專利名稱：：殺滅線蟲菌制劑及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及環境生物
技術領域：
，具#^及一種殺^±壤線蟲菌制劑及其制備方法。
背景技術：
：土壤線蟲顯著增多，植物病害的種類和范圍不斷增加，這都^h壤生態系,至臓壞的明證。其中土壤線蟲是直接影響農作物產量的土壤害蟲，尤其是種植花生、紅薯的土壤，線蟲可以把整塊整±央土地的花生、紅薯吃光或破壞,幾乎絕收。以前只是尋求化學殺蟲劑，如涕K^(Aldicarb)，第一年有效，第二年則幾乎無效，而且它所造成的土壤污染幾十年都消除不掉。所以，研究開發微生物制劑殺滅線蟲勢在必行。國內外己有一些研究，但是，還未見高密度、高活性，可大面積f頓的菌制齊啲J隨。
發明內容本發明所要解決的技術問題是掛共一種高密度、高活性的殺滅土壤線蟲菌制劑及其制備方法。本發明解決該技術問^^f采用的技術方案是本發明殺滅線蟲的菌制劑由巨大芽孢桿菌(&w77"sme辟ten'鵬)、熒光假單胞菌(尸se"obi770/7a9/7〃Qre5ce/7Sy)禾口細l^l5菌(5"tee5tQ27jce51啦'cro/7ara5)優化纟且合組成的復合菌群，其中各WMm比例是l:0.5l:11.5，吸附載體為腐殖酸。本發明的殺滅線蟲的菌制劑的制備方法，包括下述步驟1)將保存的巨大芽孢桿菌(泡w77"觀e辟ter7'湖)、熒光假單胞菌(尸sew/o嫩"as/7〃oresce/7^和細黃H5菌(分aasto邁/cas啦'cro/7sms)斜面菌種活化，分別搖瓶培養；基本培養基:可溶性淀粉培養基培養，具體配加卩下:可溶性淀粉20g，KN03lg,NaCl0.5g,K2HP040.5g，MgS04.7H200.5g,FeS040.Olg，蒸餾7jU000raL，pH7.07.2，0.1Mpa，121°C高壓滅菌2030min;2830。C培養1224h;2)將各菌群混合，二級液^T大培養，總體積520L，以玉米面代替可溶性淀粉培養基中的可溶性淀粉，并添加驢百分比O.1%的腐殖酸，其《械分和比例與可溶性培養對瞷，接種量^^只百分比為5%10%，2830。C培養1224h;菌群密度為5X107mL_8X10VmL;3)再，液體擴大培養，總體積10倍于2)，擴大培養基同2)，接種量懶只百分比為5%10%，2830。C培養1224h;菌群密度為1X109/mL-9X109/mL;4)以腐殖酸為載銅每混合菌群均勻吸附、固定化于腐殖酸匕腐殖酸與的步驟3)的擴大培養液重量比為35，菌職度為2X108/mL-3X10VmL。3巨大^fS桿菌(5""7/^y附egaten'wm)、熒光假單胞菌(尸5"e"Ghcc!/7a51/7〃ore5ce/75^禾卩細黃鏈霉菌OS/re/to/^cas附z'm^m^)，都是能產生幾丁質辭口腦酶的菌，倉灘破壞線蟲的腸壁，從而殺滅線蟲；而且SH種菌都有可以fg植物根生長、改善根圍生態環境的作用。將三種菌活化經三級液^T大培養并吸附、固定化于腐殖社制備成菌制劑。三株菌種均購于中國科學院微生物研娜菌種臓中心。殺滅土壤線蟲菌制劑是J^H種菌群優化組合的復合微生物，SH種菌都是農業部允許4頓的，、無害的菌。本發明的有益效果1)復合菌固定化于腐殖社，使每克復合菌制劑的有效離落數(CFU)可高達10個億以上(2~3X109/g)，幾乎超lj了最大可能數，至今絲見如此高含菌量菌制齊啲J隨。腐殖酸不僅能為所培養菌掛共一些營養成分，還由于其網狀結構，具有較大的比表面積，所以能在單位體積內附著吸附固定化較多的菌體。所以，有效菌一旦MA土壤可以很決形成優勢菌群，發揮殺滅線蟲的作用，殺滅率94-98%。2)土壤線蟲的腸壁細胞含，多的幾丁質，而巨大^&桿菌等菌能分泌較多的幾丁質酶。所以，土壤線蟲一旦遇到巨大飾桿菌等菌體，由于其腸壁觀ij幾丁質酶的破壞，最后m而死。巨大^m桿菌還具有fct壤固定化的磷轉化為可溶性磷，可溶性磷是植物可利用的磷。細黃鶴菌，能產生抗生素抗病、驅蟲，分泌刺激素，艦植物生長，轉化礦物質。熒光假單胞菌是促根生長、防治土傳病菌的有效菌種，而且還有,土壤殘留農藥等污染物的作用。三種菌相互配合，不僅殺蟲驅蟲而且^i4、修fch壤生態系統平衡。具體實施方案實施例1按下列步513S行1)將4'C保存的巨大芽孢桿菌(fecj7&觀e辟te27'湖)、熒光假單胞菌(/^e"cfcffi70朋s/7"oresce/JsJ和細H，菌(分aasto/nyces啦'cro/7ams)余4面菌種活H分別搖瓶i錄。以可溶性淀粉培養基培養，具體配別卩下可溶性淀粉20g，KN03lg，NaCl0.5g,lOHX0.5g，MgS04.7H200.5g，FeS040.Olg,蒸餾水lOOOraL，pH7.2，121。C高壓滅菌30min。28。C培養24h。2)二級液^T^t咅養(6L)，以就面代替代替上述培養基中的可溶性淀粉，并加入0.1%腐殖酸(質量分數)，接種量5%，28。C培養24h。。3)Hm液體擴大培養(60L)，培養基同上；接種量10%，28。C培養24h。4)以腐殖酸為載懶各菌液固定、吸附于腐殖B。實施例2按下列步^ffl^亍1)將4。C保存的巨大芽孢桿菌(泡c^W"柳e辟terAra7)、熒光假單胞菌(化e"。teo/7as/7〃oresce/W和細黃鏈霉菌(分a"to,ces啦'cro/7ams)三種菌種斜面活化，分別搖瓶培養。以可溶'性^定粉培養^T;Ut養，具體配方如下可溶性淀粉20g，KN03lg,NaCl0.5g'1(掛040.5g,MgS04.7H200.5g，FeS040.Olg，蒸衞JU000mL，pH7.0，121。C高壓滅菌30min。28°C培養12h。2)二級液體擴大培養(10L)，以玉米面代替上述培養基中的可溶性淀粉，并加入0.1%腐殖酸(質量分數)，接種量5%，28。C培養12h。。3)H^液體擴大培養(IOOL)，培養基同上，接種量10%，28。C培養12h。4)以腐殖酸為載湘各菌液固定、吸附于腐殖fei:。實施例3按下列步職行1)將4。C保存的巨大芽孢桿菌(fe"'7^/57Z/e卵ter2'^)、熒光假單胞菌(/^e"ofcffio"as/7i/orescm^和細黃鏈霉菌(分aesto,ms孤'cro/7ams)三種菌種斜面活化，分別搖瓶培養。以可、溶性淀粉、培養ST;^咅養，具體配加口下可溶性淀粉20g，KN03lg，NaCl0.5g'K掛(X0.5g，MgS04.7H200.5g，FeS040.Olg,蒸餾7K1000mL，pH7.0，121。C高壓滅菌30min。28。C培養12h。2)二級液體擴力咅養(20L)，以玉米面代替上述培養基中的可溶性淀粉，并加入0.1%腐殖酸(重量分激，接種量5%，28。C培養24h。。3)H0液體擴^i咅養(200L)，培養基同上，接種量10%，28。C培養24h。4)以腐殖酸為載懶每菌液固定、吸附于腐殖^±，腐殖酸與的步驟3)的擴大培養M量比為4。實施例4殺織蟲菌制劑的效果檢測將本發明實施例3的殺滅線蟲菌制劑施于花生地、紅薯地和蔬菜地；1個月后取施用菌帝擠U后的土壤，釆用離心浮選微離，將土壤中的線蟲及死體、非游動性線蟲在內的大部分線蟲分離出來，具體步驟為1)采用隨機取樣法，過18目篩，fch壤樣品10克放在離心管內，加水1(M5mL充分振蕩贅混合；2)將比重為1.20的蔗糖tK溶液(蔗糖800克溶于1L水中)1(M5mL，用移液管働口樣器方爐離心管底部；3)在離心力2500g，離心5min。溶液分成兩層，線蟲聚,交界層，用滴管吸取交界層的線蟲至10mL表皿內；4)將表皿置于解剖鏡下計數；5)殺滅效果如表l，表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權利要求1.一種殺滅線蟲的菌制劑，其特征在于該菌制劑由巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)和細黃鏈霉菌(Staestomycesmicroflavus)優化組合組成的復合菌群，其中各菌菌落數比例是1∶0.5～1∶1～1.5，吸附載體為腐殖酸。2.如權利要求1戶脫的殺滅線蟲的菌制劑的制備方法，其特征在于它包括下述步驟1)將保存的巨大芽孢桿菌(泡w77"5眠辟ter/，)、熒光假單胞菌(/^ew/cwcwas/7"omsce/w;>和細黃^^菌(分aasto歷jces啦'cro/7ams)斜面菌種活化，分別搖瓶i咅養；基本培養基可溶性淀粉培養基培養，具體配別n下:可溶性淀粉20g,KN03lg，NaCl0.5g,KsHP040.5g，MgS04.7H200.5g,FeS040.Olg，蒸餾水1000mL，pH7.07.2,0.1Mpa，121°C高壓滅菌2030min;2830。C培養1224h;2)將各菌l^昆合，二級液^T大培養，總^f只520L,以5*面代替可溶性淀粉培養基中的可溶性淀粉，并添加重量百分比0.1%的腐殖酸，其^1M分和比例與可溶性培養對目同，接種量體積百分比為5%10%，2830。C培養1224h;菌群密度為5X108/mL-8X107mL;3)再，液體擴大培養，總體積10倍于2),擴大培養基同2)，接種量體積百分比為5%10%，2830。C培養1224h;菌群密度為1X109/mL_9X10VmL;4)以腐殖酸為載術射昆合菌群均勻吸附、固定化于腐殖酸上，腐殖酸與的步驟3)的擴#咅養M量比為35，菌群密度為2XlOVmL-3X109/mL。全文摘要本發明一種殺滅線蟲菌制劑及其制備方法。本發明殺滅線蟲的菌制劑由巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)和細黃鏈霉菌(Staestomycesmicroflavus)優化組合組成的復合菌群，其中各菌菌落數比例是1∶0.5～1∶1～1.5，吸附載體為腐殖酸。本發明的殺滅線蟲的菌制劑的制備方法，包括三級液體擴大培養，吸附于載體上。有效菌一旦施入土壤可以很快形成優勢菌群，發揮殺滅線蟲的作用，殺滅率94-98％。三種菌相互配合，不僅殺蟲驅蟲而且促進、修復土壤生態環境。文檔編號C12N1/20GK101564046SQ200910069198公開日2009年10月28日申請日期2009年6月9日優先權日2009年6月9日發明者崔合香,崔小會,張清敏,薛洪濤,齊建超申請人:南開大學