專利名稱：可逆地控制細胞在金層表面的自組裝單層膜上黏附的方法
技術領域：
本發明屬于動態控制細胞黏附于金層表面的自組裝單層膜上的生物學技術領域，特別涉及一種可逆地控制細胞在金層表面的自組裝單層膜上黏附的方法，該可逆地控制細 胞在金層表面的自組裝單層膜上黏附的方法是通過紫外光和可見光任意切換來實現的。
背景技術：
細胞黏附是很重要的生命現象，很多疾病的發生都與細胞黏附息息相關。在表面 上動態地研究細胞的黏附一直是生物學研究中的一個重要方向。目前而言，能動態地控制 細胞在表面的黏附的方法很多，比如通過光照、電化學、加熱、微電極、微流控和表面形態的 變化等，這些方法都很好地實現了動態地控制細胞在表面黏附，但是這些方法都是單向的、 不可逆的，在動態控制細胞黏附的時候，一旦用這些方法使表面性質發生了變化，就無法再 重復利用，就不能達到任意控制細胞在表面黏附的目的，這個缺點嚴重地阻礙了細胞黏附 這個領域的研究。本發明克服了這個難點，真正實現了可逆地控制細胞在黏附表面上的黏 附。
發明內容
本發明目的在于提供一種可逆地控制細胞在金層表面的自組裝單層膜上黏附的 方法，該可逆地控制細胞在金層表面的自組裝單層膜上黏附的方法是通過紫外光和可見光 任意切換來實現的，為研究細胞黏附和遷移相關的工作提供一種可靠的工具。本發明的技術方案如下本發明提供的可逆地控制細胞在金層表面的自組裝單層膜上黏附的方法，其為 先制備黏附于金層表面的自組裝單層膜上的由化合物1與化合物2均勻混合形成的第二自 組裝單層膜，再將經培養的細胞黏附于所述金層表面的第二自組裝單層膜上；所述化合物1的分子式(見圖2)為 所述化合物2分子式(見圖2)為 通過紫外光和可見光的可逆切換，實現細胞在所述金層表面的第二自組裝單層膜 上黏附的可逆控制，其可逆控制如下
用濃度為lmg/mL GRGDS的水溶液浸泡所述金層30分鐘 1小時，黏附于所述金 層表面的第二自組裝單層膜上的細胞從所述金層表面的第二自組裝單層膜上完全脫附；用340-380nm的紫外光照射該金層5 12小時，金層表面的第二自組裝單層膜中 的化合物1的偶氮苯的構象由反式變為順式，所述金層表面的第二自組裝單層膜中的化合 物1的偶氮苯末端的GRGDS肽埋沒在所述第二自組裝單層膜的化合物2中，所述金層表面 的第二自組裝單層膜變為惰性，在該變為惰性的第二自組裝單層膜上培養細胞，只有少許 細胞在該變為惰性的第二自組裝單層膜上黏附；用濃度為lmg/mL GRGDS的水溶液浸泡所述金層30分鐘 1小時，黏附于所述金 層表面的第二自組裝單層膜上的少許細胞完全脫附；再用450-490nm的可見光照射所述金層20分鐘 1小時，金層表面的第二自組裝 單層膜中的化合物1的偶氮苯的構象由順式變為反式，埋沒在所述化合物2中的GRGDS又 伸展到所述第二自組裝單層膜的末端，在該金層表面的第二自組裝單層膜上培養細胞，細 胞又黏附到該金層表面的第二自組裝單層膜上。所述的化合物2的合成步驟如下(見圖3):反應起始物11-巰基十一烷酸的巰基與三苯基氯甲烷以摩爾比1 1.1反應，該 反應在甲苯溶劑中進行，反應過程中加入N，N- 二異丙基乙胺作為催化劑，生成化合物4 ；所 述N，N-二異丙基乙胺的加入量為所述三苯基氯甲烷的兩倍；所生成的化合物4的結構式 為 將化合物4與六聚乙二醇進行酯化進行反應，六聚乙二醇用量為化合物4的16. 7 倍，化合物4選擇性地連接六聚乙二醇的一端，生成化合物10，所生成的化合物10的結構式 為 在含5% (v/v)三氟乙酸的二氯甲烷溶液的脫保護下，以三乙基硅烷作俘獲劑，脫 去化合物10的三苯甲基，得到化合物2;所述三乙基硅烷與化合物10的摩爾比為5 1;所 述化合物2的分子式(見圖2)為 所述的化合物1的合成步驟如下(見圖4，圖5):合成目標化合物3:反應起始物11-巰基十一烷酸的巰基與三苯基氯甲烷以摩爾比1 1.1反應，該 反應在甲苯溶劑中進行，反應過程中加入N，N- 二異丙基乙胺作為催化劑，生成化合物4 ；所 述N，N-二異丙基乙胺的加入量為所述三苯基氯甲烷的兩倍；所生成的化合物4的結構式 為 將化合物4與N-羥基琥珀酰亞胺按1:1.2的摩爾比反應，生成化合物(活化 酯)5，所述化合物5的結構式為 將化合物5以每10秒滴一滴的速率加到2，2-(1，2_ 二氧乙基)雙二乙胺的二氯 甲烷溶液中，化合物5選擇性地與2，2- (1，2- 二氧乙基)雙二乙胺一端的氨基反應，得到化 合物6;所述化合物5與2，2-(1，2_ 二氧乙基)雙二乙胺摩爾比為1 17;所述化合物6的 結構式為 對硝基苯甲酸在5wt%的氫氧化鈉溶液中反應，生成化合物7，所述化合物7為4， 4’_羧基偶氮苯，其結構式為 將化合物7與N-羥基琥珀酰亞胺以摩爾比1 2. 4進行反應，化合物7兩端的羧 基被N-羥基琥珀酰亞胺活化，生成化合物8，所述化合物8結構式為 將化合物8溶解于Ν，Ν_ 二甲基甲酰胺中，加熱60°C使之完全溶解；將化合物6以 每10秒滴一滴的速率滴加到化合物8的N，N- 二甲基甲酰胺溶液中，化合物6選擇性地與 化合物8 —端的活化酯反應，反應6小時生成化合物9 ；所述化合物6與化合物8的摩爾比 為1 15;所述化合物9的結構式為
O.
9在含5% (ν/ν)三氟乙酸的二氯甲烷溶液脫保護下，以三乙基硅烷作俘獲劑，脫去 化合物9的三苯甲基，得到化合物3;所述三乙基硅烷與化合物9的摩爾比為5 1;所述化合物3的分子式(見附圖2)為 將玻璃片基底清洗干凈，吹干；在該玻璃片基底的表面上先蒸鍍2 IOnm厚的鈦 黏附層，然后再在鈦黏附層上蒸鍍20 50nm厚的金層；將所得化合物3配制成ImM IOmM的乙醇溶液，在氮氣保護下，用可見光照射該 溶液3 5小時，再在黑暗的環境中室溫下放置3 7天，確保化合物3的偶氮苯的構型全 部變為反式；將所得化合物2溶解于的無水乙醇中，使其摩爾濃度為ImM IOmM ；將所述的偶氮苯構型全部變為反式的化合物3的乙醇溶液與所述化合物2的乙醇 溶液均勻混合成混合溶液，混合溶液中的偶氮苯構型全部變為反式的化合物3與化合物2 的摩爾比為1 100 1 10000 ；所述混合溶液的總摩爾濃度為2mM ；將上述蒸鍍有金層的玻璃片基底置入所述混合溶液中浸泡4 12小時，取出玻璃 片基底，用無水乙醇洗3遍，再用氮氣吹干，得到共價連接于所述玻璃片基底的金層表面的 由所述化合物2與所述偶氮苯構型全部變為反式的化合物3均勻混合而形成的第一自組裝 單層膜；將GRGDS肽連接到所述第一自組裝單層膜中的構型全部變為反式的化合物3的偶 氮苯末端將GRGDS肽溶解于pH 8. 0的磷酸緩沖液中，使其濃度為2mg/mL，將上述共價連接 了第一自組裝單層膜的玻璃片基底置入該磷酸緩沖液中，反應5 20分鐘，GRGDS上甘氨 酸的伯胺基與所述第一自組裝單層膜上化合物3的偶氮苯末端的活化酯反應，通過化學鍵 共價連接到所述第一自組裝單層膜中的構型全部變為反式的化合物3的偶氮苯的末端，得 到化合物1。本發明提供的可逆地控制細胞在金層表面的自組裝單層膜上黏附的方法，利用偶 氮苯類化合物良好的光學特性，在偶氮苯的頭端共價連接含有巰基的烷基鏈，使之與抗細 胞黏附的聚乙二醇以一定比例混合，在金層表面形成自組裝單層膜，所述偶氮苯的末端與 非特異性黏附細胞的甘氨酸_精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸(GRGDS)共價結合；通過 紫外光照金層表面的自組裝單層膜，所述金層表面的自組裝單層膜中的偶氮苯的構象由反 式變為順式，所述偶氮苯末端的GRGDS被埋沒在抗細胞黏附的聚乙二醇中，被紫外光光照 過的金層表面的自組裝單層膜表現為抗細胞黏附，當換用可見光照所述金層后，所述金層 表面的自組裝單層膜中的順式構象的偶氮苯變為反式構象，被埋沒在聚乙二醇中的GRGDS 便可伸展至所述自組裝單層膜上端，細胞便黏附到金層表面的自組裝單層膜上。此過程是 可逆的，在時空上可以任意調控(見圖1)，這將為研究細胞與細胞外基質相互作用以及研 究多細胞之間的相互作用提供一個有效的工具，為研究與細胞黏附和遷移相關的疾病打下 可靠基礎。
本發明的優點相比較其他動態控制細胞在表面黏附的方法而言，本發明最大的 優點是實現了可逆地控制細胞在其黏附表面的自組裝單層膜上的黏附，通過選擇可見光或 者紫外光，便可實現對細胞黏附的任意調控；而且該方法簡單快速，易于操作。
圖1為發明內容，細胞黏附在金層表面的第二自組裝單層膜上(該第二自組裝單 層膜中的偶氮苯的構象為反式)，經過340nm 380nm的紫外光照射所述第二自組裝單層 膜，膜中的偶氮苯的構象由反式變為順式，所述偶氮苯末端的GRGDS被埋沒在抗細胞黏附 的聚乙二醇中，被紫外光照的第二自組裝單層膜表現為抗細胞黏附。當換用450nm 490nm 可見光照射偶氮苯處于順式構象的第二自組裝單層膜后，順式構象的偶氮苯變為反式構 象，被埋沒的GRGDS便可伸展至第二自組裝單層膜上端，細胞便可以黏附到金層表面的第 二自組裝單層膜上。此過程是可逆的，在時空上可以任意調控；圖2為化合物1、化合物2和化合物3的化學結構式；圖3為合成化合物2的合成路線；圖4為合成化合物3的合成路線；圖5為將GRGDS連接到第一自組裝單層膜上的化合物3的偶氮苯末端的示意圖；圖6為細胞黏附在不同比例、不同構型的第二自組裝單層膜上的示意圖；圖7為細胞可逆地黏附在含有不同構型偶氮苯的第二自組裝單層膜上的示意圖；圖8為圖7所描述的細胞黏附的示意圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的說明。實施例11)目標化合物2的合成1. 1)化合物4的合成 其步驟如下1.將IOOmL的兩口燒瓶(19#)抽真空，充入氮氣；2.氮氣保護下向上述已抽真空的兩口燒瓶中加入50mL甲苯，將三苯基氯甲烷 (4. 60g，16. 5mmol)和N，N-二異丙基乙胺_A，4. 20g,33. Ommol)溶解于該甲苯里面，磁 力攪拌下加入11-巰基i^一烷酸(3. OOg, 13. Smmol)，氮氣保護下在室溫反應5小時。3.反應畢，將溶劑甲苯減壓蒸出，向殘余的產物中加入50mL 二氯甲烷，充分溶解 后，用飽和食鹽水(3X100mL)洗三次，再用無水硫酸鈉干燥二氯甲烷溶液，靜置過夜；4.過濾去掉干燥劑無水硫酸鈉，將濾液減壓蒸餾，濃縮得的到化合物的粗品；5.用少許二氯甲烷溶解所得化合物4的粗品后，用柱層析的方法進行純化；洗脫 劑為石油醚乙酸乙酯=10 l(v/v)，最后得到化合物4純品，該化合物4純品為無色油狀液體，共5. 80g(12. 6mmol)，產率為92% ；1. 2)化合物10的合成 其步驟如下1.向一個25mL的錐形瓶(19#)中加入5mL無水二氯甲烷，將1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC-HC1，1. 15g,6. Ommol)和催化量的4-二甲氨基吡啶 (DMAP)加入該無水二氯甲烷中，磁力攪拌使之盡可能溶解，向該溶液中加入化合物4，該混 合溶液在室溫攪拌5分鐘；2.攪拌下將六聚乙二醇(EG6，13. 4mL, 100. Ommol)加入裝有50mL無水二氯甲烷的
單口燒瓶里面，充分攪拌；3.將1中所述混合溶液轉移到滴液漏斗中，攪拌下緩慢地滴加到含有六聚乙二醇 的二氯甲烷溶液中，滴加完畢后，室溫反應12小時；4.反應畢，用0. lM(2X50mL)鹽酸洗反應混合溶液兩次，再用二氯甲烷洗一遍水 相，將有機相混合后，再用飽和食鹽水(100mL)洗一次，用無水硫酸鈉干燥有機相，靜置過 夜；5.過濾去掉干燥劑無水硫酸鈉，將濾液減壓蒸餾，濃縮得到化合物10粗品；6.用少許二氯甲烷溶解該粗品后，用柱層析的方法進行純化；洗脫劑為氯仿甲 醇=80 l(v/v)，最后得到化合物10純品，其為無色油狀液體，共2. 87g (4. Ommol)，產率 為 79% ；1. 3)化合物2的合成 其步驟如下1、將50mL的兩口燒瓶(19#)抽真空，充入氮氣；2、氮氣保護下將1. 5mL三氟乙酸(TFA)加入28. 5mL無水二氯甲烷里，得到5% (v/ v)的三氟乙酸溶液；攪拌下向該溶液中加入化合物10(1. 00g, 1. 4mmol)，得到淺綠色反應 液，加入三乙基硅烷(TESi，l. lmL，6. 9mmol)后，反應液由綠色變為無色；3.該反應在氮氣保護下反應4小時后，減壓蒸餾除去溶劑；4.將殘余物用少許二氯甲烷溶解后上樣，進行柱層析分離，洗脫劑為石油醚乙 酸乙酯丙酮乙酸=15 1 1 0. l(v/v)，得到目標物化合物2純品，其為無色油狀 液體，共 0. 4g(0. 83mmol)，產率為 60% ；
2)目標化合物3的合成2. 1)化合物5的合成 其步驟如下1.向一個50mL的單口燒瓶(19#)中加入步驟1. 1)合成的化合物4(1.50g， 3. 3mmol)，EDC-HC1 (0. 69g，3. 6mmol)催化量的DMAP，加入25mL無水二氯甲烷，磁力攪拌使 之溶解，最后向該混合液中加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，0.45g，3.9mmol)；2.該混合溶液在5°C攪拌一個小時，隨后在室溫下反應24小時；3.反應畢，用25mL二氯甲烷稀釋反應液，再用飽和食鹽水(3X50mL)洗三次，用無 水硫酸鈉干燥有機相，濃縮得到化合物5 (1. 80g, 3. 23mmol)，該化合物5為所述化合物4的 活化酯；產率為99% ；2. 2)化合物6的合成 其步驟如下1.將2，2-(1，2_ 二氧乙基)雙二乙胺(8mL，55mmol)溶解到無水二氯甲烷中，形 成混合溶液，攪拌下向該混合溶液中緩慢滴加化合物5(1. 80g，3. 23mmol)的二氯甲烷溶液 10mL，滴加完畢后，再在室溫下反應過夜；2.用50mL 二氯甲烷稀釋反應液，再用飽和食鹽水(3 X 50mL)洗有機相三次，用無 水硫酸鈉干燥有機相，減壓濃縮，得到化合物6粗品；3.用少許二氯甲烷溶解化合物6粗品后上樣，進行柱層析分離，洗脫劑為氯 仿甲醇氨水=20 1 0.05(v/v)，得到化合物6純品，其為無色油狀液體，共 1. 78g(3. Ommol)，產率為 94% ；2. 3)化合物7的合成 其步驟如下1.先稱取50g氫氧化鈉溶解于225mL蒸餾水中，再稱取對硝基苯甲酸15g加入該 氫氧化鈉溶液，加熱該溶液使固體溶解；2.稱取100g葡萄糖溶解于150mL水溶液中，加熱使之溶解；3.在50°C下將葡萄糖溶液滴加到上述對硝基苯甲酸溶液中，剛開始反應液中有黃色沉淀析出，繼續滴加葡萄糖溶液，沉淀變為褐色，最后直至變為黑色；4.該黑色反應液在50°C反應過夜，靜置，析出亮褐色沉淀；5.過濾，將沉淀溶解于水中，得酒紅色溶液，往溶液中滴加醋酸，直至析出粉紅色 的沉淀；6.過濾，用大量水洗沉淀，干燥，得到終產物(化合物7) 6. 18g(22. 9mmol)，產率為 51% ；2. 4)化合物8的合成 其步驟如下1.將化合物7(3.00g，ll. Immo 1)溶解于IOOmL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，力口 熱60°C使之絕大部分溶解；2.向該溶液中依次加入 NHS(3. 07g，26. 7mmol)，EDC-HCl (5. 12g,26. 7mmol)和催 化量的DMAP，該混合溶液在室溫下反應12小時；3.反應畢，向反應液中邊攪拌邊加入大量蒸餾水，直至有紅色沉淀析出。4.過濾，再用大量水洗沉淀多次，烘箱中干燥，得到亮紅色的粉末(化合物8)共 4. 85g(10. 4mmol)，產率為 94% ；2. 5)化合物9的合成 其步驟如下1.稱取化合物8(2. OOg, 4. 3mmol)溶解于20mLDMF中，加熱60°C使之完全溶解；2.將化合物6(0. 17g，0. 29mmol)溶解于5mL無水二氯甲烷中，然后緩慢滴加到化 合物8的DMF溶液；該反應在室溫下反應過夜；3.反應完畢，通過減壓蒸餾將反應溶劑DMF除去，用30mL 二氯甲烷溶解殘留物，過 濾除去沒有溶解的部分，該部分為多余的化合物8 ；4.將濾液濃縮，進行柱層析分離，洗脫劑為氯仿甲醇=80 l(v/v)，得到化合 物9純品，其為暗紅色顆粒，共0. 21g(0. 22mmol)，產率為76% ；2. 6)化合物3的合成 其步驟如下1.將25mL的兩口燒瓶(19#)抽真空，充入氮氣；2.氮氣保護下將0. 5mL三氟乙酸(TFA)加入9. 5mL無水二氯甲烷里，得到5% (ν/ ν)的三氟乙酸溶液；攪拌下向該溶液中加入化合物9(0.23g，0.25mmol)，隨后加入三乙基 硅烷(TESi，202yL，1.25mmol)，反應液為紅色；3.該反應在氮氣保護下反應4小時后，減壓蒸餾除去溶劑，將殘余物用少許二氯 甲烷溶解后上樣，進行柱層析分離，洗脫劑為氯仿甲醇=60 1 (ν/ν)，得到化合物3純 品，其為紅色油狀液體，共0. 14g(0. 20mmol)，產率為81% ；。3)第一自組裝單層膜的制備3. 1)將玻璃片清洗干凈，吹干；在該玻璃基底的表面上先蒸鍍2 IOnm厚的鈦黏 附層，然后再在其上蒸鍍20 50nm厚的金層；3. 2)將2. 6)中所得化合物3配制成2mM的乙醇溶液，在氮氣保護下，用可見光照 射該溶液5小時，再在黑暗的環境中室溫下放置3天，確保化合物3的偶氮苯的構型全部變 為反式；3. 3)將1. 3)中所得化合物2溶解于的無水乙醇中，使其摩爾濃度為2mM ；3. 4)將3. 2)所述的化合物3的乙醇溶液與3. 3)所述化合物2的乙醇溶液按摩爾 比為1 1000均勻混合成混合溶液，總的摩爾濃度為2mM;3. 5)將3. 1)所述金層置入3. 4)所述混合溶液中浸泡4小時，取出金層，用無水乙 醇洗3遍，再用氮氣吹干，得到共價連接于所述金層上的由所述化合物2與所述化合物3均 勻混合而形成的第一自組裝單層膜；4)將GRGDS肽連接到3. 5)所述的金層表面的偶氮苯末端(見圖5)4. 1)配制PBS緩沖液(pH 7. 4)，配制pH 8. 0、pH 8. 6的磷酸緩沖液；4. 1)將GRGDS肽溶解于4. 1)所述pH 8. 0的磷酸緩沖液中，使其濃度為lmg/mL ；4. 3)將3. 5)所述金層置入4. 1)所述的GRGDS溶液中，反應20分鐘，GRGDS上的 甘氨酸的伯胺基與金層表面的第一自組裝單層膜中的偶氮苯末端的活化酯反應，通過化學 鍵共價連接到偶氮苯的末端；4. 4)取出金層，先用PBS緩沖液洗3遍，再用pH 8. 6的磷酸緩沖液洗3遍，隨后再 用PBS緩沖液洗3遍，再用三次水洗和無水乙醇各洗3遍，最后用惰性氣體把金層吹干，最 終在所述金層上形成由化合物1與化合物2均勻混合形成的第二自組裝單層膜。這些操作都盡量在黑暗的環境中進行，以確保金層上偶氮苯的構象不會發生太大 的改變；5)細胞培養
使用DMEM高糖培養基培養小鼠NIH 3T3成纖維細胞，培養基中含有10% (v/v)胎 牛血清和(v/v)青霉素或鏈霉素，細胞密度為105個/mL，在37°C條件下，通入二氧化碳 使培養環境中二氧化碳的體積濃度為5% (v/v)，培養30 60分鐘；6)光化學控制細胞在金層表面的自組裝單層膜上可逆的黏附6. 1)將步驟5)所述的細胞加入到步驟4. 4)所得的金層表面的第二自組裝單層膜 上，將細胞在該第二自組裝單層膜上進行培養，細胞黏附在該第二自組裝單層膜上；6.2)用GRGDS(lmg/mL)的水溶液使6. 1)所述第二自組裝單層膜上的細胞完全脫 附，再用340-380nm的紫外光照射所述第二自組裝單層膜10小時，使所述第二自組裝單層 膜中的化合物1的偶氮苯的構象由反式變為順式，所述偶氮苯末端的GRGDS肽埋沒在化合 物2中，該第二自組裝單層膜變為惰性，將細胞培養在該惰性的第二自組裝單層膜上，只有 很少的細胞在該惰性第二自組裝單層膜上黏附。6.3)用GRGDS(lmg/mL)水溶液使6. 2)所述惰性的第二自組裝單層膜上的少許黏 附的細胞完全脫附，再用450-490nm的可見光照射該惰性的第二自組裝單層膜1小時，使所 述惰性的第二自組裝單層膜中的化合物1的偶氮苯的構象由順式變為反式，埋沒在化合物 2中的GRGDS又伸展到所述第二自組裝單層膜的末端，在該第二自組裝單層膜上培養細胞 之后，細胞又能黏附到該第二自組裝單層膜上。通過紫外光和可見光的可逆切換，可以得到不同性質的第二自組裝單層膜，從而 實現任意地控制細胞在金層表面的自組裝單層膜上的黏附(見圖7和圖8)。實施例2本實施的步驟1)、2)、3)、4)與實施例1中的步驟1)、2)、3)、4)相同；步驟5)培養犬腎(MDCK)細胞，培養條件與實施例1中的步驟5) —樣；本實施例的步驟6)與實施例1中的步驟6)相同。實施例3本實施的步驟1)、2)、3)、4)與實施例1中的步驟1)、2)、3)、4)相同；步驟5)培養HeLa細胞(人宮頸癌細胞)，培養條件與實施例1步驟5)相同；本 實施例的步驟6)與實施例1中的步驟6)相同。
權利要求
一種可逆地控制細胞在金層表面的自組裝單層膜上黏附的方法，其步驟為先制備可共價連接于金層表面的由化合物1與化合物2均勻混合形成的第二自組裝單層膜，再將經培養的細胞黏附于所述金層表面的第二自組裝單層膜上；所述化合物1的分子式為所述化合物2分子式為通過紫外光和可見光對金層表面的第二自組裝單層膜照射的切換，實現細胞在所述金層表面的第二自組裝單層膜上的可逆控制；其可逆控制如下用濃度為1mg/mL甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸的水溶液浸泡所述金層30分鐘～1小時，黏附于所述金層表面的第二自組裝單層膜上的細胞從所述第二自組裝單層膜上完全脫附；所述甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸簡稱為GRGDS；用340-380nm的紫外光照射該金層表面的第二自組裝單層膜5～12小時，所述第二自組裝單層膜中的化合物1的偶氮苯的構象由反式變為順式，所述化合物1的偶氮苯末端的GRGDS肽埋沒在所述化合物2中，所述金層表面的第二自組裝單層膜變為惰性，在該變為惰性的第二自組裝單層膜上培養細胞，只有少許細胞在該變為惰性的第二自組裝單層膜上黏附；用濃度為1mg/mL GRGDS的水溶液浸泡所述金層30分鐘～1小時，黏附于所述第二自組裝單層膜上的少許細胞完全脫附；再用450-490nm的可見光照射所述金層表面的第二自組裝單層膜20分鐘～1小時，金層表面的第二自組裝單層膜中的化合物1的偶氮苯的構象由順式變為反式，埋沒在所述化合物2中的GRGDS又伸展到所述第二自組裝單層膜的末端，在該金層表面的第二自組裝單層膜上培養細胞，細胞又黏附到該金層表面的第二自組裝單層膜上。F2009100826330C0000011.tif,F2009100826330C0000012.tif
2.按權利要求1所述的可逆地控制細胞在金層表面的第二自組裝單層膜上黏附的方 法，其特征在于，所述的化合物2的合成步驟如下反應起始物11-巰基十一烷酸的巰基與三苯基氯甲烷以摩爾比1 1.1反應，該反應在甲苯溶劑中進行，反應過程中加入N，N-二異丙基乙胺作為催化劑，生成化合物4;所述N，N- 二異丙基乙胺的加入量為所述三苯基氯甲烷的兩倍；所生成的化合物4的結構式為 將化合物4與六聚乙二醇進行酯化進行反應，六聚乙二醇用量為化合物4的16. 7倍， 化合物4選擇性地連接六聚乙二醇的一端，生成化合物10，所生成的化合物10的結構式 為 在含5% (ν/ν)三氟乙酸的二氯甲烷溶液的脫保護下，以三乙基硅烷作俘獲劑，脫去化 合物10的三苯甲基，得到化合物2;所述三乙基硅烷與化合物10的摩爾比為5 1 ； 所述的化合物1的合成步驟如下 先合成目標化合物3:反應起始物11-巰基十一烷酸的巰基與三苯基氯甲烷以摩爾比1 1.1反應，該反應在甲苯溶劑中進行，反應過程中加入Ν，Ν-二異丙基乙胺作為催化劑，生成化合物4;所述N，N-二異丙基乙胺的加入量為所述三苯基氯甲烷的兩倍；所生成的化合物4的結構式為 將化合物4與N-羥基琥珀酰亞胺按1:1.2的摩爾比反應，生成化合物(活化酯)5， 所述化合物5的結構式為 將化合物5以每10秒滴一滴的速率加到2，2-(1，2-二氧乙基)雙二乙胺的二氯甲烷 溶液中，化合物5選擇性地與2，2- (1，2- 二氧乙基)雙二乙胺一端的氨基反應，得到化合物 6 ；所述化合物5與2，2-(1，2_ 二氧乙基)雙二乙胺摩爾比為1 17;所述化合物6的結構 式為 對硝基苯甲酸在5wt %的氫氧化鈉溶液中反應，生成化合物7，所述化合物7為4， 4’_羧基偶氮苯，其結構式為 將化合物7與N-羥基琥珀酰亞胺以摩爾比1 2. 4進行反應，化合物7兩端的羧基被 N-羥基琥珀酰亞胺活化，生成化合物8，所述化合物8結構式為 將化合物8溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，加熱60°C使之完全溶解；將化合物6以每 10秒滴一滴的速率滴加到化合物8的N，N- 二甲基甲酰胺溶液中，化合物6選擇性地與化 合物8 —端的活化酯反應，反應6小時生成化合物9 ；所述化合物6與化合物8的摩爾比為 1 15 ；所述化合物9的結構式為 在含5% (y/Y)三氟乙酸的二氯甲烷溶液脫保護下，以三乙基硅烷作俘獲劑，脫去化合 物9的三苯甲基，得到化合物3;所述三乙基硅烷與化合物9的摩爾比為5 1;所述化合物 3的結構式為 將玻璃片基底清洗干凈，吹干；在該玻璃片基底的表面上先蒸鍍2 IOnm厚的鈦黏附 層，然后再在鈦黏附層上蒸鍍20 50nm厚的金層；將所得化合物3配制成ImM IOmM的乙醇溶液，在氮氣保護下，用可見光照射該溶液 3 5小時，再在黑暗的環境中室溫下放置3 7天，確保化合物3的偶氮苯的構型全部變 為反式；將所得化合物2溶解于的無水乙醇中，使其摩爾濃度為ImM IOmM ； 將所述的偶氮苯構型全部變為反式的化合物3的乙醇溶液與所述化合物2的乙醇溶液 均勻混合成混合溶液，混合溶液中的偶氮苯構型全部變為反式的化合物3與化合物2的摩 爾比為1 100 1 10000 ；所述混合溶液的總摩爾濃度為2mM ；將上述蒸鍍有金層的玻璃片基底置入所述混合溶液中浸泡4 12小時，取出玻璃片基 底，用無水乙醇洗3遍，再用氮氣吹干，得到附著于所述玻璃片基底的金層上的由所述化合 物2與所述偶氮苯構型全部變為反式的化合物3均勻混合而形成的第一自組裝單層膜； 將GRGDS連接到所述第一自組裝單層膜中的構型全部變為反式的化合物3的偶氮苯末端將GRGDS肽溶解于pH 8. 0的磷酸緩沖液中，使其濃度為2mg/mL，將上述共價連接了第 一自組裝單層膜的玻璃片基底置入該磷酸緩沖液中，反應5 20分鐘，GRGDS上甘氨酸的 伯胺基與第一自組裝單層膜上的、構型全部變為反式的化合物3的偶氮苯末端的活化酯反 應，通過化學鍵共價連接到所述第一自組裝單層膜上的、構型全部變為反式的化合物3的 偶氮苯的末端，得到化合物1。
3.按權利要求1或2所述的可逆地控制細胞在金層表面的第二自組裝單層膜上黏附的 方法，其特征在于，所述第二自組裝單層膜的制備如下配制PH 7. 4的PBS緩沖液、pH 8. 0的磷酸緩沖液和pH 8. 6的磷酸緩沖液； 將GRGDS肽溶解于所述pH 8. 0的磷酸緩沖液中，制得含GRGDS的磷酸緩沖液，所述 GRGDS肽在GRGDS的磷酸緩沖液的濃度為lmg/mL ；將所述共價連接了第一自組裝單層膜的金層置入所述GRGDS的磷酸緩沖液中，反應20 分鐘，GRGDS上的甘氨酸的伯胺基與所述金層表面的第一自組裝單層膜中的化合物3的末端的活化酯反應，通過化學鍵共價連接到所述金層表面的第一自組裝單層膜中的化合物3 的末端； 取出金層，先用PBS緩沖液洗3遍，再用pH8. 6的磷酸緩沖液洗3遍，隨后再用PBS緩 沖液洗3遍，再用水和無水乙醇各沖洗3遍，最后用惰性氣體把金層吹干，得到共價連接于 金層表面的由化合物1與化合物2均勻混合形成的第二自組裝單層膜。
全文摘要
一種可逆地控制細胞在金層表面的自組裝單層膜上的黏附的方法，其步驟為先制備可共價連接于金層表面的由化合物1與化合物2均勻混合形成的自組裝單層膜，再將經培養的細胞黏附于所述金層表面的自組裝單層膜上。化合物1的分子式為化合物2分子式為通過紫外光和可見光對金層表面的自組裝單層膜照射的切換，實現細胞在所述金層表面的自組裝單層膜上的可逆控制；而且該方法簡單快速，易于操作。
文檔編號C12N11/14GK101870970SQ20091008263
公開日2010年10月27日 申請日期2009年4月23日 優先權日2009年4月23日
發明者劉定斌, 蔣興宇, 謝赟燕 申請人:國家納米科學中心