專利名稱：利用高活性生物酶合成d-苯丙氨酸的制備工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及使用酶制備含氮有機化合物的方法，具體地說是利用高活性生物酶合 成D-苯丙氨酸的制備工藝。
背景技術：
D-苯丙氨酸是重要的非天然氨基酸，在醫藥和食品領域具有重要的應用價值，是 國際上目前最具發展前景的II型糖尿病治療藥物那格列奈(NategliniDe，又稱Marlix) 的前體，顯示了極好的應用前景。它又是治療腫瘤藥物的中間體，另外，D-苯丙氨酸還用于 減肥等保健品。而目前D-苯丙氨酸的生產主要采用拆分法工藝，其具有生產規模小、收率 低、成本高，難以滿足國內外市場的需求。
發明內容
本發明的目的就是提供一種利用高活性生物酶合成D-苯丙氨酸的制備工藝，以 合成光學純度高，產品質量好的D-苯丙氨酸。本發明是這樣實現的(1)多元培養基培養Psudomonas No. 1菌種a) 一級發酵發酵液中按重百分比計含液糖2%，玉米漿2%，氯化鈉0. 3%，硫酸 銨0. 1-0. 12%，PH值為6. 7-7. 0，溫度35_37°C，培養時間20小時；b) 二級發酵發酵液中按重百分比計含液糖2%，玉米漿2%，氯化鈉0. 3%，硫酸 銨0. 1-0. 12%，硫酸鎂0. 05-0. 06%，PH值為6. 7-7. 0，溫度35-37°C，培養時間20小時；c)三級發酵發酵液中按重百分比計含液糖2%，玉米漿2%，氯化鈉0. 3%，硫酸 銨 0. 1-0. 12%，硫酸鎂 0. 05-0. 06%，氯化鈷 0. 01-0. 02%，誘導劑 2. 0%，ΡΗ 值為 6. 7-7. 0， 溫度35-37°C，培養時間16小時；(2)絮凝收集菌絲體，將收集的菌絲體投入轉化罐，同時投入5芐基海因，5芐基海 因重量為絮凝前發酵液總重量的1/5-1/6 ；轉化罐采用氮氣保護，壓力為0. 1-0. 2公斤，轉 化溫度90°C，攪拌速度120轉/分鐘，PH值保持在8，轉化時間M小時；(3)常規收集轉化清液，經后提煉、濃縮蒸發、結晶、離心、干燥得成品。在上述技術方案下，本發明可以這樣實現在三級發酵中，培養16小時后檢測發酵液，待酶活1. 0，生物量0. 8時進行絮凝并 收集菌絲體。轉化時分批加入5芐基海因，維持底物濃度按重百分比計在3-4%。本發明的發酵培養基中提供了適量的氮源和無機鹽以及適宜的發酵工藝，使得 Psudomonas No. 1菌種發酵后可產生高酶活的D-海因酶及N-氨甲酰基酶。由于兩種酶的 酶活均可達1. 0，生物量可達0. 8，而且選用了適宜的轉化溫度，因而使得酶對底物的轉化 率穩定在99-100%，進而使D-苯丙氨酸的產品收率可達84-86%。
具體實施例方式本發明實施方式中所有百分比均為重量百分比。實施例1(1)以多元培養基培養I^udomonas No. 1菌種得到發酵液。各級發酵液消毒工藝 消毒蒸汽溫度120-130°C，壓力1.2-1. 5公斤/cm2，消毒時間為30分鐘。三級發酵的工藝 控制條件分別為a、一級發酵發酵液中液糖2%，玉米漿2%，氯化鈉0. 3%，硫酸銨0. 1%，余量為 水。使用鹽酸，液堿調節PH值為6. 7-7.0。發酵溫度35-37°C，攪拌轉速60轉/分鐘，培養 時間20小時；b、二級發酵發酵液中液糖2 %，玉米漿2 %，氯化鈉0. 3 %，硫酸銨0. 1 %，硫酸鎂 0.06%，余量為水。使用鹽酸，液堿調節PH值為6. 7-7.0。發酵溫度35-37°C，攪拌轉速60 轉/分鐘，培養時間20小時；c、三級發酵發酵液中液糖2%，玉米漿2%，氯化鈉0.3%，硫酸銨0. 1%，硫酸鎂 0. 05%，氯化鈷0. 02%，誘導劑甲硫乙基海因2. 0%，余量為水。使用鹽酸，液堿調節PH值 為6. 7-7. 0。發酵溫度35-37°C，攪拌轉速60轉/分鐘，培養時間16小時。(2)檢測發酵液，酶活為1.0，生物量0.8時向發酵液內加入絮凝劑聚丙烯酰胺 2%，收集菌絲體，將收集的菌絲體投入轉化罐，同時投入5芐基海因。底物5芐基海因總重 量為絮凝前發酵液總重量的1/5-1/6。轉化過程中5芐基海因分批投入，保持底物濃度4%。 轉化罐采用氮氣保護，壓力為0. 1-0. 2公斤，轉化溫度90°C，攪拌速度120轉/分鐘，PH值 保持在8，轉化時間M小時，底物5芐基海因轉化率99%。(3)常規收集轉化清液，依次經后提煉、濃縮蒸發、結晶、離心、干燥得成品，D-苯 丙氨酸的產品收率可達85%。實施例2(1)以多元培養基培養I^udomonas No. 1菌種得到發酵液。各級發酵液消毒工藝 消毒蒸汽溫度120-130°C，壓力1.2-1. 5公斤/cm2，消毒時間為30分鐘。三級發酵的工藝 控制條件分別為a、一級發酵發酵液中液糖2%，玉米漿2%，氯化鈉0. 3%，硫酸銨0. 1%，余量為 水。使用鹽酸，液堿調節PH值為6. 7-7.0。發酵溫度35-37°C，攪拌轉速60轉/分鐘，培養 時間20小時；b、二級發酵發酵液中液糖2%，玉米漿2%，氯化鈉0.3%，硫酸銨0. 12%，硫酸鎂 0.05%，余量為水。使用鹽酸，液堿調節PH值為6. 7-7.0。發酵溫度35-37°C，攪拌轉速60 轉/分鐘，培養時間20小時；C、三級發酵發酵液中液糖2%，玉米漿2%，氯化鈉0. 3%，硫酸銨0. 1%，硫酸鎂 0. 05%，氯化鈷0. 01%，誘導劑甲硫乙基海因2. 0%，余量為水。使用鹽酸，液堿調節PH值 為6. 7-7. 0。發酵溫度35-37°C，攪拌轉速60轉/分鐘，培養時間16小時。(2)檢測發酵液，酶活為1.0，生物量0.8時向發酵液內加入絮凝劑聚丙烯酰胺 2%，收集菌絲體，將收集的菌絲體投入轉化罐，同時投入5芐基海因。底物5芐基海因總重 量為絮凝前發酵液總重量的1/5-1/6。轉化過程中5芐基海因分批投入，保持底物濃度3%。 轉化罐采用氮氣保護，壓力為0. 1-0. 2公斤，轉化溫度90°C，攪拌速度120轉/分鐘，PH值保持在8，轉化時間M小時，底物5芐基海因轉化率100%。 (3)常規收集轉化清液，依次經后提煉、濃縮蒸發、結晶、離心、干燥得成品，D-苯 丙氨酸的產品收率可達84 %。
權利要求
1.一種利用高活性生物酶合成D-苯丙氨酸的制備工藝，其特征在于采用以下步驟制成(1)多元培養基培養PsudomonasNo. 1菌種a)一級發酵發酵液中按重百分比計含液糖2%，玉米漿2%，氯化鈉0.3%，硫酸銨 0. 1-0. 12%，PH 值為 6. 7-7. 0，溫度 35_37°C，培養時間 20 小時；b)二級發酵發酵液中按重百分比計含液糖2 %，玉米漿2 %，氯化鈉0. 3 %，硫酸銨 0. 1-0. 12%，硫酸鎂 0. 05-0. 06%，PH 值為 6. 7-7. 0，溫度 35-37°C，培養時間 20 小時；c)三級發酵發酵液中按重百分比計含液糖2%，玉米漿2%，氯化鈉0.3%，硫酸銨 0. 1-0. 12%，硫酸鎂 0. 05-0. 06%，氯化鈷 0. 01-0. 02%，誘導劑 2. 0%，ΡΗ 值為 6. 7-7. 0，溫 度35-37°C，培養時間16小時；(2)絮凝收集菌絲體，將收集的菌絲體投入轉化罐，同時投入5芐基海因，5芐基海因重 量為絮凝前發酵液總重量的1/5-1/6 ；轉化罐采用氮氣保護，壓力為0. 1-0. 2公斤，轉化溫 度90°C，攪拌速度120轉/分鐘，PH值保持在8，轉化時間M小時；(3)常規收集轉化清液，經后提煉、濃縮蒸發、結晶、離心、干燥得成品。
2.根據權利要求1所述的高活性生物酶合成D-苯丙氨酸的制備工藝，其特征在于在三 級發酵中，培養16小時后檢測發酵液，待酶活1. 0，生物量0. 8時進行絮凝并收集菌絲體。
3.根據權利要求2所述的高活性生物酶合成D-苯丙氨酸的制備工藝，其特征在于轉化 時分批加入5芐基海因，維持底物濃度按重量百分比計在3-4%。
全文摘要
本發明公開了一種利用高活性生物酶合成D-苯丙氨酸的制備工藝，其步驟為利用多元培養基培養Psudomonas No.1菌種，絮凝收集菌絲體，將收集的菌絲體投入轉化罐，同時投入5芐基海因，5芐基海因重量為絮凝前發酵液總重量的1/5-1/6；轉化罐采用氮氣保護，壓力為0.1-0.2公斤，轉化溫度90℃，攪拌速度120轉/分鐘，pH值保持在8，轉化時間24小時；常規收集轉化清液，經后提煉、濃縮蒸發、結晶、離心、干燥得成品。本發明中，菌種發酵后可產生高酶活的D-海因酶及N-氨甲酰基酶。而且經適宜的轉化溫度轉化，酶對底物的轉化率穩定在99-100％，進而使D-苯丙氨酸的產品收率可達84-86％。
文檔編號C12R1/38GK102041283SQ200910075630
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月9日 優先權日2009年10月9日
發明者崔傳僧 申請人:崔傳僧