專利名稱：棉花染色體分離方法
技術領域：
本發明屬于分子細胞遺傳學領域，具體涉及棉花染色體分離方法。
背景技術：
分子標記育種是農作物改良的重要技術之一。對重要的農作物建立高密度的分子 標記圖譜是實現農藝性狀分子標記和利用定位克隆技術分離有用基因的先決條件。目前已 構建的許多農作物分子標記連鎖圖譜是從整體基因組入手，通過各種分子標記所作的基因 圖譜，其工作量大，且圖譜難以做得精細，如從單條染色體或染色體的片段入手，既可大大 提高工作效率，又有助于提高各種作物遺傳圖譜和物理圖譜的精細程度。1981年，Scaleghe 等創立的染色體微切割、微克隆技術為此提供了有力的手段。 染色體微切割、微克隆技術主要是通過采用微細玻璃針或激光，在倒置顯微鏡下 對目的基因所在的染色體或染色體區段進行切割與分離，通過聚合酶鏈式反應(PCR)得到 擴增產物，將產物插入到載體上，以構建染色體或染色體區段特異性的DNA文庫。通過對文 庫的篩選，分離出染色體或染色體區段特異性的DNA位點標記(STS) 、 DNA多態性片段和相 關基因，再用染色體步行法分離得到目的基因。該技術優點是能根據需要分離任意一條染 色體或特定染色體片段，建立相應的DNA文庫，從中篩選出與目的基因緊密連鎖的分子標 記。 早期的微切割是對未顯帶染色體進行切割，有些植物的一些染色體容易辨認。例 如處于某些特殊時期的染色體、小麥帶有隨體的染色體等。Vega(1994)等用此方法成功切 割了小麥單體附加系中減數分裂中呈單價體狀態的染色體。Houben(1996)等微切割了黑 麥染色體組中帶有的B染色體。該方法的優點是對染色體沒有損傷，所建立的染色體DNA 文庫完整。其不足是只能在一些易于辨認的染色體上進行，使其應用受到局限。染色體分 帶技術的應用使細胞中染色體的辨認易于進行，在植物中通常采用C分帶及N分帶來辨認 染色體，這就使得該技術的應用對任何植物的任一染色體的任一區段的切割成為可能，大 大擴展了其應用范圍。其缺點是染色體分帶容易對染色體DNA造成損傷，使建立的該區段 DNA文庫的完整性及準確性受到一定的影響。 顯微激光切割法的特點是染色體標本在底部貼有特殊薄膜的培養皿上制作，借助 激光共聚焦掃描顯微鏡，利用激光所產生的高溫"燒掉"目標染色體周圍的染色體，接著再 "燒掉"目標染色體片段以外的其他染色體片段，然后用含有能消化染色體蛋白質的蛋白酶 K的收集液，收集被切割的片段備用。該方法可自動控制，因而具有操作簡便、容易掌握等優 點。 分離到的染色體片段必須經過體外擴增才能滿足一系列分子生物學研究的需要。 LA-PCR是Sa皿der等發展的效率更高的微克隆方法，即將分離的染色體DNA用限制性內切 酶(如Sau 3AI)進行消化，根據酶切后產生的粘性末端的堿基序列，分別設計1個連接子
(Linker, 24mer的寡核苷酸，其5'端磷酸化)和1個銜接子(Ad即tor， 20mer的寡核苷酸， 其5'端非磷酸化)，并使二者混合后產生與某一內切酶同樣的粘性末端。由于粘性末端不受限制，當酶切后的染色體DNA與連接子銜接子混合后，可大大提高連接效率。再用其中的 連接子作PCR擴增的引物，由于每個酶切產物都連接1個已知的連接子(弓l物)，這樣就可 擴增任一未知DNA片段，在PCR反應前無需分離程序，所構建的染色體區帶特異性文庫不僅 減少分離等步驟，避免可能產生的污染，而且由于DNA丟失少而大大提高文庫的完整性。
染色體描繪是研究染色體重組、畸變機制及進化的一個強有力手段，染色體微切 割、微克隆則為其提供了豐富的探針源泉。總之，染色體微切割、微分離技術對于構建高密 度遺傳圖譜、篩選與目的基因緊密連鎖的分于標記并進一步分離該基因及生物進化等方面 的研究起著重要作用，并顯示其廣闊的應用前景。相信隨著分子生物學的發展，該技術也將 會得到不斷完善和發展，在生命科學的研究中必將發揮更大的作用。 然而棉花染色體小而形態相近，且棉花組織富含棉酚、單寧和萜烯類等次生代謝 物質。截止目前，既沒有棉花染色體顯微分離方面的的報道，更沒有棉花單染色體文庫建立 方面的報道。
發明內容
本發明的目的在于提供棉花染色體分離方法。 本發明的另一 目的在于提供一種構建棉花染色體DNA庫的方法。 根據本發明的方法包括以下步驟 1)取材及預處理，取種子在溫水中浸泡6 12h，然后暗培養，待根長至1 2cm 時，截取根尖以放線菌酮處理，將預處理過的根尖置于卡諾固定液中固定； 2)前低滲，用滴管緩緩滴加無菌雙蒸水小心沖洗固定過的根尖，在4t:蒸餾水中 前低滲15 20min ; 3)酶解，切取前低滲過的根尖2 3mm于混合酶解液中37。C酶解，所述混合酶解 液含4X的纖維素酶、優選纖維素酶0nazuka R-10和1 %的果膠酶、優選果膠酶Pectolyase Y-23，以75mmol/L KC1和7. 5mmol/L EDTA緩沖液配制，pH4. O，過濾除菌;
4)后低滲，用吸管小心吸除酶解液后，用滴管緩緩滴加無菌雙蒸水小心沖洗根尖 2次后，4。C蒸餾水中后低滲15 20min ; 5)染色及壓片，將后低滲過的根尖移置于蓋玻片上，去除根冠保留生長區，滴加 10 iU卡寶品紅染色5min，輕輕搗碎后反轉覆于固定于支架上的膜載片上，輕壓即可，立即 放于-2(TC中保存； 6)揭蓋片，取出-201:保存的制片，稍停后直接揭蓋片，601:烘烤膜載片lh，立即 使用或者4t:保存備用； 7)在Cell Cut Plus激光顯微切割儀上切割收集目標染色體，具體方法是將制備 好的染色體標本放到Cell Cut Plus激光顯微切割儀載物臺上，在低倍鏡下找到目標染色 體，然后轉至40倍或100倍鏡下進行切割； 8)切割后的染色體用黏性的E卯endorf管蓋粘附收集，然后加入含10 y L50ng/ PL蛋白酶K溶液(1XT4DNA連接酶緩沖液配制)的0. 2mL黏性Eppendorf管中，高速離心 數秒鐘，-2(TC存放備用。 根據本發明的棉花單染色體擴增池，其通過以下方法制備 1)取材及預處理，取種子在溫水中浸泡6 12h，然后暗培養，待根長至1 2cm時，截取根尖以放線菌酮處理，將預處理過的根尖置于卡諾固定液中固定； 2)前低滲，用滴管緩緩滴加無菌雙蒸水小心沖洗固定過的根尖，在4t:蒸餾水中
前低滲15 20min ; 3)酶解，切取前低滲過的根尖2 3mm于混合酶解液中37°C酶解，所述混合酶解 液含4X的纖維素酶、優選纖維素酶0nazuka R-10和1 %的果膠酶、優選果膠酶Pectolyase Y-23，以75mmol/L KC1和7. 5mmol/L EDTA緩沖液配制，pH4. O，過濾除菌;
4)后低滲，用吸管小心吸除酶解液后，用滴管緩緩滴加無菌雙蒸水小心沖洗根尖 2次后，4。C蒸餾水中后低滲15 20min ; 5)染色及壓片，將后低滲過的根尖移置于蓋玻片上，去除根冠保留生長區，滴加 10 ii L卡寶品紅染色5min，輕輕搗碎后反轉覆于固定于支架上的膜載片上，輕壓即可，立即 放于-2(TC中保存； 6)揭蓋片，取出-201:保存的制片，稍停后直接揭蓋片，601:烘烤膜載片lh，立即 使用或者4t:保存備用； 7)在Cell Cut Plus激光顯微切割儀上切割收集目標染色體，具體方法是將制備 好的染色體標本放到Cell Cut Plus激光顯微切割儀載物臺上，在低倍鏡下找到目標染色 體，然后轉至40倍或100倍鏡下進行切割； 8)切割后的染色體用黏性的E卯endorf管蓋粘附收集，然后加入含10 y L50ng/ PL蛋白酶K溶液(1XT4DNA連接酶緩沖液配制)的0. 2mL黏性Eppendorf管中，高速離心 數秒鐘，_201:存放備用； 9)采用Sau 3A連接接頭PCR (Linker-adaptor PCR， LA-PCR)的方法擴增微分離 得到的染色體，Sau 3A接頭是由23堿基和19堿基的兩個寡核苷酸片段形成，23堿基的寡 核苷酸堿基序列為5' -6八1^0^^60^^八1"1^^(1:(:-3'，19堿基的寡核苷酸堿基序列為 5' -GGGTCGAATTCG AGCTCAG-3'，接頭的制備、染色體片段的蛋白酶K消化、接頭連接及兩輪 PCR擴增反應參照Albani (1993)和Chen (1995)的方法進行并略加改動，為了避免外源DNA 的污染，整個單染色體體外擴增操作過程均在無菌條件下進行，并設立嚴格的不含染色體 DNA的陰性對照和以10pg基因組DNA為模板的陽性對照，PCR擴增進行兩輪，從而獲得棉花 單染色體擴增池。 根據本發明的方法采用前低滲、酶解、后低滲和壓片法結合進行染色體膜制片的 準備，細胞壁完全去除干凈，染色體經輕壓后分散良好，形態清晰，利于目標染色體的識別。
在Cell Cut Plus激光顯微切割儀下進行目標染色體的切割收集，減少了人工挑 取染色體的繁瑣程序和大的勞動強度，也避免了外源DNA的污染，方便快捷地獲得目標染 色體。 去蛋白和內切酶酶切后進行LA-PCR擴增，可以去除染色體上的蛋白質以釋放DNA 雙鏈，在Sau3AI內切酶的作用下形成粘末端，與人工合成的接頭連接進行隨機擴增，可以 得到有較大DNA片段的單染色體擴增池。 為了驗證所得單染色體探針池的來源和目標，以Southern Blotting和FISH進行 驗證。 本發明的方法首次在棉花中解決了染色體膜載片的制備、染色體激光切割、單染 色體擴增池的獲得和來源及目標驗證。
本發明方法所制備的單染色體擴增池可用于棉花單染色體文庫的構建、專化序列 的克隆、RFLP分子標記作圖、重要基因定位和分離等研究。
圖1是亞洲棉石系亞1號中期分裂相(A)及其核型圖(B); 圖2是亞洲棉石系亞1號的單染色體顯微分離過程(箭頭示5號染色體)； 圖3是亞洲棉石系亞1號的第5號單染色體的LA-PCR擴增； 圖4是亞洲棉石系亞1號的第5號單染色體第2次LA-PCR擴增產物的Southern
雜交檢測； 圖5是熒光原位雜交結果。
具體實施例方式
下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用于說明
本發明，而不能限制本發明的保護范圍。 實施例1棉花第5號染色體顯微分離技術 1材料和方法 1. 1實驗材料 實驗材料是二倍體的亞洲棉品種石系亞1號，來自于中國農業科學院棉花研究 所。實驗試劑纖維素酶0nazuka R-10和果膠酶Pectolyase Y-23購自Solarbio， Southern 試劑盒購自Boehringer Mannheim公司，地高辛探針標記試劑盒購自Roche公司，純化回收 Kit購自上海生工公司，T-EasyVector購自Promega公司，PET膜載片和E卯endorf黏性收 集管購自基因有限公司，其他均為國產分析純試劑。
1. 2染色體標本制備 1. 2. 1取材及預處理。取種子在溫水中浸泡6 12h，然后置于消毒過的濕沙中 3(TC暗培養，待根長至1 2cm時，截取根尖于2. 5X10—5g L_l的放線菌酮中，2(TC處理lh 30min。將預處理過的根尖置于卡諾固定液中固定10min后，立即移入70X乙醇中于4t:保 存待用。 1. 2. 2前低滲。用滴管緩緩滴加無菌雙蒸水小心沖洗固定過的根尖2次后，4t:蒸 餾水中前低滲15 20min。 1. 2. 3酶解。切取前低滲過的根尖2 3mm于混合酶解液中(含4%的纖維素酶 0nazukaR-10和lX的果膠酶Pectolyase Y_23， 75mmol/L KC1和7. 5mmol/L EDTA緩沖液 配制，pH4. 0，過濾除菌)，37。C酶解45min。 1. 2. 4后低滲。用吸管小心吸除酶解液后，用滴管緩緩滴加無菌雙蒸水小心沖洗根 尖2次后，4t:蒸餾水中后低滲15 20min。 1. 2. 5染色及壓片。將后低滲過的根尖移置于蓋玻片上，去除根冠保留生長區，滴 加10 ii L卡寶品紅染色5min，輕輕搗碎后反轉覆于固定于支架上的膜載片上，輕壓即可，立 即放于-2(TC中保存。 1. 2. 6揭蓋片。取出-20°〇保存的制片，稍停后直接揭蓋片，601:烘烤膜載片lh，立
即使用或者4t:保存備用。
1. 3染色體的顯微分離 將制備好的染色體標本放到Cell Cut Plus激光顯微切割儀載物臺上，在低倍 鏡下找到目標染色體，然后轉至40倍或IOO倍鏡下進行切割。切割后的染色體用黏性的 E卯endorf管蓋粘附收集，然后加入含10 y L 50ng y L—1蛋白酶K溶液(1XT4DNA連接酶緩 沖液配制，用于LA-PCR)的0. 2mL黏性E卯endorf管中，高速離心數秒鐘，-2(TC存放備用。
1. 4Sau 3A接頭的制備及染色體片段的體外擴增 采用Sau 3A連接接頭PCR(Linker-adaptor PCR， LA-PCR)的方法擴增微分離得 到的染色體，Sau 3A接頭是由23堿基和19堿基的兩個寡核苷酸片段形成。23堿基的寡 核苷酸堿基序列為5' -GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3' ， 19堿基的寡核苷酸堿基序列為 5' -GGGTCGAATTCG AGCTCAG-3'，均由上海生工公司合成。接頭的制備、染色體片段的蛋白 酶K消化、接頭連接及兩輪PCR擴增反應參照Albani (1993)和Chen (1995)的方法進行并 略加改動。為了避免外源DNA的污染，整個單染色體體外擴增操作過程均在無菌條件下進 行，并設立嚴格的不含染色體DNA的陰性對照和以10pg基因組DNA為模板的陽性對照。
1. 4. ISau 3A人工接頭的制備。 制備接頭按照Albani (1993)和Chen (1995)方法進行，用稀釋緩沖液(1XT4連接 酶緩沖液，20mmo1 L—^TP)將接頭稀釋至5ng yL—M寺用。 1. 4. 2蛋白酶K的解離。將上述含單條目標染色體的O. 2mLE卯ondorf管置于37。C 下2h，5(TC下2h，蛋白酶K充分消化去蛋白，然后置于75°CT 20min滅活蛋白酶K。
1. 4. 3單染色體體外擴增。在上述去蛋白處理的E卯endorf管中加入2ii LSau 3A， 37。C酶切染色體DNA 3h，70。C 20min使酶失活。加入制備好的接頭2 y L(5ng y L—0 ， T4DNA 連接酶0. 5 ii L (3U ii L—0 ，連接反應最終體積為24. 5 ii L。 16。C連接過夜后，70°C 20min失活 連接酶。 PCR擴增分二輪進行。第一輪擴增在上述同一Eppendorf管中進行，除原先的反 應物外，再加入lOXTaq酶緩沖液10iiL，10mmo1 L—MNTPs 2 ii L， 19mer引物liiL(250ng ii L—0 ， Taq DNA聚合酶0. 5 y L(4U y L—0 ，紫外線照射過的超純水補至體積100 y L，混勻， 覆蓋一滴滅菌的石蠟油。然后94t:預變性5min ;進行94" lmin、5(TC 1. 5min、72°C 3min循 環35圈；最后72"延伸15min，4t:保溫。 第二輪PCR擴增以第一輪擴增產物5 ii L為模板，其它反應成分不變；PCR反應程 序基本同上，只是將35個循環降至25個循環。 上述過程設兩種嚴格對照陽性對照加入約10pg基因組DNA為初始底物，陰性對 照中不加任何底物，其它所有操作過程同上。
1. 5Southern雜交分析 亞洲棉石系亞1號基因組DNA的提取和純化按照宋國立等的方法。取適量的基因 組DNA(l 3ii g)用Eco RI于37。C酶切過夜，然后與棉花第5染色體的第2輪LA-PCR擴 增產物一起，在8g L—4京脂糖凝膠上電泳。之后，按照奧斯伯等的方法自上向下毛細管轉移 法進行轉膜。紫外交聯后，用Eco RI酶切并經Dig標記的石系亞l號棉花基因組DNA為探 針進行Southern雜交。具體過程參考Dig DNA Labeling andDetection Kit (Boehringer Mannheim)說明。
1. 6熒光原位雜交分析
通過隨機引物法用DIG(Digoxigenin-dUTP， Roche)標記第2輪LA-PCR產物作為 探針，在石系亞1號根尖有絲分裂中期染色體標本上進行原位雜交。雜交過程及雜交后的 信號檢測按Zhang(2005)和王春英等(1999)的方法進行。
2試驗結果 2. 1采用酶解、低滲和壓片相結合的制片方法，獲得了在膜載片上分散較好的中期 染色體分裂相(圖l)。以Cell Cut Plus激光顯微切割儀分離染色體，成功地獲取了若干 條第5染色體，以單染色體形式保存于Eppendorf管中(圖2)。 2. 2亞洲棉石系亞1號的第5號單染色體DNA經第一輪LA-PCR擴增后，電泳檢測顯 示不太明顯的連續擴增帶型，如圖3A中所示的第2、3泳道，DNA片段長度為400 1800bp。 經第二輪LA-PCR擴增后，電泳檢測顯示明顯的連續擴增帶型，如圖3B中所示的第2、3泳 道，DNA片段長度為300 2500bp，另外設立了不加任何DNA的陰性對照和lOpg基因組DNA 的陽性對照，如圖3A、3B所示第1泳道為陰性對照，沒有發現擴增產物，說明沒有外源DNA 的污染，如圖3A、3B所示第4泳道為陽性對照，亦能擴增出類似的DNA，擴增產物帶略寬一 勝。 2. 3Southern雜交結果(圖4)顯示，目標染色體的擴增產物(第2、3泳道)與lOpg 基因組DNA的擴增產物(第4泳道)和基因組DNA的酶切的譜帶(第5泳道) 一樣均出現 明顯的雜交信號，而陰性對照(第1泳道)沒有信號，說明單染色體的擴增產物確實來自棉 花基因組。 2. 4用地高辛標記第2次LA-PCR產物做探針，在石系亞1號有絲分裂中期染色體 標本上進行熒光原位雜交，如圖5所示，熒光信號較集中的分布于第5號染色體，初步證實 擴增產物來自被分離的染色體，而不是來自基因組的其他染色體。同時，在其他部分染色體 上也有較微弱。
權利要求
棉花染色體分離方法，其特征在于，包括以下步驟1)取材及預處理，取種子在溫水中浸泡6～12h，然后暗培養，待根長至1～2cm時，截取根尖以放線菌酮處理，將預處理過的根尖置于卡諾固定液中固定；2)前低滲，滴加無菌雙蒸水沖洗固定過的根尖，在4℃蒸餾水中前低滲15～20min；3)酶解，切取前低滲過的根尖2～3mm于混合酶解液中酶解，所述混合酶解液含4％的纖維素酶、和1％的果膠酶；4)后低滲，吸除酶解液，滴加無菌雙蒸水沖洗根尖，4℃蒸餾水中后低滲15～20min；5)染色及壓片；6)揭蓋片；7)染色體的顯微分離，找到目標染色體，然后進行切割；8)收集染色體。
2. 根據權利要求l的方法，其特征在于，在步驟3)中，所述纖維素酶為纖維素酶 Onazuka R-IO。
3. 根據權利要求1的方法，其特征在于，在步驟3)中，所述果膠酶為果膠酶Pectolyase Y-23。
4. 一種棉花單染色體擴增池，其特征在于，所述棉花單染色體擴增池通過以下方法制備1) 取材及預處理，取種子在溫水中浸泡6 12h，然后暗培養，待根長至1 2cm時，截 取根尖以放線菌酮處理，將預處理過的根尖置于卡諾固定液中固定；2) 前低滲，滴加無菌雙蒸水沖洗固定過的根尖，在fC蒸餾水中前低滲15 20min ;3) 酶解，切取前低滲過的根尖2 3mm于混合酶解液中酶解，所述混合酶解液含4%的 纖維素酶、和1%的果膠酶；4) 后低滲，吸除酶解液，滴加無菌雙蒸水沖洗根尖，4t:蒸餾水中后低滲15 20min ;5) 染色及壓片；6) 揭蓋片;7) 染色體的顯微分離，找到目標染色體，然后進行切割；8) 收集染色體；9) 采用Sau 3A連接接頭PCR的方法擴增微分離得到的染色體，其中PCR擴增進行兩 輪，從而獲得棉花單染色體擴增池。
5. 根據權利要求4的方法，其特征在于，在步驟9)中，所述Sau 3A接頭包括23bp和 19bp的兩個寡核苷酸片段，所述23bp寡核苷酸序列為5'-GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3'， 所述19bp寡核苷酸堿基序列為5' -GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3'。
6. 根據權利要求4的方法，其特征在于，在步驟3)中，所述纖維素酶為纖維素酶 Onazuka R-IO。
7. 根據權利要求4的方法，其特征在于，在步驟3)中，所述果膠酶為果膠酶Pectolyase Y-23。
全文摘要
本發明屬于分子細胞遺傳學領域，具體涉及棉花染色體分離方法，所述方法包括以下步驟取材及預處理、前低滲、酶解、后低滲、染色及壓片、揭蓋片、染色體的顯微分離以及收集染色體。根據本發明的方法采用前低滲、酶解、后低滲和壓片法結合進行染色體膜制片的準備，細胞壁完全去除干凈，染色體經輕壓后分散良好，形態清晰，利于目標染色體的識別。
文檔編號C12P19/00GK101724624SQ20091008330
公開日2010年6月9日 申請日期2009年4月30日 優先權日2009年4月30日
發明者劉方, 宋國立, 張香娣, 彭仁海, 王為, 王坤波, 王春英, 王玉紅, 黎紹惠 申請人:中國農業科學院棉花研究所