濃度設置復管，以無RNA酶水作為陰性對照，4rC水浴95分鐘。核酸擴增產物用于后續才全測。NASBA擴增反應體系(20^1)的終濃度具體為嗜肺軍團桿菌RNA引物(第5組)lpMAMV10U腦aseH10UT7認A聚合酶10UTris/HCl10mM氯化鉀1mMBSAlOOmg/ml二碌u蘇壽唐醇1mM三磷酸核香與脫氧三磷酸核苷等濃度混合物200uM核苷酸序列如SEQIDNO,5所示，與嗜肺軍團桿菌的巨噬細胞感染增強蛋白基因406-563段一致。2、核酸;險測1)在支持板框上安放一個微孔板板條，該微孔板包被了抗生物素蛋白鏈菌素(購自Thermofisherscientific公司)。2)每個微孔中依次加入43pl雜交緩沖液、力。1pi檢測探針溶液(第5組)和lpl捕獲探針溶液，5gl擴增產物，輕敲支持板以混合溶液(注意避免產生氣泡)。3)牢牢蓋上封口膜避免蒸發，45。C水浴60分鐘。4)傾去溶液后，以250jLi1lxTBS，pH7.4清洗小孔五次，且每次清洗30s，傾去溶液后拍千微孔板。5)每孔加100^U檢測緩沖液和檢測濃縮液的混合物(按檢測濃縮液緩沖液=1:500配置)，牢牢蓋上封口膜避免蒸發。6)在室溫下溫育30分鐘。7)傾去溶液后，以250^1lxTBS，pH7.4清洗小孔五次，且每次清洗30s，每次傾去溶液后拍干微孔板。8)微孔加100pl連接液(小心避免在孔中引入泡沫)。9)避光室溫溫育5分鐘。10)《效孔加lOO(il終止液并輕輕搖動來終止顯色反應。11)將微孔板和微孔板板框放入標準96孔微孔板分光光度計并讀取405nm吸光度。3、結果如表l所示。表l.本發明所述方法檢測不同濃度嗜肺軍團桿菌(Lp)的吸光度值<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>4、結果分析經分光光度計讀取吸光度值進行結果判定，測定7個已知的陰性樣(水)的吸光度，臨界值是m(陰性對照吸光度算術平均值)+7xSD(陰性對照吸光度標準偏差)，臨界值為0.17+0.04x7=0.45。檢測讀數大于臨界值則判定為檢測結果"陽性"；檢測讀數小于臨界值則判定為檢測結果"陰性"。即組別2的引物與組別2的檢測探針可以檢測到嗜肺軍團桿菌的最低濃度是10-"pM。實施例6:檢測其他病原體的靈敏度實驗參照實施例5,配制不同濃度的肺炎衣原體、流感嗜血桿菌、肺炎支原其核苷酸與靶基因一致。用捕獲探針和相應的檢測探針進行檢測，檢測到的最低濃度均能達到10"pM。實施例7:嗜肺軍團桿菌的引物特異性試驗將嗜肺軍團桿菌的巨噬細胞感染增強蛋白基因如SEQIDNO.5所示的基因片段隨機進行突變，突變后的核苷酸序列如SEQIDNO,22所示，為了敘述方便，將其稱為嗜肺軍團桿菌的巨噬細胞感染增強蛋白基因片段干擾序列。配制等濃度的實施例5所述嗜肺軍團桿菌標準品、上述干擾序列以及人DNA,取其中之一或兩兩混合或三種混合共配制成7種不同的待測樣品，每種待測樣品設置復管，在0.5ml無RNA酶的滅菌離心管中分別標記，配制如下所示的20piNASBA擴增反應體系，并同時i殳置兩個無RNA酶水的陰性對照，41。C水浴95分鐘。核酸擴增產物用于后續4企測。NASBA擴增反應體系(20^1)的終濃度具體為4寺測才羊品800pM引物(第5組)lpMAMV10URNaseH10UT7RNA聚合酶10UTris/HCl10mM氯化鉀1mMBSA100mg/ml二碌b蘇^唐醇1mM三磷酸核香與脫氧三磷酸核苦等濃度混合物200uM進行SDS—PAGE電泳分析，結果表明僅混合了嗜肺軍團桿菌標準品的反應管有擴增產物，取擴增產物委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列分析，其序列即為如SEQIDN0.5所示的核苷酸序列的5'連接了一段與捕獲探針互補的序列。實施例8:其他引物的特異性實驗參照實施例7,將肺炎衣原體的外膜蛋白A基因如SEQIDNO.l所示的核酸片段、流感嗜血桿菌外膜蛋白P6基因如SEQIDN0.2所示的核酸片段、肺炎支原體粘附蛋白Pl基因如SEQIDNO.3所示的核酸片段、肺炎鏈球菌溶血素基因如SEQIDNO.4所示的核酸片段幾個堿基隨機突變后形成的干擾序列與靶核酸片段、人DNA進行特異性實驗，即取其中之一或兩兩混合或三種混合共配制成7種不同的待測樣品，分別在不同的反應管用相應的引物進行擴增，SDS—PAGE電泳分析表明僅有混合了耙核酸的反應管有擴增產物，用相應的引物進行擴增，取擴增產物委托上海生工生物工程技術服務有P艮公司進行序列分析，其序列即為耙核酸序列5'連接了一段與捕獲探針互才卜序列。以上實驗結果說明本發明提供的引物特異性強，分析原因在于由于外來雙鏈DNA無T7啟動子序列，不能被擴增，這就顯著提高了NASBA反應的特異性；而且NASBA的反應條件溫和，且比PCR反應需要的時間短，因此轉錄更加忠實于模板，進一步減少了錯配率。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>aatgcaacgccagctgctaaagtattagtagaaggtaatactgatgaacgtggtacacca180gaatacaacatcgcattagg200<210>3<211>127<212>DNA<213>肺炎支原體粘附蛋白Pl基因3667-3780<400>3caccctcgggggcagtcagacgatgattacaggcggttcgcctcgaagaaccctcgacca60agccaacctccagctctgaacgggggcggggtgaaggaatgataaggcttcaagtggaca120aagtgac127<210>4<211>160<212>DNA<213>肺炎鏈球菌溶血素基因464-623<400>4atcccactcttcttgcggttgatcgtgctccgatgacttatagtattgatttgcctggtt60tggcaagtagcgatagctttctccaagtggaagaccccagcaattcaagtgttcgcggag120cggtaaacgatttgttggctaagtggcatcaagattatgg160<210>5<211>158<212〉DNA<213>嗜肺軍團桿菌的巨噬細胞感染增強蛋白基因406-563<權〉5ggaaatggtgttaaacccggtaaatcggatacagttactgtcgaatatactggtcgtctg60attgatggtaccgtttttgacagtaccgaaaaaactggtaagccagccacttttcaggtt120tcacaagtgattccaggatggacagaggctttacaatt158<210>6<211>40<212>DNA<213>引物Cp-F<400>6gatgcaaggtcgcatatgagcaagggctataaaggcgttg40<210>7<211>57<212>DNA<213>引物Cp-R<400>7aattctaatacgactcactatagggagaagggttaagtttaaaatatctgtaggtag57<210>8<211>24<212>DNA<213>探針Cp-P<400〉8gaacaaagtctgcgaccatcaatt24<210>9<211>42<212>DNA<213>引物Hi-F<楊〉9gatgcaaggtcgcatatgagtttggcggttactctgttgctg42<210>10<211>56<212〉DNA<213>引物Hi-R<400>10aattctaatacgactcactatagggagaaggcctaatgcgatgttgtattctggtg56<210>11<211>26<212>DNA<213>探針Hi-P<400>11ggtgaatacgttcaaatcttagatgc26<210>12<211>42<212>DNA<213〉引物Mp-F<400>12gatgcaaggtcgcatatgagagtcagacgatgattgcaggeg42<210>13<211>53<212>DNA<213>引物Mp-R<400>13aattctaatacgactcactatagggagaagggtcactttgttcgcttgaagtc53<210>14<211>22<212〉DNA<213>探針Mp-P<400>14atgaaccctcgaccaagcca22<210〉15<211>42<212>DNA<213>引物Sp-F<400>15gatgcaaggtcgcatatgagatcccactcttcttgcggttga42<210>16<211>55<212>DNA<213>引物Sp-R<400>16aattctaatacgactcactatagggagaaggccataatcttgatgccacttagcc55<210>17<211>22<212>DNA<213>探針Sp-P<400>17gcctggtttggcaagtagcgat22<210>18<211>43<212>DNA<213>引物Lp-F<400>18gatgcaaggtcgcatatgagggaaatggtgttaaacctggtaa43<210>19<211>56<212>DNA<213>引物Lp-R<400>19aattctaatacgactcactatagggagaaggaattgtaaagcttctgtccatcctg56<210>20<211>23<212>DNA<213>探針Lp-P<400>20taagccagccacttttcaggttt23<210>21<211>20<212>DNA<213>捕獲探針<400>21gatgcaaggtcgcatatgag20<210>22<211>158<212>DNA<213>嗜肺軍團桿菌的巨噬細胞感染增強蛋白基因片段的干擾序列<400>22ggaaatgagagtaaacccggtaaatcggatacagttactgtcgaatatactggtcgtctg60attgatggtaccgtttttgacagtaccgaaaaaactggtaagccagccacttttcaggtt120tcacaagtgattccaggatggacagaggctttacaatt158權利要求1、一種對可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進行檢測的方法，包括(i)擴增生物樣品的核酸片段，所述核酸片段為以下的一種或一種以上的組合肺炎衣原體的外膜蛋白A基因的如SEQIDNO.1所示的核酸片段；流感嗜血桿菌外膜蛋白P6基因的如SEQIDNO.2所示的核酸片段；肺炎支原體粘附蛋白P1基因的如SEQIDNO.3所示的核酸片段；肺炎鏈球菌溶血素基因的如SEQIDNO.4所示的核酸片段；嗜肺軍團桿菌的巨噬細胞感染增強蛋白基因的如SEQIDNO.5所示的核酸片段；(ii)用探針進行檢測，所述探針與步驟(i)擴增產物中的一種特異性雜交。2、如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(i)利用NASBA技術擴增樣品的核酸片段，NASBA運行條件為41。C45。C溫育90~150分鐘。3、根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(ii)中所述探針與步驟(i)所得擴增產物的雜交在固體支持物上進行。4、如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述步驟(i)使用以下4組寡核苷酸序列的一種或一種以上的組合作為引物進行擴增第l組引物用于擴增如SEQIDNO.l所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；第2組引物用于擴增如SEQIDN0.2所示的核酸片段，其上游引物核苦酸序列如SEQIDNO.9所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；第3組引物用于擴增如SEQIDN0.3所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.13所示；第4組引物用于擴增如SEQIDN0.4所示的核酸片段，其上游引物核苦酸序列如SEQIDNO.15所示，下游引物核苷^列如SEQIDNO.16所示；第5組引物用于擴增如SEQIDN0.5所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.18所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.19所示。5、根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(ii)使用捕獲探針，其核苷酸序列如SEQIDNO.21所示，所述捕獲探針直接或間接的連接在固體支持物上。6、根據權利要求1或5所述的方法，其特征在于，步驟(ii)中使用以下的核苷酸序列作為檢測探針序列1如SEQIDNO.8所示，檢測如SEQIDNO.l所示的核酸片段；序列2如SEQIDNO.11所示，檢測如SEQIDNO.2所示的核酸片段；序列3如SEQIDNO.14所示，檢測如SEQIDNO.3所示的核酸片段；序列4如SEQIDNO.17所示，檢測如SEQIDNO.4所示的核酸片段；序列5如SEQIDNO.20所示，檢測如SEQIDNO.5所示的核酸片段。7、一種對可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進行;險測的試劑盒，其包含用于擴增如SEQIDNO.l所示核酸片l殳的引物、用于擴增如SEQIDNO.2所示核酸片段的引物、用于擴增如SEQIDNO.3所示核酸片段的引物、用于擴增如SEQIDNO.4所示核酸片段的引物和用于擴增如SEQIDNO.5所示核酸片4殳的引物中的一組或一組以上的組合。8、如權利要求7所述的試劑盒，所述引物選自第1組引物用于擴增如SEQIDNO.l所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，其下游引物核苦酸序列如SEQIDNO.7所示；第2組引物用于擴增如SEQIDN0.2所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.IO所示；第3組引物用于擴增如SEQIDN0.3所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.13所示；第4組引物用于擴增如SEQIDN0.4所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.15所示，下游引物核苷^列如SEQIDNO.16所示；第5組引物用于擴增如SEQIDN0.5所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.18所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDN0.19所示。9、根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，還包含如核苷酸序列SEQIDNO.21所示的捕獲4笨針。10、根據權利要求7至9任一項所述的試劑盒，其特征在于，還包含以下至少一種與引物對應的檢測探針序列1如SEQIDNO.8所示，4企測如SEQIDNO.l所示的核酸片l殳；序列2如SEQIDNO.ll所示，4企測如SEQIDNO.2所示的核酸片段；序列3如SEQIDN0.14所示，檢測如SEQIDN0.3所示的核酸片段；序列4如SEQIDN0.17所示，檢測如SEQIDNO.4所示的核酸片段；序列5如SEQIDNO.20所示，檢測如SEQIDNO.5所示的核酸片段。全文摘要本發明公開一種對可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進行檢測的方法，所述傳染病病原體包括肺炎衣原體、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎鏈球菌和嗜肺軍團桿菌，包括擴增生物樣品的核酸片段和用探針進行檢測。本發明還提供用于擴增的引物以及用于檢測的探針。本發明還提供包含上述引物的試劑盒。本發明所述方法靈敏度高，特異性強，操作簡單，樣本范圍廣，可同時檢測多種傳染病病原體，適用于呼吸道傳染病的早期診斷。文檔編號C12R1/21GK101545010SQ20091008389公開日2009年9月30日申請日期2009年5月11日優先權日2009年5月11日發明者于常海,馮曉燕,劉樂庭申請人:北京海康基因芯片開發有限公司