專利名稱：提高氧化葡糖桿菌產2-酮-l-古龍酸的方法
技術領域：
本發明屬于微生物發酵領域，特別是涉及一種提高氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸的方法。
背景技術：
維生素C是機體營養、生長所必需的一種微量水溶性維生素，在抗氧化和維持新陳代 謝平衡等方面起著重要的作用。維生素C可以作為藥品、保健品、食品添加劑及化妝品營 養劑，它的應用范圍在擴展，市場穩定。
目前，我國生產維生素c的方法為"二步發酵法"，第一步發酵使用黑醋桿菌將山梨醇
轉化為L-山梨糖，第二步發酵為混合發酵，將山梨糖轉化為維生素C的前體2-酮基-L -古 龍酸。混合發酵所使用的混合菌系為巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌混菌發酵，其中，氧化 葡糖桿菌為產酸菌，巨大芽孢桿菌為伴生菌，若不加入巨大芽孢桿菌而單獨使用氧化葡糖 桿菌時，生長極端緩慢，產酸效率低，當加入巨大芽孢桿菌，可使氧化葡糖桿菌生長速率 提高，產酸量增加，但是，它的加入可造成發酵培養基中營養成分的浪費，使成本提高， 同時，因其在發酵液中的濃度較高，因此，在處理混菌發酵液過程的成本也會大大增加， 混菌代謝物成分復雜，后處理困難。對環境造成污染。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種提高氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸 的方法。
本發明的技術方案概述如下
提高氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸的方法，包括如下步驟 (1)種子培養
稱取L-山梨糖10-50g，玉米漿2-10g,牛肉膏2-10g，酵母浸粉2-10g，尿素0.5-5g， 蛋白胨2-10g， KH2PO40.5-5g， MgSO40.1-0.7g， CaCO30.5-5g，加水至1L，調pH為6.5 7.0， 121'C滅菌20min，制成種子培養基；
將斜面的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO.1.110接種于所述種子 培養基中，28-35°C， 160-250r/min搖床振蕩，培養24-48小時，制成種子培養液； (2)發酵
稱取L-山梨糖40-120g，玉米漿10-50g，尿素10-25g，KH2PO40.5-3g ，MgSO40.2-1.2g， CaCO3l-10g加水至1L，調pH為6.5-7.5， 12rC滅菌20min，制成發酵培 養基；
將所述種子培養液以體積比為5%-15%的比例，接入所述發酵培養基中，28-35°C， 160-250 r/min搖床振蕩，發酵培養48-96小時，在所述發酵培養0小時至36小時之間的任 意時刻，加入巰基化合物，使巰基終濃度為0.1-30mM。
所述巰基化合物為還原型谷胱甘肽，二硫蘇糖醇，半胱氨酸或輔酶A。還可以選用其 它的無毒的巰基化合物。
步驟(1)優選為稱取L-山梨糖20g，玉米漿3g，牛肉膏3g,酵母浸粉3g，尿素 lg，蛋白胨10g， KH2P04lg， MgSO40.2g， CaC03l g加水至1L，調pH為6.8， 121。C滅 菌20min，制成種子培養基；
將斜面的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO丄llO接種于所述種子 培養基中，30°C， 220r/min搖床振蕩，培養36小時，制成種子培養液。
步驟(2)優選為稱取L-山梨糖80g，玉米漿20g，尿素12g， KH2P04lg， MgSO在5 g， CaC035g加水至1L，調pH為7.0， 12rC滅菌20min，制成發酵培養基；
將所述種子培養液以體積比為10%的比例，接入所述發酵培養基中，30°C， 220 r/min 搖床振蕩，發酵培養72小時，在所述發酵培養0小時至36小時之間的任意時刻，加入巰 基化合物，使巰基終濃度為3mM。
本發明能明顯提高氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO.U10的生長 速度和產2-酮-L-古龍酸效率，達到部分取代伴生菌的伴生效果的目的。從而可以減少伴生 菌巨大芽孢桿菌的用量，減少培養基的成本，并可以減少巨大芽孢桿菌的菌體，芽孢和代 謝物對環境的污染。
本發明揭示了在添加巰基化合物的氧化葡糖桿菌單獨培養時，能明顯提高生長速度和 產2-酮-L-古龍酸效率，達到部分取代伴生菌的目的。針對這一狀況，本發明為今后揭示混 菌發酵的作用機制提供了一定的提示作用。
圖1為巰基化合物對氧化葡糖桿菌產酸能力的影響，圖例未加入巰基化合物；
參加入GSH 1.0mg/ml; 力口入DTT0.5mg/ml; X:加入cys 0.4 mg/ml; 加入CoA 2.5mg/ml。
圖2為巰基化合物對菌體生物量的影響，圖例未加入巰基化合物；參加入GSH 1.0mg/ml; 加入DTT 0.5mg/ml; X:加入cys 0.4 mg/ml;加入CoA2.5mg/ml。 圖3為不同濃度GSH對氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸能力的影響。 圖4為不同濃度GSH對氧化葡糖桿菌生物量的影響。
圖5為1.0mg/ml的GSH對不同起始濃度的氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸能力的影響， 圖例■:加入體積比為10%，未加入GSH;參加入體積比為1%，加入1.0mg/ml GSH; 加入體積比為10%，加入l.Omg/ml GSH; X:加入體積比為100%，加入l.Omg/ml GSH。圖6為1.0mg/ml的GSH對不同起始濃度的氧化葡糖桿菌生物量的影響，圖例 加入體積比為10%,未加入GSH;參加入體積比為1%，加入1.0mg/mlGSH; ▲:加入 體積比為10%，加入l.Omg/mlGSH; X:加入體積比為100%，加入1.0mg/ml GSH。
圖7不同時間加入1.0mg/ml GSH對氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸能力的影響。圖例 ■:未加入GSH;參加入時間為Oh; 加入時間為3h; X:加入時間為6h; 加
入時間為12h; 加入時間為24h; 加入時間為36h。
圖8不同時間加入1.0mg/mlGSH對氧化葡糖桿菌生物量的影響。圖例未加入
GSH;攀加入時間為Oh; 加入時間為3h; X:加入時間為6h; 加入時間為12h;
O:加入時間為24h; 加入時間為36h。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
本發明所使用的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)從中國普通微生物菌種保藏管 理中心購得，保藏編號為CGMCC NO丄llO。 實施例1
提高氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸的方法，包括如下步驟 (l)種子培養:
稱取L-山梨糖20g，玉米漿3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素lg，蛋白胨10g， KH2P04lg， MgSO在2g, CaC03l g加水至1L，調pH為6.8， 121。C滅菌20min，制成種子 培養基；
將斜面的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO.1.110接種于所述種子 培養基中，30°C， 220r/min搖床振蕩，培養36小時，制成種子培養液； (2)發酵
稱取L-山梨糖80g，玉米漿20g，尿素12g， KH2P04lg， MgSO40.5 g， CaC035g 加水至1L，調pH為7.0， 12rC滅菌20min，制成發酵培養基；
將所述種子培養液以體積比為10%的比例，接入所述發酵培養基中，30°C， 220 r/min 搖床振蕩，發酵培養72小時，在所述發酵培養O小時，加入還原型谷胱甘肽，使其濃度為 lmg/ml，使巰基終濃度為3mM。
可以用發酵培養l小時，發酵培養2小時，發酵培養5小時，發酵培養10小時，發酵 培養15小時，發酵培養18小時，發酵培養24小時，發酵培養30小時或發酵培養36小時 替代本實施例的發酵培養0小時組成新的實施例。 實施例2
提高氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸的方法，包括如下步驟 (1)種子培養
稱取L-山梨糖10g，玉米漿2g，牛肉膏2g，酵母浸粉2g，尿素0.5g，蛋白胨2g， KH2PO40.5g， MgSO40.1g， CaCO30.5g加水至1L，調pH為7.0， 12rC滅菌20min，制成種
子培養基；將斜面的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO丄llO接種于所述種子 培養基中，28°C, 160r/min搖床振蕩，培養48小時，制成種子培養液； (2)發酵
稱取L-山梨糖40g，玉米漿10g，尿素10g， KH2PO40.5g， MgSO40.2g， CaC03lg 加水至1L，調pH為7.5， 12rC滅菌20min，制成發酵培養基；
將所述種子培養液以體積比為5%的比例，接入所述發酵培養基中，28°C， 160 r/min 搖床振蕩，發酵培養96小時，在所述發酵培養0小時，加入二硫蘇糖醇，使巰基終濃度為 O.lmM。
可以用發酵培養l小時，發酵培養2小時，發酵培養5小時，發酵培養10小時，發酵 培養15小時，發酵培養18小時，發酵培養24小時，發酵培養30小時或發酵培養36小時 替代本實施例的發酵培養0小時組成新的實施例。 實施例3
提高氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸的方法，包括如下步驟 (1)種子培養
稱取L-山梨糖50g，玉米漿10g，牛肉膏10g，酵母浸粉10g，尿素5g，蛋白胨10g， KH2P045g， MgSO40.7g， CaC035g加水至1L，調pH為6.5， 121。C滅菌20min，制成種子 培養基；
將斜面的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO丄llO接種于所述種子 培養基中，35'C， 250r/min搖床振蕩，培養24小時，制成種子培養液； . (2)發酵
稱取L-山梨糖120g，玉米漿50g，尿素25g， KH2P043g， MgS041.2g， CaCO310g 加水至1L,調pH為6.5， 12rC滅菌20min，制成發酵培養基；
將所述種子培養液以體積比為15%的比例，接入所述發酵培養基中，35°C， 250 r/min 搖床振蕩，發酵培養48小時，在所述發酵培養36小時，加入半胱氨酸，使巰基終濃度為 30mM。
可以用發酵培養O小時，發酵培養l小時，發酵培養2小時，發酵培養5小時，發酵 培養10小時，發酵培養15小時，發酵培養18小時，發酵培養24小時或發酵培養30小時 替代本實施例的發酵培養36小時組成新的實施例。 實施例4
提高氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸的方法，包括如下步驟 (1)種子培養
稱取L-山梨糖30g，玉米漿4g，牛肉膏2g，酵母浸粉5g，尿素1.5g，蛋白胨7g， KH2P04lg， MgSO在3g， CaC032g加水至1L，調pH為6.7， 12rC滅菌20min，制成種子 培養基；
將斜面的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO丄110接種于所述種子 培養基中，3(TC， 200r/min搖床振蕩，培養36小時，制成種子培養液；(2)發酵
稱取L-山梨糖60g，玉米漿30g，尿素15g， KH2P041.5g， MgSO40.5 g， CaC035 g 加水至1L，調pH為6.8, 12rC滅菌20min，制成發酵培養基；
將所述種子培養液以體積比為10%的比例，接入所述發酵培養基中，3(TC， 200 r/min 搖床振蕩，發酵培養72小時，在所述發酵培養24小時，加入輔酶A，使巰基終濃度為5mM。
可以用在發酵培養O小時，發酵培養l小時，發酵培養2小時，發酵培養5小時，發 酵培養10小時，發酵培養15小時，發酵培養18小時，發酵培養30小時或發酵培養36小 時替代本實施例的發酵培養24小時組成新的實施例。 實施例5
2-酮基-L-古龍酸和L-山梨糖含量測定方法 采用高效液相色譜法(HPLC)。
樣品制備取培養不同時間的發酵液lmL于1.5mL離心管中，10000r/min轉速離心3min， 取上清100nL于1.5mL離心管中，并加入900jiL流動相(5mMH2S04)得到稀釋十倍的樣 品。振蕩混勻后，用0.22^1111的纖維素微孔濾膜過濾樣品，得到待測樣品。
高效液相色譜條件色譜柱bio-radHPX-87H，流動相5mMH2S04，流速0.6mL/min， 柱溫65°C，示差檢測器。 實施例6
還原型谷胱甘肽(GSH)， 二硫蘇糖醇(DTT)，半胱氨酸(cys)和輔酶A (CoA)提 高氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans) CGMCC NO丄llO生長速度和產酸效率的測試。
以氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO.1.110為目標菌株，測定該菌 株在有無巰基化合物添加的情況下的酸產量和生物量變化。
采用實施例'l的方法進行種子培養和發酵，用0mg/mlGSH或lmg/mlGSH或0.5mg/ml DTT或0.4 mg/ml cys或2.5mg/ml CoA替代實施例1中的lmg/mlGSH，使巰基終濃度為3mM 時，進行測試。
測試結果如圖l，圖2所示，結果顯示加入GSH后，發酵72小時后氧化葡糖桿菌發 酵液中的2-酮基-古龍酸的濃度為37.75 mg/ml,而空白組(未加巰基化合物)酸產量為11.25 mg/ml，提高了 2.276倍。發酵72小時后氧化葡糖桿菌的生物量為0.81mg/ml，相比于空白 組的0.27 mg/ml,提高了2倍。加入DTT后，發酵72小時后氧化葡糖桿菌發酵液中的2-酮基-古龍酸的濃度為36.52 mg/ml,,而空白組酸產2-酮基-古龍酸量為11.25 mg/ml,提高了 2.246倍。72小時后氧化葡糖桿菌的生物量為0.59mg/ml，相比于空白組的0.27 mg/ml，提 高了1.18倍。加入cys后，發酵72小時后氧化葡糖桿菌發酵液中的2-酮基-古龍酸的濃度 為30.43 mg/ml，而空白組酸產2-酮基-古龍酸量為11.25 mg/ml，提高了 1.704倍。72小時 后氧化葡糖桿菌的生物量為0.56mg/ml，相比于空白組的0.27mg/ml，提高了 1.078倍。力口 入CoA后，發酵72小時后氧化葡糖桿菌發酵液中的2-酮基-古龍酸的濃度為35.00 mg/ml， 而空白組酸產2-酮基-古龍酸量為11.25 mg/ml，提高了 2.211倍。72小時后氧化葡糖桿菌的 生物量為0.87mg/ml，相比于空白組的0.27 mg/ml，提高了 2.22倍。上述結果表明巰基化合物加入后能大幅度的提高氧化葡糖桿菌的產酸能力和生長速度。 實施例7
加入不同濃度還原型谷胱甘肽(GSH)提高氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans) CGMCC NO丄llO生長速度和產2-酮基-古龍酸效率的測試。
以氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO丄110為目標菌株，測定該菌 株在添加不同濃度的巰基化合物情況下的2-酮基-古龍酸產量和生物量變化。
采用實施例1的方法進行種子培養和發酵，用0mg/ml GSH,或0.1 mg/ml GSH，或0.5 mg/ml GSH，或0.8 mg/ml GSH,或1.0 mg/ml GSH，或2.0 mg/ml GSH，或5.0mg/ml GSH 替代實施例1中的1.0mg/mlGSH，進行測試。
以氧化葡糖桿菌為目標菌株，測定該菌株加入O.l， 0.5， 0.8， 1.0， 2.0， 5.0mg/mlGSH 后，2-酮基-古龍酸產量和生物量變化。如下圖3所示，結果顯示隨著加入lmg/mlGSH的 促進產2-酮基-古龍酸的效果最好，其余含量對氧化葡糖桿菌產2-酮基-古龍酸和生長的促 進作用弱于加入lmg/mlGSH的促進效果，上述不同濃度的GSH加入后72小時2-酮基-古 龍酸產量依次為18.5， 20.13， 43.52， 48.67， 52.35， 42.11， 34.65mg/ml。如圖4所示的生 物量提高的趨勢與圖3中產酸結果相吻合。上述不同濃度的GSH加入后72的生物量依次 為0.27， 0.27, 0.71， 0.75， 0.81， 0.76， 0.65mg/ml。 實施例8
加入相同濃度的還原型谷胱甘肽(GSH)對不同接種濃度的氧化葡糖桿菌(CGMCC NO丄110)提高生長速度和產2-酮基-古龍酸效率的測試。
以氧化葡糖桿菌為目標菌株，測定不同起始濃度的氧化葡糖桿菌產2-酮基-古龍酸能力 的影響。 .
采用實施例1的方法進行種子培養和發酵培養基的制備，接下來 第一種情況將所述種子培養液以體積比為10%的比例，接入所述發酵培養基中，30 °C， 220r/min搖床振蕩，發酵培養72小時。
第二種情況將所述種子培養液以體積比為1%的比例，接入所述發酵培養基中，30 。C， 220r/min搖床振蕩，發酵培養72小時，在所述發酵培養0小時，加入還原型谷胱甘肽 lmg/ml，使巰基終濃度為3mM。
第三種情況將所述種子培養液以體積比為10%的比例，接入所述發酵培養基中，30 'C， 220r/min搖床振蕩，發酵培養72小時，在所述發酵培養0小時，加入還原型谷胱甘肽 lmg/ml，使巰基終濃度為3mM。
第四種情況將所述種子培養液以體積比為100%的比例，接入所述發酵培養基中，30 °C， 220r/miri搖床振蕩，發酵培養72小時，在所述發酵培養0小時，加入還原型谷胱甘肽 lmg/ml，使巰基終濃度為3mM。
還原型谷胱甘肽(GSH)提高不同濃度氧化葡糖桿菌生長速度和產酸效率的測試。測 定1.0mg/ml GSH的對初始菌體濃度不同的的氧化葡糖桿菌的產酸能力和生物量的影響。結 果如圖5表明，對不同初始濃度的氧化葡糖桿菌，GSH均有促進其產2-酮基-古龍酸的作用，且最終2-酮基-古龍酸產量與初始濃度呈正相關。圖6中的生物量變化趨勢也表明GSH能
夠促進各起始濃度的氧化葡糖桿菌生長，其中生物量與初始濃度正相關。
實施例9
在不同發酵時刻加入相同濃度還原型谷胱甘肽(GSH)提高氧化葡糖桿菌CGMCC NO丄llO產2-酮基-古龍酸效率和生長速度的測試。
以氧化葡糖桿菌為目標菌株，測定在不同發酵時刻加入相同濃度還原型谷胱甘肽對氧 化葡糖桿菌產酸能力的影響。
采用實施例1的方法進行種子培養和發酵，用未加入GSH或發酵時刻0小時，3小時， 6小時，12小時，24小時，36小時替代實施例1中的0時刻加入，進行測試。
測定該菌株以0， 3， 6， 12， 24， 36小時加入lmg/ml GSH后，2-酮基-古龍酸產量和 生物量變化。如圖7所示，結果顯示隨著加入GSH的時間的延長，其對氧化葡糖桿菌產 2-酮基-古龍酸和生長的的促進作用依次減弱，24小時加入后對產酸和生長的促進作用幾乎 消失，不加入GSH和O, 3， 6， 12， 24， 36小時加入1.0mg/ml GSH的72小時時2-酮基-古龍酸產量依次為11.25， 49.48， 41.69， 36.92， 35.05， 10.15， 10.14mg/ml。圖8表明氧化 葡糖桿菌的生物量也呈現與產2-酮基-古龍酸量相同的趨勢。不加入GSH和O， 3， 6， 12， 24， 36小時加入1.0mg/mlGSH的72小時時生物量依次為0.27， 0.81， 0.68, 0.56， 0.52, 0.32， 0.32mg/ml。
權利要求
1.提高氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸的方法，其特征是包括如下步驟(1)種子培養稱取L-山梨糖10-50g，玉米漿2-10g，牛肉膏2-10g，酵母浸粉2-10g，尿素0.5-5g，蛋白胨2-10g，KH2PO40.5-5g，MgSO40.1-0.7g，CaCO30.5-5g，加水至1L，調pH為6.5～7.0，121℃滅菌20min，制成種子培養基；將斜面的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC NO.1.110接種于所述種子培養基中，28-35℃，160-250r/min搖床振蕩，培養24-48小時，制成種子培養液；(2)發酵稱取L-山梨糖40-120g，玉米漿10-50g，尿素10-25g，KH2PO40.5-3g，MgSO40.2-1.2g，CaCO31-10g加水至1L，調pH為6.5～7.5，121℃滅菌20min，制成發酵培養基；將所述種子培養液以體積比為5％-15％的比例，接入所述發酵培養基中，28-35℃，160-250r/min搖床振蕩，發酵培養48～96小時，在所述發酵培養0小時至36小時之間的任意時刻，加入巰基化合物，使巰基終濃度為0.1-30mM。
2. 根據權利要求1所述的提高氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸的方法，其特征是所述巰基 化合物為還原型谷胱甘肽，二硫蘇糖醇，半胱氨酸或輔酶A。
3. 根據權利要求1所述的提高氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸的方法，其特征是所述步驟(1) 為稱取L-山梨糖20g，玉米漿3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素lg，蛋白胨10g， KH2P04lg， MgSO40.2g， CaC03l g加水至1L，調pH為6.8， 121。C滅菌20min，制成種子 培養基；將斜面的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans) CGMCC NO.1.110接種于所述種子 培養基中，30°C， 220r/min搖床振蕩，培養36小時，制成種子培養液。
4. 根據權利要求1所述的提高氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸的方法，其特征是所述步驟(2) 為稱取L-山梨糖80g，玉米漿20g，尿素12g， KH2P04lg， MgSO40.5 g， CaC035g 加水至1L，調pH為7.0， 12rC滅菌20min，制成發酵培養基；將所述種子培養液以體積比為10%的比例，接入所述發酵培養基中，30°C, 220 r/min 搖床振蕩，發酵培養72小時，在所述發酵培養0小時至36小時之間的任意時刻，加入巰 基化合物，使巰基終濃度為3mM。
全文摘要
本發明公開了提高氧化葡糖桿菌產2-酮-L-古龍酸的方法，步驟為(1)種子培養將斜面的氧化葡糖桿菌接種于種子培養基中，制成種子培養液；(2)發酵將種子培養液接入發酵培養基中，搖床振蕩，發酵培養48～96小時，在所述發酵培養0小時至36小時之間的任意時刻，加入巰基化合物，使巰基終濃度為0.1-30mM。本發明能提高氧化葡糖桿菌生長速度和產2-酮-L-古龍酸效率，達到部分取代伴生菌的伴生效果的目的，從而可以減少伴生菌巨大芽孢桿菌的用量，減少培養基的成本，并可以減少污染。
文檔編號C12P7/40GK101603060SQ20091006969
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月10日 優先權日2009年7月10日
發明者宏 儀, 元英進, 劍 周, 王麗麗, 佳 薛, 倩 馬 申請人:天津大學