專利名稱：抗人Her2單克隆抗體雜交瘤細胞系、單克隆抗體、試劑盒及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種可以特異性識別人Her2分子，用于腫瘤的診斷、預后 判斷，或指導治療腫瘤的抗人Her2單克隆抗體雜交瘤細胞系、單克隆抗體、 試劑盒及其用途。
背景技術：
乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤，僅次于宮頸癌，在女性惡性 腫瘤發病率中居第2位。全世界每年約有120萬婦女發現乳腺癌，有50萬
婦女死于乳腺癌。北美、北歐是乳腺癌的高發地區，其發病率約為亞、非、 拉美地區的4倍。我國是乳腺癌的低發地區，但其發病率正逐年上升，尤 其滬、京、津等大城市及沿海地區。城市和農村女性乳腺癌有差別，城市 愈大，乳腺癌發病率愈高，城市各年齡組乳腺癌死亡率均高于農村。乳腺 癌在女性的發病率隨著年齡的增長而上升，在月經初潮前罕見，20歲前亦 少見，但20歲以后發病率迅速上升。45 50歲較高，但呈相對的平坦，絕 經后發病率繼續上升，到70歲左右達最高峰；死亡率也隨年齡而上升，在 25歲以后死亡率逐步上升，直到老年時始終保持上升趨勢。
人表皮生長因子受體-2 (human epidermal growth factor receptor-2， Her2)是表皮生長因子受體家族(EGFR)的第二類成員，目前尚未發現其自身 的特異性配體。Her2/neu基因，又名c-erbB2，其編碼的產物為185,000 的糖蛋白pl85，具有酪氨酸激酶活性，在結構上與表皮生長因子受體EGFR 具有同源性。Pl85與許多生長因子受體都參與絲裂原信號轉導。Her2/neu 基因的過表達在腫瘤形成中起重要作用。人類多種腫瘤包括乳腺癌、卵巢 癌、肺癌、胰腺癌等均有Her2/neu的過表達，其在乳腺癌中的過表達達 30%。多項研究表明抗p185蛋白的單抗能在體內和體外實驗中抑制 Her2/neu過表達的腫瘤細胞的生長。
Her2/neu是跨膜受體，可用多種實驗方法直接作用于其胞外域，因而 是一種理想的治療革E向。體內外實驗均證明，抗Her2/neu單克隆抗體能抑 制過表達Her2/neu的乳腺癌細胞生長。以Her2為靶抗原的抗體介導己成
3為有效的生物治療手段。美國FDA于1998年批準一種Her2人源化改良型 抗體群司珠單抗(trastuzumab;又稱赫賽汀，HERc印tin)上市治療轉移性 乳腺癌，將乳腺癌的療效提高了約20%。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種抗人Her2單克隆抗體雜交瘤
細胞系、單克隆抗體，其可以識別人類Herf抗原，可以為腫瘤特別是乳腺
癌的診斷及治療提供有力工具。
為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是 一種抗人Her2單
克隆抗體雜交瘤細胞系，所述細胞系的保藏號為CGMCC NO. 2748。
一種抗人HER2單克隆抗體，由保藏號為CGMCC NO. 2748雜交瘤分泌。
所述的抗體是鼠源性單克隆抗體，屬于IgM/K亞型。
所述的抗人Her2單克隆抗體在制備腫瘤診斷試劑或指導治療腫瘤的
檢測中的應用。
一種免疫檢測試劑盒，含有至少一種上述的單克隆抗體。 所述的免疫檢測試劑盒在診斷惡性腫瘤；或評價惡性腫瘤的發展和預
后；或指導惡性腫瘤的治療中的用途。 本發明的有益效果
1、 所制備的抗體可以特應性識別人類Her2抗原，其識別表位滿足用 于免疫組織化學染色法檢測人類組織中的Her2抗原的要求。
2、 所組裝的試劑盒方便有效、靈敏度高，可以用于臨床標本檢測，為 診斷和預后判斷提供依據。
圖1是Her2胞外區編碼基因PCR產物凝膠電泳圖。1為DL2000標準分 子量marker, 2為擴增的Her2基因。
圖2是純化的Her2蛋白的SDS-PAGE電泳圖。1為未經誘導的全細菌裂
解液，2為IPTG誘導的全細菌裂解液，3為誘導的細菌裂解上清，4為誘
導的細菌裂解沉淀，5為標準分子量蛋白marker, 6為純化后的Her2蛋白
圖3是本發明的試劑盒染色的SK-Br3細胞(標本為于載玻片上培養的 SK-Br3細胞)。圖4是本發明的試劑盒染色的293細胞(標本為于載玻片上培養的293 細胞)。
圖5是本發明試劑盒染色的SK-Br3細胞，左側為HIHer2抗體染色， 右側為PBS陰性對照(標本為于載玻片上培養的SK-Br3細胞)。
制備特異結合Her2抗原分子的鼠抗人單克隆抗體的雜交瘤保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCN0: 2748，保藏日2008 一11一19，分類命名為小鼠抗人Her2雜交瘤細胞系。
具體實施例方式
制備特異結合Her2抗原分子的鼠抗人單克隆抗體的雜交瘤保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCN0: 2748，保藏日2008 —11一19，分類命名為小鼠抗人Her2雜交瘤細胞系。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細說明 一種抗人Her2單克隆抗體雜交瘤細胞系，所述細胞系的保藏號為CGMCC NO. 2748。
一種抗人Her2單克隆抗體，由保藏號為CGMCC NO. 2748雜交瘤分泌。
所述的抗體是鼠源性單克隆抗體，屬于IgM/ic亞型。
所述的抗人Her2單克隆抗體在制備腫瘤診斷試劑或指導治療腫瘤的
檢測中的應用。
一種免疫檢測試劑盒，含有至少一種上述的單克隆抗體。 所述的免疫檢測試劑盒在診斷惡性腫瘤；或評價惡性腫瘤的發展和預
后;或指導惡性腫瘤的治療中的用途。
本發明是通過傳統雜交瘤融合技術得到一株鼠抗人單克隆抗體。該抗
體特異的識別表達在人類細胞上的表皮生長因子受體家族成員erbB-2，即
Her2分子。
1、 Her2蛋白的制備 (1)引物的設計
根據GenBank中登錄的Her2編碼基因序列(NM—004448. 2)，設計胞外 區引物
Her2-pET41d-F: 5' -GGGATCCGAATTCGTGGGCGAGGGCCTGGCCTG-3 Her2-pET41d-R: 5' -TGGTGGTGCTCGAGAGGCTGGCATGCGCCCTCCTC-3(2) Her2胞外區編碼基因的擴增
采用RT-PCR方法。使用Trizol試劑盒按說明從高表達Her2的SK-Br3 細胞系中提取總RNA。以提取的總RNA為模板，01 igo (dT)為引物，合成cDNA， 用于PCR反應。反應條件94'C預變性5min;94。C變性lmin，55。C退火lmin， 72。C延伸1.5min,共進行30次循環；最后72。C延伸10min。
(3) 目的基因的克隆及測序
將回收的目的基因克隆入PMD18-T載體，轉化感受態大腸桿菌DH5 a 。
(4) 原核表達載體pET41d/HER2的構建
將質粒PMD18-T/HER2用和JMt雙酶切，回收的目的片段與用 同樣酶酶切的原核表達載體pET41d連接，轉化感受態大腸桿菌DH5a。
(5) 目的蛋白的誘導表達
將重組質粒pET41d/HER2轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，挑取生長良好的 單菌落接種到5 ml含卡那霉素的LB液體培養基中，37"C震蕩培養過夜。 取過夜培養的菌液5ml轉移到500ml含氨芐西林的LB培養基中，繼續培 養至A,二O. 6，加入0. 5廳1/L的IPTG， 16°C 200rpm/min過夜誘導大量 表達。
(6) 表達產物的純化
收集菌體沉淀，重懸于1/30培養體積的裂解緩沖液(50腿ol/L Tris-HCl、 100腿ol/LNaCl、 lmmol/L EDTA)中，超聲破菌后，4°C 12000g 離心30min。沉淀重懸于1/30培養體積的包涵體溶解緩沖液(給出成分)， 4°C 12000g離心30min，收集包涵體。用1/40培養體積的6mol/L鹽酸胍、 0. lmol/L Tris-HCl (pH7. 0)溶液于4。C搖動過夜溶解包涵體。收集上清， 利用表達載體上的組氨酸標簽進行親和層析純化。平衡鎳柱后上樣，分別 用6個柱體積的結合緩沖液洗柱，4個柱體積的洗滌緩沖液洗柱，最后用6
個柱體積的咪唑洗脫液洗脫結合在鎳柱上的目的蛋白。為了去除純化洗脫 時咪唑等小分子成分，將純化蛋白裝入透析袋，置于PBS緩沖液中透析12h， 期間更換3次透析液。最后透析袋中即為制備的Her2蛋白 2、 鼠抗人Her2單克隆抗體制備與檢定
(1)制備
I、免疫使用原核表達的Her2融合蛋白常規方法免疫6周齡Balb/c小鼠，皮下注射。首次基礎免疫使用福氏完全佐劑，每隔2周進行一次加強 免疫，使用不完全福氏佐劑，共三次，每次每只100iig，融合前4天末次
免疫，脾內注射，每只50yg。
II、 融合取小鼠脾細胞與NS-1細胞系融合，融合劑采用50%PEG (MW 1,540)。
III、 篩選用原核表達的Her2融合蛋白包被酶標板，以間接ELISA法 進行第一步篩選；轉化了Her2基因，表達Her2融合蛋白的酵母細胞為靶 細胞，以細胞ELISA法進行第二步篩選；SK-Br3為靶細胞，以免疫組化實驗 進行第三步篩選，最終得到陽性克隆。
IV、 克隆化以有限稀釋法克隆化2 3次，取培養上清重復上述第二、 三步篩選，得到穩定分泌抗體的細胞株。
V、 保存將陽性雜交瘤細胞株于液氮中保存。
VI、 抗體工作液制備復蘇凍存的雜交瘤細胞株，于RPMI-1640培養液 中培養，培養條件為37t:， 5%C02，擴大培養并收集培養上清，其中即含鼠 抗人Her2抗體。
3、 試劑盒操作方法
(1) 標本放入固定液中(甲醇丙酮二l: 1)固定90秒，晾干，做好標記。
(2) 加鼠抗人服R2抗體工作液(蓋滿標本)30 — 50分鐘，室溫。用PBS 將抗體沖凈，用PBS浸泡2次，每次5分鐘。
(3) 加生物素一羊抗鼠二抗
(4) 加堿性磷酸酶一鏈霉卵白素(蓋滿標本)20_40分鐘，室溫。用 PBS將抗體沖凈，用PBS浸泡2次，每次5分鐘。
(5) 顯色取lml底物液溶解lmg堅固紅(現用現配)滴加于標本上， 顯色10-20分鐘。鏡下觀察，待胞膜或胞漿出現明顯的紅色，蒸餾水輕輕 沖凈，晾干。
(6) Mayer蘇木素復染60分鐘，蒸餾水沖凈；用O. 5%氨水返藍5秒，蒸 餾水沖凈晾干。
標本如需保存用明膠甘油封片。
如圖3、 4、 5所示，圖3是本發明的試劑盒染色的于載玻片上培養的
7SK-Br3細胞。圖4是本發明的試劑盒染色的于載玻片上培養的293a細胞。 圖5是于載玻片上培養的SK-Br3細胞，左側為Her2單克隆抗體染色，右 側為PBS對照。
本發明的雜交瘤細胞系分泌的能夠特異結合人類Her2抗原分子的鼠抗 人Her2單克隆抗體，識別人類正常細胞和腫瘤細胞表面表達的Her2分子 胞外區部分。該抗體可以用于人類組織特別是乳腺癌組織的診斷和治療。
本發明利用傳統的雜交瘤制備技術，獲得穩定分泌抗人Her2分子單克 隆抗體的雜交瘤細胞株，由此獲得的單克隆抗體與通用SAP試劑盒組裝檢 測人類Her2抗原的免疫組化試劑盒。
本發明的目的旨在制備抗Her2/neu的特異性單抗，并且篩選出分泌能 夠結合天然Her2/neu抗原，用于免疫組化抗體的雜交瘤細胞株，用于指導 乳腺癌的治療和預后評估。
綜上所述，本發明的內容并不局限在上述的實施例中，相同領域內的 有識之士可以在本發明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例， 但這種實施例都包括在本發明的范圍之內。
權利要求
1、一種抗人Her2單克隆抗體雜交瘤細胞系，其特征是所述細胞系的保藏號為CGMCC NO.2748。
2、 一種抗人Her2單克隆抗體，其特征是由保藏號為CGMCC NO. 2748雜交瘤分泌。
3、 根據權利要求2所述的抗人Her2單克隆抗體，其特征是所述的抗體是鼠源性單克隆抗體，屬于IgM/K亞型。
4、 權利要求2-3中任一項所述的抗人Her2單克隆抗體在制備腫瘤診斷試劑或指導治療腫瘤的檢測中的應用。
5、 一種免疫檢測試劑盒，其特征是含有至少一種權利要求2 — 3所述的單克隆抗體。
6、 權利要求5所述的免疫檢測試劑盒在診斷惡性腫瘤；或評價惡性腫瘤的發展和預后；或指導惡性腫瘤的治療中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種抗人Her2單克隆抗體雜交瘤細胞系、單克隆抗體、試劑盒及其用途，能夠在體內外特異性結合人類Her2抗原，鑒別不同水平表達Her2的人類正常或腫瘤細胞。所述細胞系的保藏號為CGMCCNO.2748，單克隆抗體由保藏號為CGMCC NO.2748雜交瘤分泌。抗體是鼠源性單克隆抗體，屬于IgM/κ亞型。本發明采用經典雜交瘤制備技術成功制備抗人Her2單克隆抗體，為腫瘤特別是乳腺癌的診斷和指導治療提供了一種有效的檢測手段。
文檔編號C12N5/20GK101463344SQ200910067698
公開日2009年6月24日 申請日期2009年1月15日 優先權日2009年1月15日
發明者何大水, 馮春玲, 劉紅芹, 浩 屈, 毅 張, 張麗艷, 朱衛彬, 王冬梅, 晨 田, 琳 石, 黃麗華 申請人:協和干細胞基因工程有限公司