專利名稱：：利用甲烷氧化細菌生產甲烷氧化菌素的制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種利用曱烷氧化細菌生產曱烷氧化菌素的制備方法。
背景技術：
：超氧化物歧化酶(SOD)可通過清除超氧化物自由基而達到抗氧化效果，目前已允許SOD作為食品添加劑使用，然而，SOD是一種蛋白質酶，所以在溶液中很不穩定，在受到外界各種物理化學因素的影響時，也會像其它酶蛋白分子那樣發生亞基的解聚、變性或其它方面的構象變化。伴隨著結構的改變必然導致酶活性的下降或喪失。另外，由于動植物中S0D含量低，提取量非常小，因此作為食品添加劑價格過于昂貴。而釆用化學合成法生產的S0D模擬酶雖然產量可能會提高，但往往活性小、非天然、可能還具有毒性等，相比較而言，由于微生物生長快、培養容易，容易工業化，因此利用微生物生產具有超氧化物歧化酶活性的天然抗氧化劑的技術具有廣闊的應用前景。曱烷氧化菌素是一種小分子熒光蛋白，來自于甲烷氧化細菌。與銅結合后的曱烷氧化菌素具有較強的超氧化物歧化酶活性，分子量小，結構穩定，是非常有潛力的天然食品抗氧化劑資源。曱烷氧化細菌能夠通過曱烷單加氧酶開始的一個酶系將甲烷最終代謝成二氧化碳和水，并在此過程中獲得生長所需的碳源和能源，甲烷氧化細菌的生長和曱烷單加氧酶的合成受到銅的調節，銅在曱烷氧化細菌中扮演著重要的生物學角色。曱烷氧化細菌能夠分泌對銅具有強親和力的曱烷氧化菌素捕捉周圍環境中的銅，與銅結合的曱烷氧化菌素會被曱烷氧化細菌識別而重新回到細胞中從而起到富集銅的作用。當培養基中銅濃度很低時，分泌的曱烷氧化菌素由于無法與銅結合而被細胞識別，在培養介質中會有甲烷氧化菌素積累。但是低銅培養介質中曱烷氧化細菌由于缺銅而生長緩慢，甲垸氧化菌素產量低，導致發酵介質中甲烷氧化菌素積累量低，不利于分離純化。當培養基中銅濃度較高時，雖然甲烷氧化細菌生長快，甲烷氧化菌素產量高，但分泌的甲烷氧化菌素與銅結合后會重新回到細胞中在內膜系統中積累，發酵介質中曱烷氧化菌素含量低，而結合于內膜系統中的曱烷氧化菌素分離純化困難。這些已成為限制曱烷氧化菌素工業化應用的瓶頸問題。因此，使甲烷氧化菌素在發酵介質中大量分泌，以便采用簡單的分離純化方法獲得甲烷氧化菌素對實現甲烷氧化菌素作為天然抗氧化劑和防腐劑應用具有著重要意義。
發明內容本發明目的是提供一種工藝較為簡單、成本低廉、快速的利用曱烷氧化細菌生產甲烷氧化菌素的制備方法。本發明目的是這樣實現的是是在常規培養曱烷氧化細菌的液體培養基中分階段添加CuS04，在發酵液中獲得曱烷氧化菌素。首先在液體培養基中添加5uMCuS04培養甲烷氧化細菌，待達到一定細胞密度后再采用低銅含量的培養液培養，使甲烷氧化細菌在嚴格P艮銅的培養條件下向發酵液中大量分泌曱烷氧化菌素，其中，低銅培養液中CuS04含量范圍為0-0.05uM。采用嚴格限銅的培養條件分段培養甲烷氧化細菌，從發酵液中通過離心、DianionHP-20大孔樹脂吸附和冷凍干燥獲得曱烷氧化菌素。本發明目的是在銅濃度不同的培養基中對甲烷氧化細菌進行分段發酵培養，從發酵液中通過離心、DianionHP-20大孔樹脂和冷凍干燥獲得曱烷氧化菌素。為解決上述技術問題，本發明采取以下技術方案一種甲烷氧化菌素的生產方法，包括以下2個方面1、先在較高銅含量培養基(添加5uMCuS04)中使曱烷氧化細菌快速生長，待達到一定細胞密度后再將其放入低銅培養基(添加O-O.05uMCuS04)中使其大量分泌甲烷氧化菌素(mb)，甲烷氧化細菌在低銅條件下釋放的曱烷氧化菌素不能與銅結合，不結合銅的曱烷氧化菌素由于無法被細胞識別進入細胞內部，從而在介質中大量積累。2、從發酵液中通過離心、DianionHP-20大孔樹脂和冷凍干燥獲得曱烷氧化菌素(mb)。在用本發明的方法對甲烷氧化細菌進行分段培養時，甲烷氧化細菌先在較高銅含量的培養條件下快速生長，達到一定細胞密度，然后在低銅條件下大量釋放曱烷氧化菌素，釋放的甲烷氧化菌素不能與銅結合，無法被細胞識別進入細胞內部，從而在介質中積累，解決了甲烷氧化菌素產量低的問題，而且從發酵液中分離純化甲烷氧化菌素的方法筒單，具有較高的工業化應用可行性。與常規方法相比，本發明的方法可以極大程度地提高甲烷氧化菌素的產量，且簡化了曱烷氧化菌素分離純化的程序，基于上述優點，本發明將在曱烷氧化菌素的應用(如作為天然抗氧化劑和防腐劑使用等)中發揮巨大作用，應用前景廣闊。具體實施例方式是是在常規培養曱烷氧化細菌的液體培養基中分階段添加CuS04，在發酵液中獲得曱烷氧化菌素。首先在液體培養基中添加5uMCuS04培養曱烷氧化細菌，待達到一定細胞密度后再采用低銅含量的培養液培養，使甲烷氧化細菌在嚴格限銅的培養條件下向發酵液中大量分泌甲烷氧化菌素，其中，低銅培養液中CuS04含量范圍為0-0.05uM。釆用嚴格限銅的培養^分段培養甲烷氧化細菌，>^發酵液中通過離心、DianionHP-20大孔樹脂吸附和冷凍干燥獲得甲烷氧化菌素。本發明目的是在銅濃度不同的培養基中對曱烷氧化細菌進行分段發酵培養，從發酵液中通過離心、DianionHP-20大孔樹脂和冷凍干燥獲得甲垸氧化菌素。下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所有百分比濃度如無特別說明均為質量/體積(W/V)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度，所有培養基中的溶劑均為去離子水。無機鹽培養基成分如下(g/L):K2HP04:1.06;NaH2P04-12H20:4.34;MgS04.7H20:0.074;CaCl2.2H20:7.0;K2S04:0.34;NaN03:1.7;FeS04.7H20:0.0224;MnS04-7H20:0.446;ZnS04.7H20:0.57;Na2Mo04.2H20:0.096;H3BO3:0.124;CoCl26H20:0.096;KI:0.166;pH7.0。(甲烷氧化細菌M"/c力os/or/"巡0B3b培養基)NH3C1:0.5;K2HP04:0.49;KH2P04.7H20:0.40;MgS047H20:0.3;CaCl2.2H20:0.02;KN03:1.6;NaCl:0.3;FeS04'71120:0.004;MnS04仏0:0.0004;ZnS04-7H20:0.00034;Na2Mo04.2H20:0.00024;pH7.0(甲烷氧化細菌"/c力o;y/7or/咖3011培^基)實施例1、本發明的甲烷氧化菌素的生產以曱烷氧化細菌^r/c力o^or/iM70B3b和^r/c力05"/7or/w/z3011為例，具體過禾呈如下曱烷氧化細菌在不同銅濃度下分段培養將曱烷氧化細菌M^r/cMs/oW咖0B3b或W"力yA"./7f/5"^r/c力o^7or/咖IMV3011以10%接鐘量接種在含有添加5uMCuS04的100毫升無菌液體培養基的500毫升密閉的三角瓶中，采用抽真空法將空氣置換為曱烷-氧氣(l:10,V/V)的混合氣，32攝氏度，300轉/分鐘進行培養，每隔24小時取樣進行細胞密度測定，當培養液中OD600達到0.8-1.l時，以8000轉/分鐘離心得到菌體，將其添加到CuS04濃度為0.OluM的低銅新鮮培養基中繼續培養。當培^液+OD600達到O.8-1.2時，如果培養介質呈現黃色，則收獲細胞，否則繼續用低銅培養基替換，直至介質中呈現黃色，即表明曱烷氧化菌素在發酵介質中累積。細胞密度測定采用光密度法，在SP-756P型分光光度計上測定波長600納米處的光密度值(0D600)。曱烷氧化菌素的定量測定采用DiaionHP-20大孔吸附樹脂層析后凍干稱重法。具體步驟如下將培養好的發酵液離心去除細胞，剩余介質以13000xg二次離心20分鐘，上清液用DiaionHP-20大孔吸附樹脂層析，然后用體積比60%甲醇和40%水的溶液洗提DiaionHP-20，洗提液進行真空冷凍干燥，得到曱烷氧化菌素固體。由于曱烷氧化菌素與銅結合后會變成黃色，在394-422nm處有最大吸收，因此也可以在該波長范圍內采用分光光度法進行定量測定。實施例2、本發明的甲烷氧化細菌培養方法與曱烷氧化細菌常規培養方法在發酵介質中獲得甲烷氧化菌素的比較甲烷氧化細菌"/c力ospoW咖0B3b和Ve^rA^/zzM"/c力owor/"邁IMV3011進行本發明培養方法與曱烷氧化細菌常規培養方法在發酵介質中獲得甲烷氧化菌素的比較，具體過程如下1.曱烷氧化細菌M"/'c力o^70,/wz/0B3b和Ve^j^oW/7"s"/c力^pw/咖IMV3011的常規培養，用常規方法對曱烷氧化細菌MWc力os/7oW咖0B3b和jffe/力y/o"'/ziAy"yc/ros/7or/"邁IMV3011進行培養,具體方法為將曱烷氧化細菌#e^r/o^//7^"/c力os/7oWwz7IMV3011以10%接鐘量接種在含有添加5uM或0.01uMCuS04的100毫升無菌液體培養基的500毫升密閉的三角瓶中，采用抽真空法將空氣置換為甲烷-氧氣(1:10，V/V)的混合氣，32攝氏度，300轉/分鐘進行培養，每隔24小時取樣進行細胞密度測定，并采用抽真空法置換入新鮮的曱烷-氧氣(l:10，V/V)的混合氣，在相同條件下繼續培養，培養72~96小時后中止培養。2.曱烷氧化細菌tr/cMy/w/咖做J6和yl/e^Aj70"'/7w"r/c力o577oW咖IMV3011的限銅分段培養5具體方法如實施例1采用限銅分段培養曱烷氧化細菌，其發酵介質中的甲烷氧化菌素的產量高于以正常銅含量和低銅含量培養基常規培養的曱烷氧化菌素的產量，這主要是由于分段限銅培養方法首先保證了正常銅含量下曱烷氧化細菌的快速生長，達到一定細胞密度后在低銅下分泌到介質中的甲烷氧化菌素不能與銅結合被細胞識別而進入細胞內部，從而在介質中大量累積。結果如表1所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權利要求1、一種利用甲烷氧化細菌生產甲烷氧化菌素的制備方法，其特征在于是是在常規培養甲烷氧化細菌的液體培養基中分階段添加CuSO4，在發酵液中獲得甲烷氧化菌素。2、根據權利要求1所述的一種利用甲烷氧化細菌生產曱烷氧化菌素的制備方法，其特征在于首先在液體培養基中添加5uMCuS04培養曱烷氧化細菌，待達到一定細胞密度后再采用低銅含量的培養液培養，使曱烷氧化細菌在嚴格限銅的培養條件下向發酵液中大量分泌曱烷氧化菌素，其中，低銅培養液中CuS04含量范圍為0-0.05uM。3、根據權利要求l所述的一種利用甲烷氧化細菌生產曱烷氧化菌素的制備方法，其特征在于采用嚴格P艮銅的培養M分段培養甲烷氧化細菌，從發酵液中通過離心、DianionHP-20大孔樹脂吸附和冷凍干燥獲得甲烷氧化菌素。全文摘要本發明涉及一種利用甲烷氧化細菌生產甲烷氧化菌素的制備方法。其特點是是在嚴格限銅的培養基中對甲烷氧化細菌進行分段發酵培養，從發酵液中通過離心、DianionHP-20大孔樹脂吸附和冷凍干燥獲得甲烷氧化菌素。在用本發明的方法對甲烷氧化細菌進行分段培養時，甲烷氧化細菌先在較高銅含量的培養條件下快速生長，待達到一定細胞密度后，在低銅培養條件下大量釋放甲烷氧化菌素，釋放的甲烷氧化菌素不能與銅結合，無法被細胞識別進入細胞內部，從而在發酵介質中積累。從發酵介質中獲得甲烷氧化菌素，解決了甲烷氧化菌素進入細胞后結合于內膜系統而分離純化困難的問題。與常規生產方法相比，本發明的方法可以極大程度地提高甲烷氧化菌素的產量，且簡化了甲烷氧化菌素分離純化的程序，基于上述優點，本發明將在甲烷氧化菌素的應用中發揮巨大作用。文檔編號C12N9/08GK101519654SQ20091007172公開日2009年9月2日申請日期2009年4月3日優先權日2009年4月3日發明者艷王,靜董,辛嘉英申請人:哈爾濱商業大學