專利名稱：一種水環境病毒高效、快速的富集方法
技術領域：
本發明涉及一種水環境中病毒高效而快速的富集方法。
背景技術：
環境中存在的各種致病病毒對人類健康造成了極大的危害。目前已經證實，城市 污水尤其生活污水中含有大量種類的病毒，如脊髓灰質炎病毒、甲肝病毒、輪狀病毒等等， 且含量在5X106PFU/L以上。這些病毒以水為媒介，經常引發傳染病的爆發流行，因此必須 對這些病毒進行高效而快速的監測，阻斷其傳播的途徑。目前，對環境水體和污水中病毒的富集方法較多，包括陰電荷、陽電荷過濾濃集方 法，無機、有機沉淀法，無煙煤、樹脂吸附法等。Fattal等采用陽電荷吸附-洗脫方法可以 使水中腸道病毒回收率達到50 77%;Ma等采用MK和IMDS過濾方法可以回收水中73 90%的Polio病毒；Bass等報道采用“Zeta Plus”陽電荷過濾器結合有機絮凝沉淀富集 回收污水中的輪狀病毒，結果發現回收的病毒低于檢測限；Singh等采用同種設備富集水 中的細菌病毒_f2噬菌體、MS2噬菌體，回收率只有16% 44% ；Goyal等的回收率也只 有55%左右；Rose及Kittigul分別比較了陰、陽電荷富集水中細菌病毒和輪狀病毒的效 果，結果兩者的回收率相當；目前報道污水中病毒回收率最高的是Mehnert等采用“Zeta Plus”陽電荷過濾器回收污水中的輪狀病毒，并用PCR方法檢測，病毒回收率達81%;此外， 還有采用有機絮凝或鋁鹽沉淀、玻璃纖維、浙青煤、樹脂等回收污水中的病毒，并用細胞培 養法或PCR檢測病毒，回收率在40% 80%左右。由此可見，盡管水中病毒的富集方法已 有較多的報道，但效果好或具有實用價值的卻很少，主要問題有或病毒回收率低(大多數 低于60% )，效果不穩定；或易受水質條件影響，尤其是污水濁度的限制；或可處理的水樣 量太小(絮凝沉淀法處理污水量一般小于1升)，無實際應用價值；或在回收病毒同時，也 將水中對組織細胞培養有毒性的物質濃集，導致假陽性結果；或操作復雜，成本較高。
發明內容
本發明的目的是提供一種高效、快速的水環境病毒富集方法。本發明可以將待檢 樣本中大于50個/ml的病毒進行分離與濃集，分離濃集時間為30分鐘左右。本發明的技術方案概述如下一種高效、快速的水環境中病毒富集方法，其特征是包括如下步驟①葡聚糖納米磁顆粒的制備a.將 0. 5 1. 2mol/L 的 FeCl3 · 6H20 水溶液 10 20ml 與 0. 5 2. 5mol/L FeCl2 ·4Η20水溶液2 6ml混合，在氮氣氛圍下，滴加至10 30ml的30 70%的葡聚糖 T-40水溶液中，所述葡聚糖T-40水溶液的濃度為g/ml百分比濃度，50 70°C，水浴10 30分鐘，在150 500轉/分鐘的攪拌下，10 30分鐘內，向混合液中滴加3 7mol/L的 氨水35-45ml，溫度保持50 70°C，并始終通氮氣，制成懸液；b.將懸液用乙酸或稀鹽酸調至PH為6. 0-8. 0 ；
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C.將懸液中的聚集體在600Xg下離心10 20分鐘去除游離的葡聚糖后，經聚丙 烯酰胺葡聚糖S-300凝膠層析柱過濾獲得葡聚糖納米磁顆粒，其中洗脫平衡液為pH為6 8的0. 005 0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液，收集的顆粒經冷凍干燥，最后獲得的葡聚糖納米磁 顆粒懸液的濃度為5 10mg/ml ；d.取葡聚糖納米磁顆粒懸液0. 5 2. Oml，加入10 30mmol/L NaIO4水溶液 0. 25ml, 150轉/分鐘避光阻氧震蕩0. 5 12小時后，加入1 3mol/L乙二醇的水溶液 0. 1 0. 3ml終止氧化，用pH為6 8的0. 005-0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液4°C透析18 48 小時，去除過量的NaIO4,使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為3 8mg/ml ；②納米免疫磁性顆粒懸液的制備向葡聚糖納米磁顆粒懸液中加入10 30μ g/mg葡聚糖納米磁顆粒量的病毒抗 體，混勻后，4°C避光放置6 24小時，加入0. 2 lmol/LNaBH4水溶液還原10 60分鐘， 加入NaBH4的量為0. 1 0. 5ml/ml葡聚糖納米磁顆粒懸液，多余的抗體用S印hacryl S-300 凝膠層析柱過濾與結合物分離，制成特定病毒的納米免疫磁顆粒懸液。③富集水環境中特定病毒在Iml檢測樣本中加入納米免疫磁顆粒懸液2 20 μ 1，吸附3 20分鐘，在 15 35°C，磁板吸引2-10分鐘，棄上清后用含體積百分比為0. 05% 0. 的吐溫-20的 0. 005 0. Olmol/L的磷酸鹽緩沖液0. 5 1. Oml洗滌一次，加入0. Iml生理鹽水即可制成
濃集的病毒懸液。病毒回收率(回收后溶液中的病毒量/回收前水中的病毒量)X 100%腸道病毒的指示微生物為f2噬菌體、脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒。本發明的優點是1、操作簡便，不需要任何儀器設備；2、納米免疫磁顆粒濃集、分離特定病毒只需2 30分鐘。
附圖為本發明采用TECNAI-20透射電子顯微鏡拍得的納米免疫磁顆粒電鏡照片， 放大倍數X 100000。照片顯示葡聚糖納米磁顆粒核心大小為5 lOnm。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明實施例1葡聚糖納米磁顆粒的制備a)將 0. 5 1. 2mol/L 的 FeCl3 · 6H20 水溶液 10 20ml 與 0. 5 2. 5mol/L FeCl2 ·4Η20水溶液2 6ml混合，在氮氣氛圍下，滴加至10 30ml的30 70%的葡聚糖 T-40水溶液中，所述葡聚糖T-40水溶液的濃度為g/ml百分比濃度，50 70°C，水浴10 30分鐘，在150 500轉/分鐘的攪拌下，10 30分鐘內，向混合液中滴加3 7mol/L的 氨水35-45ml，溫度保持50 70°C，并始終通氮氣，制成懸液；b)將懸液用乙酸或稀鹽酸調至pH為6. 0-8. 0 ；c)將懸液中的聚集體在600 X g下離心10 20分鐘去除游離的葡聚糖后，經聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝膠層析柱過濾獲得葡聚糖納米磁顆粒，其中洗脫平衡液為pH為6 8的0. 005 0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液，收集的顆粒經冷凍干燥，最后獲得的葡聚糖納米磁 顆粒懸液的濃度為5 10mg/ml ；d)取葡聚糖納米磁顆粒懸液0. 5 2. Oml,加入10 30mmol/L NaIO4水溶液 0. 25ml, 150轉/分鐘避光阻氧震蕩0. 5 12小時后，加入1 3mol/L乙二醇的水溶液 0. 1 0. 3ml終止氧化，用pH為6 8的0. 005-0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液4°C透析18 48 小時，去除過量的NaIO4,使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為3 8mg/ml。實施例2富集水環境中f2噬菌體，包括如下步驟
①f2噬菌體納米免疫磁性顆粒懸液的制備向葡聚糖納米磁顆粒懸液中加入10 μ g/mg葡聚糖納米磁顆粒量的f2噬菌體抗 體，混勻后，4°C避光放置6小時，加入0. 2mo VLNaBH4水溶液還原60分鐘，加入NaBH4的量 為0. lml/ml葡聚糖納米磁顆粒懸液，多余的抗體用Sephacryl S-300凝膠層析柱過濾與結 合物分離，制成f2噬菌體納米免疫磁顆粒懸液；③富集水環境中f2噬菌體在Iml檢測樣本(分別含有5，10，20，50，100PFU/mL的f2噬菌體)中加入f2噬菌 體納米免疫磁顆粒懸液2 μ 1，吸附20分鐘，在35°C，磁板吸引2分鐘，棄上清后用含體積百 分比為0. 05%的吐溫-20的0. 005mol/L的磷酸鹽緩沖液1. Oml洗滌一次，加入0. Iml生理 鹽水制成懸液，即可獲得富集的f2噬菌體，各樣品病毒回收率見表1。結果表明，f2噬菌體 納米免疫磁性顆粒的靈敏度為20PFU/ml，當水樣中病毒含量超過100PFU/mL時，病毒回收 率在83%以上。表1回收Iml樣本中f2噬菌體的靈敏度及回收率(x±s, n=3) *:未檢出。實施例3富集水環境中脊髓灰質炎病毒，包括如下步驟①脊髓灰質炎病毒納米免疫磁性顆粒懸液的制備向葡聚糖納米磁顆粒懸液中加入10 μ g/mg葡聚糖納米磁顆粒量的脊髓灰質炎病 毒抗體，混勻后，4°C避光放置6小時，加入0. 2mo VLNaBH4水溶液還原60分鐘，加入NaBH4 的量為0. lml/ml葡聚糖納米磁顆粒懸液，多余的抗體用Sephacryl S-300凝膠層析柱過濾 與結合物分離，制成脊髓灰質炎病毒納米免疫磁顆粒懸液；③富集水環境中脊髓灰質炎病毒在Iml檢測樣本(分別含有5，10，20，50，100PFU/mL的脊髓灰質炎病毒)中加入脊 髓灰質炎病毒納米免疫磁顆粒懸液2 μ 1，吸附20分鐘，在35°C，磁板吸引2分鐘，棄上清后 用含體積百分比為0. 05%的吐溫-20的0. 005mol/L的磷酸鹽緩沖液1. Oml洗滌一次，加入0. Iml生理鹽水制成懸液，即可獲得富集的脊髓灰質炎病毒，病毒回收率見表2。結果表明， 脊髓灰質炎病毒納米免疫磁性顆粒的靈敏度為50PFU/ml，當水樣中病毒含量超過100PFU/ mL時，病毒回收率在78%以上。表2回收Iml樣本中脊髓灰質炎病毒的靈敏度及回收率(^±s，n=3) *:未檢出。實施例4富集水環境中柯薩奇病毒，包括如下步驟①柯薩奇病毒納米免疫磁性顆粒懸液的制備向葡聚糖納米磁顆粒懸液中加入10 μ g/mg葡聚糖納米磁顆粒量的柯薩奇病毒抗 體，混勻后，4°C避光放置6小時，加入0. 2mo VLNaBH4水溶液還原60分鐘，加入NaBH4的量 為0. lml/ml葡聚糖納米磁顆粒懸液，多余的抗體用Sephacryl S-300凝膠層析柱過濾與結 合物分離，制成柯薩奇病毒納米免疫磁顆粒懸液；②富集水環境中柯薩奇病毒取5份Iml檢測樣本(分別含有5，10，20，50，100PFU/mL的柯薩奇病毒)，向其中 加入柯薩奇病毒納米免疫磁顆粒懸液2 μ 1，吸附20分鐘，在35°C，磁板吸引2分鐘，棄上清 后用含體積百分比為0. 05%的吐溫-20的0. 005mol/L的磷酸鹽緩沖液1. Oml洗滌一次，加 入0. Iml生理鹽水制成懸液，即可獲得富集的柯薩奇病毒，病毒回收率見表3。結果表明，柯 薩奇病毒納米免疫磁性顆粒的靈敏度為50PFU/ml，當水樣中病毒含量超過100PFU/mL時， 病毒回收率在74%以上。表3回收Iml樣本中柯薩奇病毒的靈敏度及回收率(5±s，n=3) *:未檢出。
權利要求
一種水環境病毒高效、快速的富集方法，其特征是包括如下步驟①葡聚糖納米磁顆粒的制備a.將0.5～1.2mol/L的FeCl3·6H2O水溶液10～20ml與0.5～2.5mol/L FeCl2·4H2O水溶液2～6ml混合，在氮氣氛圍下，滴加至10～30ml的30～70％的葡聚糖T 40水溶液中，所述葡聚糖T 40水溶液的濃度為g/ml百分比濃度，50～70℃，水浴10～30分鐘，在150～500轉/分鐘的攪拌下，10～30分鐘內，向混合液中滴加3～7mol/L的氨水35 45ml，溫度保持50～70℃，并始終通氮氣，制成懸液；b.將懸液用乙酸或稀鹽酸調至pH為6.0 8.0；c.將懸液中的聚集體在600×g下離心10～20分鐘去除游離的葡聚糖后，經聚丙烯酰胺葡聚糖S 300凝膠層析柱過濾獲得葡聚糖納米磁顆粒，其中洗脫平衡液為pH為6～8的0.005～0.02mol/L磷酸鹽緩沖液，收集的顆粒經冷凍干燥，最后獲得的葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為5～10mg/ml；d.取葡聚糖納米磁顆粒懸液0.5～2.0ml，加入10～30mmol/LNaIO4水溶液0.25ml，150轉/分鐘避光阻氧震蕩0.5～12小時后，加入1～3mol/L乙二醇的水溶液0.1～0.3ml終止氧化，用pH為6～8的0.005 0.02mol/L磷酸鹽緩沖液4℃透析18～48小時，去除過量的NaIO4，使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為3～8mg/ml；②納米免疫磁性顆粒懸液的制備向葡聚糖納米磁顆粒懸液中加入10～30μg/mg葡聚糖納米磁顆粒量的病毒抗體，混勻后，4℃避光放置6～24小時，加入0.2～1mol/LNaBH4水溶液還原10～60分鐘，加入NaBH4的量為0.1～0.5ml/ml葡聚糖納米磁顆粒懸液，多余的抗體用Sephacryl S 300凝膠層析柱過濾與結合物分離，制成特定病毒的納米免疫磁顆粒懸液。③分離、濃集水環境中病毒在1ml檢測樣本中加入納米免疫磁顆粒懸液2～20μl，吸附3～20分鐘，在15～35℃，磁板吸引2 10分鐘，棄上清后用含體積百分比為0.05％～0.1％的吐溫 20的0.005～0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液0.5～1.0ml洗滌一次，加入0.1ml生理鹽水即可制成濃集的病毒懸液。
全文摘要
本發明公開了一種水環境病毒快速而高效的富集方法。由以下步驟組成(1)向1ml檢測樣本中加入病毒納米免疫磁顆粒懸液2μl，吸附20分鐘；(2)在35℃，磁板吸引2分鐘；(3)棄上清后用含體積百分比為0.05％的吐溫-20的0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液1.0ml洗滌一次，加入0.1ml生理鹽水制成懸液，即可獲得富集的病毒，本發明可使病毒回收率達70％以上，回收靈敏度為50PFU/ml。本發明涉及的納米免疫磁顆粒用于富集水環境中的病毒，具有快速、高效、效果穩定的優點。
文檔編號C12R1/93GK101928697SQ200910069390
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月23日 優先權日2009年6月23日
發明者李君文, 王新為, 王景峰, 諶志強, 邱志剛, 金敏, 陳照立 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所