一種用于檢測股骨頭壞死易感的基因組合、引物、探針和用途的制作方法

專利名稱：一種用于檢測股骨頭壞死易感的基因組合、引物、探針和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因組合、引物、探針和用途，尤其是用于檢測股骨頭壞死易感性 的基因組合及其特異性引物和探針及用途。
背景技術：
股骨頭壞死因其主要病理系股骨頭血運受阻，遭受破壞而引起的頭部骨質缺血， 故多稱為股骨頭缺血性壞死或股骨頭無菌性壞死。由于股骨頭壞死有一個復雜的病理過 程，如早期不能得到及時有效的治療，就會使股骨頭塌陷，關節間隙變窄，最后導致骨關節 炎，使病人髖關節功能障礙而致殘致癱。病人在遭受生理病痛的同時，還要遭受心理創傷的 煎熬，也給家庭、單位和社會增添了沉重的負擔。股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head ANFH)是骨科常 見病，多發病，早期診斷困難，治療效果欠佳，最終仍需人工關節置換術，給患者和社會帶來 巨大損失。其發病機理尚不十分清楚，但其共同特征都是血液循環障礙導致股骨頭缺血壞 死。由于機體對壞死區具有自然的修復能力，當新生骨細胞隨新生血管向壞死區生長并形 成新骨的同時，壞死骨小梁將被逐步吸收。在此過程中骨的力學性能明顯減弱，正常負重即 可致股骨頭塌陷變形及髖關節退行性關節炎，同時出現以疼痛和活動障礙為主的臨床癥狀 群。早期的診斷和治療是治療ΑΜ 的關鍵。隨著ΑΜ 的基因多態性的深入研究，越來越 多的和ANFH相關的基因見諸報道。證實了多種基因在ANFH的發生發展中的作用，為ANFH 的早期診斷和治療提供了理論依據。血管內皮生長因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)基因位于 6 號 染色體pl2區，其-634上C/G多態性會影響基因的表達，其產物血管內皮生長因子能特異 性作用于血管內皮細胞，促進內皮細胞分裂，促進血管的生長和側支循環建立的作用，也能 促進血管內皮細胞分泌胰島素樣生長因子等生長因子，促進成骨細胞生長，其多態性會影 響VEGF基因的表達，從而導致ANFH的發生。亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR gene)位于1ρ36. 13，由11個外顯子組成，編 碼656個氨基酸，翻譯成能夠催化N5，WO-亞甲基四氫葉酸還原成N5-亞甲基四氫葉酸的 蛋白質，后者為Hcy的再甲基化提供甲基供體，使其生成蛋氨酸。MTHFR基因677位存在 C —T突變。該突變會導致其編碼的丙氨酸(GCU)被纈氨酸(GUU)所取代，從而影響MTHFR 的活性，使血漿中HCY水平升高。是同型半胱氨酸，高同型半胱氨酸血癥是血栓形成的獨立 危險因素。凝血因子5 (coagulation factor V，FV)基因位于 lq23，編碼 Glueek 因子 V 蛋白， 在凝血過程中位于內外源性凝血途徑的交匯點，加速和促進凝血酶原的激活和凝血酶的生 成。因子V在rs6025發生基因突變后稱V Leiden因子。V Leiden因子是靜脈血栓形成的 常見的危險因素。基因突變導致深靜脈血栓形成，血液高凝狀態，從而導致股骨頭小血管的 血栓形成。
脂類代謝紊亂是導致股骨頭壞死的重要機理，長期大劑量使用糖皮質激素引起體 內高脂血癥，脂肪分解，血中游離脂肪酸增多，從而使血管內皮損傷，膠原暴露，激活內源性 凝血途徑，使纖維蛋白血小板血栓形成。對氧磷酶(pamoxonase，PON)又稱芳香基二烷基磷酸酯酶，人類血清中的PONl與 HDL緊密結合，形成一個八聚合體的結構，是ApoA — 1的重要組成部分。PON基因位于染色 體7q21. 3 一 q22. 1，含有9個外顯子及8個內含子，PON基因家族至少有三個成員，分別為 PONUP0N2和P0N3。PONl基因產物是循環中HDL的組成部分，并且HDL的抗氧化的活性大 部分取決于P0N1。PONl的192Glu/Arg的改變，影響了對氧磷酶酶的活性。載脂蛋白Afepolipoprotein Α,Αρο Α)位于人類11號染色體長臂上約15kb的基 因片段內，與Apo C3、Apo A4基因呈簇狀排列。Apo Al基因轉錄起始點上游_75bp處有G/ A多態性位點(rs670)，Apo Al基因結構的改變影響著Apo Al的分子結構、生成和向血液 中釋放的速率，進而影響血中Apo Al與HDL的水平。載脂蛋白Bfepolipoprotein B,Apo B)基因位于第2號染色體短臂(2p23)末端， 全長43kb，由29個外顯子和28個內含子組成。最大的外顯子是26號外顯子。位于第26 號外顯子的C7673T多態(rs693)靠近LDL受體結合區域，被認為與動脈粥樣硬化、冠心病、 心肌梗死及股骨頭壞死密切相關。現有技術檢測股骨頭壞死易感人群，采用雜交芯片法或玻璃板芯片法，以及利用 taqman探針，該方法準確率低、假陰性和假陽性率較高，且不能批量檢測；另一種直接測序 法，雖準確率高，但其成本高、同樣不能實現批量檢測，因此現有方法均無法滿足大規模基 因篩選的要求。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是，通過檢測一組與股骨頭壞死易感性相關的基因及 位點，利用特異性引物和探針，通過單核苷酸延伸技術結合微陣列芯片技術，綜合檢測和分 析受檢人群是否攜帶“股骨頭壞死易感基因”，將股骨頭壞死易感人群從人群中篩選出來， 改變不良的生活習慣，達到預防的目的。為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是一種用于檢測股骨頭壞死易 感的基因組合，它包括與股骨頭壞死關系密切的六個基因的組合血管內皮因子類的VEGF 基因，凝血因子類的FV基因和MTHFR基因，脂類代謝基因的PONl基因、AP0A1基因和APOB基因。包括下述SNP位點VEGF基因的rs2010963位點、FV基因的rs6025位點、MTHFR 基因的rsl801133位點、AP0A1基因的rs670位點、APOB基因的rs693位點和PCMl基因的 rs662位點。所述的用于檢測股骨頭壞死易感的基因組合，用于針對所述位點設計特異性的引 物對和探針。上述用于檢測股骨頭壞死易感的基因組合設計的特異性引物對，所述的特異性引 物對的序列如下，用于進行多重PCR擴增，能同時擴增出上述6個位點的基因片段針對rs2010963 位點GAAGTCGAGGAAGAGAGAGACGCGGCGGTCACCCCCAAAA
針對rs6025 位點TTCTAGCCAGAAGAAATTCTCAGATAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCA針對rsl801133 位點ATGTCRGTGCAYGCCTTCAGCTTTGAGGCTGACCTGA針對rs670 位點CACCTCCTTCTCGCAGTCTCCAGGGACAGAGCTGATC針對rs693 位點AGGACACCAAAATAACCTTAATCATATCGTTGAAGTTCCTGCTGA針對rs662 位點ATGTTTTAATTGCAGTTTGAATGATAGACAACATACGACCACGCT上述用于檢測股骨頭壞死易感的基因組合設計的特異性探針，所述的特異性探針 序列如下，能同時對六個位點進行檢測分型針對rs2010963 位點CGCGCGGGCGTGCGAGCAGCGAAAG
針對 rs6025 位點TGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGC針對rsl801133 位點GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG針對rs670 位點AGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCC針對rs693 位點ACATGAAGGCCAAATTCCGAGAGAC針對rs662 位點CACTATTTTCTTGACCCCTACTTAC所述的引物對或探針，用于通過單核苷酸延伸技術結合微陣列芯片技術特異性檢 出股骨頭壞死易感基因。本發明的有益效果是采用單堿基引物延伸法一SNP檢測的金標準，結果準確可 靠；同時檢測多個SNP位點，操作簡便；靈敏度高，DNA用量僅20ng。
具體實施例方式本發明用于檢測股骨頭壞死易感的基因組合，它包括與股骨頭壞死關系密切的六 個基因的組合血管內皮因子類的VEGF基因，凝血因子類的FV基因和MTHFR基因，脂類代 謝基因的PONl基因、APOAl基因和APOB基因。包括下述SNP位點VEGF基因的rs2010963 位點、FV基因的rs6025位點、MTHFR基因的rsl801133位點、APOAl基因的rs670位點、APOB 基因的rs693位點和PONl基因的rs662位點。本發明所述的引物是針對VEGF基因的rs2010963位點、FV基因的rs6025位點、 MTHFR基因的rsl801133位點、APOAl基因的rs670位點、APOB基因的rs693位點和PONl 基因的rs662位點而設計，可用于進行多重PCR擴增，可同時擴增出上述6個位點的基因片 段。設計這類引物是本領域技術人員能夠輕易完成的。優選的，本發明中所述引物為具有 如下序列針對rs2010963 位點GAAGTCGAGGAAGAGAGAGACGCGGCGGTCACCCCCAAAA針對rs6025 位點TTCTAGCCAGAAGAAATTCTCAGATAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCA針對rsl801133 位點ATGTCRGTGCAYGCCTTC
AGCTTTGAGGCTGACCTGA針對rs670 位點CACCTCCTTCTCGCAGTCTCCAGGGACAGAGCTGATC針對rs693 位點AGGACACCAAAATAACCTTAATCATATCGTTGAAGTTCCTGCTGA針對rs662 位點ATGTTTTAATTGCAGTTTGAATGATAGACAACATACGACCACGCT特異性引物可用常規的合成技術進行合成，本領域的技術人員能夠理解，本發明 的引物不限于這6條引物對。本發明所述探針，是針對VEGF基因的rs2010963位點、FV基因的rs6025位點、 MTHFR基因的rsl801133位點、APOAl基因的rs670位點、APOB基因的rs693位點和PONl 基因的rs662位點而設計，可同時對六個位點進行檢測分型。設計這類探針是本領域技術 人員能夠輕易完成的。優選的，本發明中所述探針為具有如下序列針對rs2010963 位點CGCGCGGGCGTGCGAGCAGCGAAAG針對rs6025 位點TGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGC針對rsl801133 位點GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG針對rs670 位點AGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCC針對rs693 位點ACATGAAGGCCAAATTCCGAGAGAC針對rs662 位點CACTATTTTCTTGACCCCTACTTAC特異性探針可用常規的合成技術進行合成，本領域的技術人員能夠理解，本發明 的特異性探針不限于這條探針。本發明中所述探針特指單核苷酸延伸技術中的延伸引物，下面實施例中將敘述為 延伸引物。下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明1、DNA 的提取取受檢者外周靜脈血，加入同等體積的細胞裂解液，裂解兩次，充分裂解白細胞， 離心棄上清后加入蛋白酶K緩沖液和蛋白酶K(50ug/ml)，65°C孵育10分鐘，異丙醇沉淀、 75 %乙醇洗滌兩次，晾干后溶于適量TB溶液中。2、PCR 擴增取上述受檢者的基因組DNA提取液，稀釋到lOng/μ 1，取2μ 1加入0. 2mlPCR管內 (批量檢測時加入96孔板中)，進行多重PCR擴增反應總體積5ul，其中 IOM mol/L each dNTPs 0. 0375ul, 10XPCR BufferO. 5ul, 25mmol/L MgCl2Iul,模板 DNA 20ng，6 重引物混合液 10uM/L eachO. 025ul, Amplitaq Gold(5U/ul)0. lul，補足水到 5ul。置于 PCR 儀上反應預變性 94°C Imin ；94°C 30sec, 55°C 30sec,72°C lmin，40 個循環；Hold 4°C。擴增引物IF GAAGTCGAGGAAGAGAGAGACGIR CGGCGGTCACCCCCAAAA2F TTCTAGCCAGAAGAAATTCTCAGA
2R TAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCA3F ATGTCRGTGCAYGCCTTC3R AGCTTTGAGGCTGACCTGA4F CACCTCCTTCTCGCAGTCT4R CCAGGGACAGAGCTGATC5F AGGACACCAAAATAACCTTAATCA5R TATCGTTGAAGTTCCTGCTGA6F ATGTTTTAATTGCAGTTTGAATGA6R TAGACAACATACGACCACGCT3、純化在PCR擴增產物中加入2ul Exo I-SAP-IT純化試劑(購自USB)。將96孔板放入 PCR 儀中進行純化，純化程序37°C 30min,96°C lOmin，Hold4°C。4、引物延伸反應純化后的PCR產物中加入延伸反應混合物extension Dilution Buffer3. 76ul, 延伸引物混合液(10uM/L each) 0. 03ul, 20 X Extension Mix (購自 Beckman Coulter)0. 2ul, DNA 聚合酶(購自 Beckman Coulter)0. 02ul，補足水到 7ul。將裝有延伸 反應混合物的0. 2ml PCR管(批量檢測時加入96孔板)再次放入PCR儀中進行延伸反應， 反應程序Hold 96°C 3min ；94°C 20sec,40°C llsec,46 個循環；Hold 4°C。延伸引物序列IP CGCGCGGGCGTGCGAGCAGCGAAAG2P TGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGC3P GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG4P AGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCC5P ACATGAAGGCCAAATTCCGAGAGAC6P CACTATTTTCTTGACCCCTACTTAC以上延伸引物5’端具有與微陣列芯片地址引物互補的地址序列。5、延伸反應結束后，加入雜交液與微陣列芯片進行雜交反應。孵育溫度42°C，孵育 時間2小時。6、激光掃描檢測熒光信號當六個檢測位點中，全部為變異純合型時，患病風險最 高，五個為變異純合型者，患病風險次之，一個變異純合時風險最低。本發明將上述6個與股骨頭壞死易感、發生密切相關的基因進行組合，通過大量 的篩選數據表明所述6個基因VEGF基因、FV基因，MTHFR基因、PONl基因、AP0A1基因、 APOB基因，如6個基因都有位點發生突變，則患股骨頭壞死的概率最高；4個基因發生突變 次之；兩個或一個發生突變，患股骨頭壞死的概率較小。本發明采用單核苷酸延伸技術結合微陣列芯片技術，該技術針對上述6個位點， 設計一套多重PCR引物，擴增攜帶SNP位點的基因片段，根據SNP上游5’端設計23_25bp 的寡核苷酸探針，此探針與序列雜交后3’末端位于snp5’端上游Ibp處，檢測時根據SNP 攜帶的堿基類型，聚合酶在探針末端結合上一個攜熒光的ddNTP，根據結合的ddNTP不同， 其所攜帶的熒光顏色也不相同，在探針的5’端還有額外的20bp的Tag地址序列，與微陣列芯片上對應的序列互補，延伸后的探針與微陣列芯片上對應區域上的序列雜交，不同的探 針結合在芯片的不同區域，通過檢測每條探針所攜帶的熒光的不同，達到同時進行多個SNP 分型的目的。疾病的發生是一個十分復雜的過程，受到多個蛋白和基因的共同影響，其中任何 一個酶的改變都會影響疾病的易感性。傳統的基因檢測疾病的方法受到方法的限制，往往 只能對一到兩個基因的多態性進行分析，只能覆蓋一部份患病風險人群，對于由于其他基 因上的多態性造成的疾病患病風險不能及時的預警，檢測的準確性因此會大幅降低，受檢 者不能全面的了解自身疾病的易感情況。本發明針對一種疾病不同的患病途徑檢測多個相關的基因和其多態性位點，能更 準確更全面的檢測受檢者不同患病途徑的患病風險，能給受檢者提出具有針對性和有效地 健康建議，及時有效的避免其疾病的發生。由于本發明使用的檢測方法可以高通量，自動化的檢測SNP，大幅降低了檢測成 本，可以對不同患病途徑的多個基因同時進行檢測，本發明針對股骨頭壞死不同的患病途 徑的關鍵酶基因尋找挑選了 6個多態性位點，能更準確更全面的檢測受檢者不同患病途徑 的患病風險，能夠給受檢者提出具有針對性的健康建議，及時有效的避免其疾病的發生。本 發明通過單核苷酸延伸技術結合微陣列芯片技術，利用特異性引物和探針對單核苷酸多態 性(SNP)的基因分型準確率超過99%，同時檢測上述三類6個基因對檢測、比較個體的股骨 頭壞死易感性具有重要意義。綜上所述，本發明的內容并不局限在上述的實施例中，相同領域內的有識之士可 以在本發明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發 明的范圍之內。
權利要求
一種用于檢測股骨頭壞死易感的基因組合，其特征在于，它包括與股骨頭壞死關系密切的六個基因的組合血管內皮因子類的VEGF基因，凝血因子類的FV基因和MTHFR基因，脂類代謝基因的PON1基因、APOA1基因和APOB基因。
2.根據權利要求1所述的用于檢測股骨頭壞死易感的基因組合，其特征在于，包括下 述SNP位點VEGF基因的rs2010963位點、FV基因的rs6025位點、MTHFR基因的rs 1801133 位點、APOAl基因的rs670位點、APOB基因的rs693位點和PONl基因的rs662位點。
3.如權利要求2所述的用于檢測股骨頭壞死易感的基因組合，用于針對所述位點設計 特異性的引物對和探針。
4.如權利要求2所述的用于檢測股骨頭壞死易感的基因組合設計的特異性引物，其特 征在于，所述的特異性引物對的序列如下，用于進行多重PCR擴增，能同時擴增出上述6個 位點的基因片段針對 rs2010963 位點GAAGTCGAGGAAGAGAGAGACG CGGCGGTCACCCCCAAAA針對 rs6025 位點TTCTAGCCAGAAGAAATTCTCAGATAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCA針對 rsl801133 位點ATGTCRGTGCAYGCCTTCAGCTTTGAGGCTGACCTGA針對 rs670 位點CACCTCCTTCTCGCAGTCTCCAGGGACAGAGCTGATC針對 rs693 位點AGGACACCAAAATAACCTTAATCA TATCGTTGAAGTTCCTGCTGA 針對 rs662 位點:ATGTTTTAATTGCAGTTTGAATGA TAGACAACATACGACCACGCT。
5.如權利要求2所述的用于檢測股骨頭壞死易感的基因組合設計的特異性探針，其特 征在于，所述的特異性探針序列如下，能同時對六個位點進行檢測分型針對 rs2010963 位點CGCGCGGGCGTGCGAGCAGCGAAAG 針對 rs6025 位點TGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGC 針對 rsl801133 位點GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG 針對 rs670 位點AGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCC 針對 rs693 位點ACATGAAGGCCAAATTCCGAGAGAC 針對 rs662 位點CACTATTTTCTTGACCCCTACTTAC
6.如權利要求4或5所述的引物對或探針，用于通過單核苷酸延伸技術結合微陣列芯 片技術特異性檢出股骨頭壞死易感基因。全文摘要
本發明公開了一種用于檢測股骨頭壞死易感的基因組合、引物、探針和用途，它包括與股骨頭壞死關系密切的六個基因的組合血管內皮因子類的VEGF基因，凝血因子類的FV基因和MTHFR基因，脂類代謝基因的PON1基因、APOA1基因和APOB基因。通過檢測一組與股骨頭壞死易感性相關的基因及位點，利用特異性引物和探針，通過單核苷酸延伸技術結合微陣列芯片技術，綜合檢測和分析受檢人群是否攜帶“股骨頭壞死易感基因”，將股骨頭壞死易感人群從人群中篩選出來，改變不良的生活習慣，達到預防的目的。
文檔編號C12N15/11GK101962668SQ20091006988
公開日2011年2月2日 申請日期2009年7月24日 優先權日2009年7月24日
發明者楊亞非 申請人:南京微宇基因工程有限公司