專利名稱：：表征遺傳毒性的重組菌及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及表征遺傳毒性的重組菌及其構建方法與應用。
背景技術：
：隨著近代工業的發展，環境污染日趨嚴重，人類向環境中排放大量的有毒有害物質，危害人類健康，因此對有毒物質的檢測至關重要。其中，對遺傳毒物的重視和遺傳毒性的檢測，是近十年來備受關注的領域。通常對遺傳毒物的檢測有兩種手段——物理化學方法和生物方法。理化方法基于對樣品成分的儀器分析，如GC-MS或HPLC。通過理化手段可以獲得樣品的成分數據，經過毒性數據換算從而得到樣品中該物質的毒性。但理化分析方法程序多，成本高，不適于現場快速和高通量的應用，而且所得到毒性數據未考慮該物質在環境中的生物有效性，更重要的是，結果忽略了毒性物質間的拮抗、加合和協同作用(Sorensen，S.J.，M.Burmolle，andL.H.Hansen,#aA77^se/seoftoo'c_zY/..0^e7o/Me"t51i/『力o/e—ceJJZ^z'osmsans1.CurrentOpinioninBiotechnology,2006.17(1):p.11-16)。因此，生物手段在遺傳毒性檢測中具有重要的意義。其中生物傳感細胞是其中發展較快的一類檢測方法。遺傳毒性檢測的生物傳感細胞是一類基因工程菌，其DNA包含啟動基因和報道基因兩個關鍵片段。報道基因不具有啟動子。啟動基因只在造成DNA損傷的毒性物質存在下被誘導表達，使得其下游的報道基因表達產生可被測量的產物，并隨啟動子表達強度升高而信號增強。在對大腸桿菌DNA損傷修復研究中，研究者發現了在損傷因素誘導下發生的S0S修復系統(孟紫強，環境毒理學.第一版.2000，北京中國環境科學出版社.)。SOS系統由recA和lexA兩個基因調控。LexA蛋白質在SOS系統中阻遏lexA、recA，咖uDC、uvrA、uvrB、uvrC等基因的表達，當細胞暴露于遺傳毒物時，RecA蛋白質被活化為蛋白酶，與阻遏蛋白LexA結合，使后者裂解。一旦LexA蛋白被裂解，所有參與SOS反應的基因都將充分表達，使細胞的修復得以發生。基于S0S系統，研究者通過分子生物學手段，構建了多種被SOS系統的啟動子誘導表達的全細胞生物傳感器。目前成熟的檢測遺傳毒性的生物傳感器方法有咖u/SOS顯色實驗法，SOSchromotest，Mutatox等，這些方法多已進行商業生產。其中umu方法和SOSchromotest方法有相應的ISO標準規范其使用方法。umu顯色實驗通過SOS系統的umuCD操縱子啟動lacZ基因，SOSchromotest通過SOS過禾呈中的sulA基因啟動lacZ基因，從而實現通過監測報道基因的報道產物來檢測遺傳毒物的目的。SOS系統給出的檢測結果與傳統的檢測致突變的Ames實驗結果相關性很高，在數百種受試物中，SOSchromotest與Ames實驗給出82%的相似結果(Quillardet，P.andM.Hof醒g，7Xe鄉cAr膽fe"..srew.ejr.MutatRes，1993.297(3):p.235-79.)。但umu與SOS方法的時間和成本上遠優于Ames實驗，已在大氣、水體和土壤遺傳毒性檢測中廣泛應用(潘峰，王萬峰，時蕾，Umu測試法及其在環境科學中的應用.安徽農業科學，2007.35(8):p.2208-2210.)。雖然以發光基因為報道基因的遺傳毒性檢測的基因工程菌在文獻中有所報道，但由于構建手段的局限，宿主菌均采用大腸桿菌或鼠傷寒沙門菌。同時，實現生物傳感的關鍵基因——啟動基因和報道基因，都位于質粒載體中，以質粒的形式復制。因此需要特殊的培養條件，維持質粒。而且質粒的拷貝數不固定，會造成生物傳感細胞表達不穩定。
發明內容本發明的目的是提供一種表征遺傳毒性的重組菌及其構建方法與應用。本發明所提供的表征遺傳毒性的重組菌，命名為^"/7"o^"er印.ADP—recA—km—lux是染色體的recA基因中含有報道基因的不動桿菌"ci刀"ote"ersp.)ADP1;所述報道基因與recA基因具有共同的啟動子。所述報道基因與recA基因具有共同的啟動子，其轉錄受recA基因啟動子調控，recA基因的表達使得報道基因表達。本發明的重組菌的所述recA基因中還可含有篩選標記基因，所述篩選標記基因位于所述報道基因的3'末端；所述篩選標記基因帶有啟動子。月cj'/efoZ^cterADP—recA—km—lux中所述報道基因與recA基因具有共同的啟動子，其轉錄受recA基因啟動子調控，recA基因的表達使得報道基因表達。這樣可使^ci';ez^te"er印.ADP—recA—km_lux暴露在遺傳毒性的物質或具有DNA損傷能力的輻射下時，啟動SOS修復系統的同時啟動報道基因，通過報道產物的量的增加表征遺傳毒性物質的存在。^c&e^^acfer印.ADP—recA—km—lux中所述篩選標記基因具有獨立的啟動子，該啟動子為組成型表達，因此篩選標記基因表達不受遺傳毒性物質影響，有利于重組菌的篩選。所述報道基因具體可為發光基因。所述發光基因具體可為luxCDABE，所述篩選標記基因具體可為卡那霉素抗性基因。所述含有發光基因和篩選標記基因的recA基因的核苷酸序列具體可為序列表中的序列1。^c眾eto/^cfer邵.ADP—recA—km—lux已于2009年2月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.2925。^ciyez^^"ersp.ADP—recA_km—luxCGMCCNo.2915可以按照如下方法構建1)構建如下的DNA分子，含有recA基因5'部分、發光基因luxCDABE、卡那霉素抗性基因和recA基因3'部分；自5'至3'末端依次為recA基因5'部分、發光基因、篩選標記基因和recA基因3'部分；所述recA基因5'部分的核苷酸序列為序列表中的序列1自5'末端第987-1362位，所述recA基因3'部分的核苷酸序列為序列表中的序列l自5'末端第8924-9584位；所述發光基因與recA基因具有共同的啟動子；所述卡那霉素抗性基因的核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第7222-8917位；2)將步驟1中構建的DNA分子導入不動桿菌"c^"o&cfer印.)ADPl中，通過同源重組獲得所述的重組菌。構建步驟1中的DNA分子可以用本領域公知的各種方法。如根據Jc&eM&ctw，ADP1染色體DNA序列，取recA基因上下游序列設計引物PCR分別擴增recA基因5'部分和recA基因3，部分，重疊PCR得到^c眾"o力acfer邵.ADPl的recA基因，通過引物在recA基因的中引入限制性內切酶的酶切位點再通過酶切位點在recA基因中插入發光基因luxCDABE和卡那霉素抗性基因。步驟1中構建的DNA分子導入不動桿菌"c^etotec^er印.)ADPl中可通過將該DNA分子插入各種商業化的載體中構建重組載體，將重組載體導入不動桿菌"ci"e^力a"er5"A)ADPl。本發明的重組菌可用來檢測遺傳毒性物質。本發明的另一個目的是提供一種檢測遺傳毒性物質的方法。本發明所提供的檢測遺傳毒性物質的方法，是將所述的重組菌與待測溶液混合，培養所述重組菌，通過檢測報道基因表達產物的量來判斷待測溶液是否含有遺傳毒性物質。其中，所述待測溶液中還可加入S9肝粒體酶。所述培養溫度可為37。C。本發明的表征遺傳毒性的重組菌，是在力c^7e^^9c^r邵.ADP1菌染色體的recA基因中插入發光基因片段luxCDABE和卡那霉素抗性基因。該重組菌暴露于遺傳毒性的物質或具有DNA損傷能力的輻射后，會產生生物發光，發光強度與遺傳毒性呈劑量效應關系，可被用于評價樣品的遺傳毒性和輻射的DNA損傷強度。圖1為Xci/7efo6acz^rADPl-recA-km-lux染色體上構建的recA基因5'部分、發光基因luxCDABE、卡那霉素抗性基因和recA基因3'部分示意圖。圖2為暗箱中拍攝^c^ez^力acz^rADP1-recA-km-lux暴露于不同濃度絲裂霉素C后的發光響應照片。圖3為^ci/2eto力a"er印.ADP1-recA-km-lux對絲裂霉素C遺傳毒性的劑量效應曲線。圖4為」ci/7efoZ^"erADP1-recA-kra-lux對芘遺傳毒性的劑量效應曲線。圖5為地下水樣品的遺傳毒性。具體實施例方式下述實施例中如無特殊說明所用方法均為常規方法，所用試劑均可從商業途徑獲得。實施例1.不動桿菌^ci/"o63cfarADP—recA—km—lux的構建1)在不動桿菌"ci/"o力acfarsA)ADP1的recA基因中構建BamHI和EcoRI限制性內切酶酶切位點A^7ez^Zacz^rsaADP1染色體DNA已全部測序，可由NCBIGenebank數據庫獲得。設計如下引物通過PCR反應獲得Jci/3"o&"erADP1完整的recA基因的5，部分和3'部分Pl:5，-TCATTAGCAATAAGAGGTTGGATCG-3'P2:5'-TCGCACCAGAGCGTACAAGCGGATCCGGAATTCCC-3，P3:5，-GGGAATTCCGGATCCGCTTGTACGCTCTGGTGCGA_3，P4:5'-GGCTTCGCAATTGTACTCTGTG-3，其中，Pl，P2為一對引物，用以擴增recA基因的5'部分；P3，P^為一對引物，用以擴增recA基因的3'部分。在引物P2和P3上分別設計EcoRI和BamHI的酶識別位點。以^ci/"o力acferADP1細胞(Huang,W.E.，etal.，CAr。ffloso腿iiyJocatec/sah.cy7ate.EnvironmentalMicrobiology,2005.7(9):p.1339-1348.(清華大學)為模板，PCR的反應條件如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>PCR產物進行1%的瓊脂糖電泳后，使用Qiagen公司的QIAquickgelextractionkit進行切膠純化。分別獲得recA基因的5'部分和3'部分。2)recA基因的5'部分和3'部分連接。以步驟l)中所獲得的recA基因的5'部分和3'部分為模板，同時以Pl和P4為引物，進行重疊PCR反應，得到完整的recA基因。PCR反應條件如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>PCR產物進行1%的瓊脂糖電泳后，使用Qiagen公司的QIAquickgelextractionkit進行切膠純化。獲得完整的recA基因。3)recA基因與pGEMT載體連接，進行克隆用T4DNA連接酶(NewEnglandBiolab)將步驟2)中經純化的recA基因與商業載體pGEMT連接，獲得重組表達載體pGEMT-recA，載體pGEMT-recA轉化入大腸桿菌JM109感受態細胞(由Promega公司購得)，在含有氨節西林，表面涂布IPTG和X-Gal的LB平板上進行藍白篩選，得到重組菌。使用QiaquickPr印Kit(Qiagen)提取重組菌質粒。4)在BamHI位點插入卡那霉素抗性基因BamHI(NewEnglandBiolab)分別酶切步驟3)獲得的質粒和pRMJl質粒(Jones，R.M.andP.A.Williams,MutationalanalysisofthecriticalbasesinvolvedinactivationoftheAreR-regulatedsigma(54)-dependentpromoterinAcinetobacterspstrainADPl.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2003.69(9):p.5627-5635.)(清華大學)，分別回收5676bp和1696bp的片段，T4DNA連接酶(NewEnglandBiolab)將5676bp和1696bp的片段連接，獲得含有卡那霉素抗性基因的重組表達載體pGEMT-recA-km，將其轉化入大腸桿菌J1109感受態細胞(由Promega公司購得)，通過含有卡那霉素的LB培養基篩選重組體。5)在EcoRI位點插入發光基因EcoRI內切酶(NewEnglandBiolab)分別酶切步驟4)所獲得的含有卡那霉素抗性基因的重組表達載體和質粒pSalAR—lux(Huang，W.E.，etal.，/brt/ecfetectJ.o"ofsaJic/7ate.EnvironmentalMicrobiology,2005.7(9):p.1339-1348.(清華大學)，分別回收7372bp和5852bp的片段，T4DNA連接酶(NewEnglandBiolab)將7372bp和5852bp的片段連接，獲得含有發光基因luxCDABE的重組表達載體pGEMT-recA-km-lux。pGEMT-recA-kra-lux轉化入大腸桿菌JM109感受態細胞，在含有50mg/L卡那霉素和IPTG的LB培養基上篩選發光的菌落。6)與ADPl染色體同源重組為實現在ADPl染色體的recA基因上插入luxCDABE與卡那霉素抗性基因，需要對ADPl與步驟5)所獲得的質粒進行同源重組。爿c&ez^力a"erADPl感受態細胞的制備在LB培養基中接種^ci/efoZ^cz^rADP1細胞；28'C過夜培養的ADP1細胞按照體積比為1:25接種至新鮮LB培養基，3(TC下震蕩培養3小時。同源重組通過離心將感受態細胞濃縮十倍，加入l-10tiL步驟5)所獲得的質粒，在3(TC下培養3小時。細胞涂布在含有卡那霉素的LB培養基上進行篩選，生長出的單克隆即為^ci/ez^Zactersp.ADP—recA—km—lux。^c眾eto力a"ers/.ADP1-recA-km-lux染色體上構建的recA基因、發光基因與卡那霉素抗性基因的位置關系示意圖如圖1。圖1中實線表示力c&ez^Z^cz^rs;.ADPl-recA-km-lux染色體DNA。recAl和recA2為力c&e力o&"erADP1完整recA的5'部分和3，部分。在其中插入了發光基因片段luxCDABE和卡那霉素抗性片段km、圖1中EcoRI與BamHI表示EcoRI與BamHI限制性內切酶識別位點。插入了發光基因luxCDABE和卡那霉素抗性基因kmr的recA基因的核苷酸序列為序列表中的序列1。實施例2.Jc&e"力3"erADP—recA—km一lux對遺傳毒性物質絲裂霉素C的響應1)細胞培養與準備Jci/7et0Zacz^rs/.ADP—recA—km—lux單菌落接種至含有10mg/L卡那霉素的LB培養基(LBK)，30。C培養過夜。新鮮LBK培養基將細胞稀釋10-25倍，獲得細胞懸浮液，待用。2)樣品準備分別配制濃度為0.0001、0.001、0.01、0.1和lug/ml絲裂霉素C的水溶液。3)樣品測試取200uL步驟l)中稀釋的細胞懸浮液，加入黑色底透的96孔酶標版孔內。每孔分別加入不同濃度的2uL絲裂霉素C水溶液(0.03、0.3和3MM)，清水作為陰性對照。使用可以測量96孔板內化學發光和吸光度的多功能酶標儀(SpectraMaxM2讀板機，MolecularDevicesCorporation)。在37。C測量每個微孔的化學發光(lum)，并讀取該孔在600nm波長處的吸光度(OD600)。每隔30分鐘或60分鐘進行一次測量。測量期間96孔板在37t:下振蕩培養。4)數據處理按如下公式計算相對發光值RLU=Lum/0D600爿c^7eto63ctarADP—recA—km—luxX寸遺傳毒性物質絲裂霉素C的響應如圖2和圖3所示，圖2為暗箱中拍攝的絲裂霉素C誘導重組菌產生的化學發光。每一列包括三個平行樣，由左至右絲裂霉素C最終濃度分別為O、0.03、0.3和3PM，隨絲裂霉素C濃度升高，重組菌的化學發光增強。圖3為暴露三小時后絲裂霉素C對重組菌相對發光的劑量效應曲線。絲裂霉素C的劑量與細胞相對發光強度具有較好的劑量效應關系。實施例3Jc&eto&cters/.ADP—recA—km—lux對多環芳烴遺傳毒性的檢測1)細胞培養與準備爿w'/7efote"er邵.ADP—recA_km—lux單菌落接種至含有10mg/L卡那霉素的LB培養基(LBK)，3(TC培養過夜。新鮮LBK培養基將細胞稀釋10-25倍，獲得細胞懸浮液，待用。2)樣品準備將芘溶解于DMSO溶劑，配置濃度為0.000001、0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.l和lmM的芘溶液。3)樣品測試取2uL芘溶液溶于18ixL高純水，并加入2uLS9肝粒體酶(Sigma公司，S2442)和3ixL高純水。隨后與180iiL步驟l)中稀釋的細胞懸浮液在96孔板中混合。使用可以測量96孔板內化學發光和吸光度的多功能酶標儀(SpectraMaxM2讀板機，MolecularDevicesCorporation)。在37。C測量每個微孔的化學發光(lum)，并讀取該孔在600nm波長處的吸光度(OD600)。每隔30分鐘或60分鐘進行一次測量。測量期間96孔板在37"C下振蕩培養。4)數據處理按如下公式計算相對發光值RLU=Lum/0D600^c眾ez^力a"er印.ADP—recA—km—lux對多環芳烴遺傳毒性的劑量效應如圖4所示，當芘濃度為4X10-6至4X10-3mM間時，隨芘濃度提高，細胞的相對發光強度增強。實施例4li/ez^力3cz^r印.ADP—recA—km—lux對環境樣品遺傳毒性的檢測1)細胞培養與準備爿c^"oZacfersp.ADP—recA—km—lux單菌落接種至含有10mg/L卡那霄素的LB培養基(LBK)，3(TC培養過夜。新鮮LBK培養基將細胞稀釋10-25倍，獲得細胞懸浮液，待用。2)樣品準備采集污染場表層與深層地下水(經測定其主要污染物為苯酚及其代謝中間產物)。3)樣品測試分別取2uL表層與深層地下水溶于18yL高純水，并加入2uLS9肝粒體酶(Sigma公司，S2442)和3uL高純水。隨后與180uL步驟l)中稀釋的細胞懸浮液在96孔板中混合。使用可以測量96孔板內化學發光和吸光度的多功能酶標儀(SpectraMaxM2讀板機，MolecularDevicesCorporation)。在37。C測量每個微孔的化學發光(lum)，并讀取該孔在600nm波長處的吸光度(0D600)。每隔30分鐘或60分鐘進行一次測量。測量期間96孔板在37"C下振蕩培養。4)數據處理按如下公式計算相對發光值RLU=Lum/0D600力ci/efo力a"ers/.ADP—recA—km—lux對環境樣品遺傳毒性的劑量效應如圖5所示，表層與深層地下水均受到不同程度的污染，具有遺傳毒性，且表層地下水樣品的遺傳毒性大于深層地下水樣品。爿c^ez^力3"er5^.ADP—recA—km—lux已于2009年2月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.2925。序列表〈110〉清華大學〈120〉表征遺傳毒性的重組菌及其構建方法與應用<160>1<210〉1〈211>10221<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈230〉<400>1tcattagcaa"U卿ggttggatcgcactggtatggatttgatcaaatttttaaaaagtt60tcaatacagtcaatacatatttacttgttacttcactatcattaatgagcttggtcattt120atttctatgttataagccctaagtaaagccactcacgtggctttttaatt"ttttgagtca180gattaatttaactttttatacttacatttcttaattcactcctcttttta240肌tg肌tg8tattggct肌aatcagcatcataataag3gttg3aacctagC3aagagtcc300ctatatta^tagctatattgcatcttctatcttgatactattctgtttgc360gictttttcaatttataaggattttgatgtctagacagcaacatgaagaacatagtattga420ttctatgcgagttgataaatggctatgggctgctcgtttc111aaaacacgttct￡Lt3gC480taaagcagccatcg貼ggcggaaeiagttcaCC3C犯t3gtgaacgtgttaaagtttccaa540agaaattcgggtaggaeitggaattgacca/ttcagcaaggctttg肌agaaa肌ctgttgt600ttatct犯tatgcggggacctgcacctatagcacaacagctctatgatga660aactgaagttagteLttgcaaaaagagagttgattgcttcgtgcataattt720agcccgaccagatcETtcgtccttctaaaaaagatcgacgacagattcatc780<image>imageseeoriginaldocumentpage13</image>ttccttgggagtcatcatttaaatatcgagatgcgttagcsttaaaaggtgcggaaagga2640ttgt8g83gCaggaatgaataacatatttcgagttggtggatctcatgacggaatgagac2700cgttgcaacgattagtgacatatatttctcatgaaaggccatctaactatacggct犯gg2760atgttgcggttgaaatsgsacagactcgattcctggaagaagataagttccttgtatttg2820tcccataataggtaaaagtatgg^L32ltg3atcaaaatataaaaccatcgaccacgttat2880ttgtgttgaaggaaataaaaaaattcatgtttgggaaeicgctgccagaaga_3a3C3gccc2940aaagagaaagaMgcca_tta_ttattgcgtctggttttgcccgcaggatggatcattttgc3000tggtctggcggaat3ttt8tcgcggaatggatttcatgtgatccgctatgattcgcttca3060ccacgttggattgagttcagggsca^ttgatgaatttacaatgtctataggaa^gceigsg3120cttgttagcagtggUgattggttaactacacgaaaaataaataacttcggtatgttggc3180ttcaagcttatctgcgcggatagcttatgcaagcctatctgaaatcaatgcttcgttttt3240aatcaccgcagtcggtgttgttaacttaagatattctcttga3agagctttagggtttga3300ttatctcagtctacccattaatgaattgccggateiatctagattttgaaggccataaatt3360gggtgctga_agtctttgcgagagattgtcttgattttggttgggaagatttagcttctac3420atgatgtatcttgatataccgtttattgcttttactgcaaataacgataa3480ttgggtcaagttatcacattgttatcaaatattcgtagta3540gatatattctttgtta_ggeiagttcgcatgacttgagtgaaaatttagtggtcctgcgcaa3600tttttatcaatcggttacgaaagccgctatcgcgatggataatgatcatctggststtggi3660tgttgatattactgaaccgtcatttgaacatttaactattgcgacagtcaatgaacgccg3720gagattgaaaatcaagcaatttctctgtct3780tatcactcaaatagcaatataaggactctct8tga朋tttggaaactttttgcttacata3840cceiacctccccaattttctcaaacagaggtaatgaaacgtttggttaaattsggtcgcat3900ctctgaggagtgtggttttgataccgtatggttactggagcatcatttcacggagtttgg3960tttgcttggtaacccttatgtcgctgctgcatatttacttggcgcgacta4020tgt3gg犯Ctgccgctattgttcttcccacagcccatccagtacgccaacttgeteigeitgt4080gaatttattggatcaaatgtcaaaaggacgatttcggtttggtatttgccg3gggCttt34140caacaaggactttcgcgtattcggcacagatatgaataacagtcgcgccttagcggaMg4200ctggtacgggctgataaagaatggcatgac卿gggatstatggaagctg4260tatcaagttccataaggtaaaiagtaaaccccgcggcgtatagcagaggtggcgcaccggt4320ttEltgtggtggctgaatcagcttcgacgactgagtgggctgctcaatttggcctaccgat4380g^ta<ttaagttggattataaatactaacgaaaagaaagc3caacttgagctttat^tga4440agtggctc肌gaatatgggcacgatattcataatatcgaccattgettatcatatataac4500atctgtagatcatgactcMttaaagcgaaagag^itttgceggaaatttetggggcattg4560gtatgattcttatgtgaatgctacgactatttttgatgattcagacca^c肌gaggtta4620tgatttcaataaagggcagtggcgtgactttgtattaaaaggacataaagatax:taatcg4680ccgtattgaltacagttacgaaatcaatcccgtgggaacgccgcaggaatgtattgacat4740gac3ttgatgctacaggaeitatcaaatatttgttgtggsttttgaagctaa4800tggaacagtag3cgaa8tt3ttgettccatg犯gctcttccagtctgatgteatgecatt4860tcttaaagaaaaacaacgttcgctatta^ttagctaagggaaatttgga4920ttgttcttccttaacttcatcaattcaacaactgttcaag犯ca肌gtatagttcgcatg4980cagga犯t^eggagtatgttg3t^gttgaattttgaacagattttagtgtatgaaaat5040catttttcagat犯tggtgttgtcggcgctcctctgactgt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tgg10080atattattatgaaagctattcatcgaatagaagaggaataaatggtggtaaccctactag10140caaaacctcggcacattatagatctgctaccgttgctaccttccggtcctggcggggttc10200acagagtacaattgcgaagcc1022權利要求1、一種重組菌，是染色體的recA基因中含有報道基因的不動桿菌(Acinetobactersp.)ADP1；所述報道基因與recA基因具有共同的啟動子。2、根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于所述recA基因中還含有篩選標記基因，所述篩選標記基因位于所述報道基因的3'末端；所述篩選標記基因帶有啟動子。3、根據權利要求1或2所述的重組菌，其特征在于所述報道基因為發光基因，所述發光基因為luxCDABE，所述篩選標記基因為卡那霉素抗性基因。4、根據權利要求3所述的重組菌，其特征在于所述含有發光基因和篩選標記基因的recA基因的核苷酸序列為序列表中的序列1。5、根據權利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組菌的保藏編號為CGMCCNo.2915。6、構建權利要求5所述重組菌的方法，包括如下步驟1)構建如下的DNA分子，含有recA基因5'部分、發光基因、篩選標記基因和recA基因3'部分；自5'至3'末端依次為recA基因5'部分、發光基因、篩選標記基因和recA基因3'部分；所述recA基因5'部分的核苷酸序列為序列表中的序列1自5'末端第987-1362位，所述recA基因3'部分的核苷酸序列為序列表中的序列1自5'末端第8924-9584位；所述發光基因不含啟動子；所述卡那霉素抗性基因的核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第7222-8917位；2)將步驟1中構建的DNA分子導入不動桿菌(」c//7etoZacfer5p.)ADP1中，通過同源重組獲得權利要求5所述的重組菌。7、權利要求1至5中任一所述的重組菌在遺傳毒性物質檢測中的應用。8、一種檢測遺傳毒性物質的方法，是將權利要求1至5中任一所述的重組菌與待測溶液混合，培養所述重組菌，通過檢測報道基因表達產物的量來判斷待測溶液是否含有遺傳毒性物質。9、根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述待測溶液中還加入S9肝粒體酶。10、根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述培養溫度為37。C。全文摘要本發明公開了一種表征遺傳毒性的重組菌及其構建方法與應用。該重組菌是染色體的recA基因中含有報道基因的不動桿菌(Acinetobactersp.)ADP1；所述報道基因與recA基因具有共同的啟動子。所述recA基因中還可含有篩選標記基因，所述篩選標記基因位于所述報道基因的3’末端；所述篩選標記基因帶有啟動子。該重組菌暴露于遺傳毒性的物質或具有DNA損傷能力的輻射后，報道基因表達產生報道產物，報道產物的量與遺傳毒性呈劑量效應關系，可被用于評價樣品的遺傳毒性和輻射的DNA損傷強度。文檔編號C12R1/01GK101538549SQ20091008328公開日2009年9月23日申請日期2009年4月30日優先權日2009年4月30日發明者宋一之,李廣賀,巍黃申請人:清華大學