專利名稱：一種降壓肽活性的體外檢測方法
技術領域：
本發明屬功能食品的檢測方法領域，涉及降壓肽活性檢測的方法，尤其涉及利用高效液相色譜與熒光 檢測器聯用對蛋清降壓肽的檢測。
背景技術：
世界衛生組織(WHO)規定成人血壓》160/95mmHg為高血壓，據統計,世界上約有IO億人患有高血壓， 每年約有4百萬人死于高血壓，平均每8個死亡個體中有1個死于高血壓，目前，高血壓已經嚴重威脅著 人類的健康。研究表明某些肽類化合物具有降低血壓的功能，稱之為降壓肽。目前，針對降壓肽較為普遍 應用的體外檢測方法是紫外分光光度計檢測，在血管緊張素轉化酶(ACE)的作用下水解馬尿酰組氨酰亮 氨酸(HHL)，經過萃取分離等操作將產物馬尿酸(Hip)分離出，通過對比完全反應(ACE催化HHL水 解)、存在抑制劑的反應(ACE在抑制劑存在條件下催化HHL水解)、空白反應(將ACE滅活后在抑制劑 存在條件下催化HHL水解)三個反應來確定血管緊張素轉化酶(ACE)的活性，進而確定降壓肽的活性。 因此，體外降血壓活性也用血管緊張素轉化酶抑制率來表示。
但是，采用紫外分光光度計檢測方法存在操作步驟復雜、使用有毒有害有機溶劑、檢測藥品費用高等 缺點；近年有報道高效液相色譜與紫外分光光度計聯用來檢測水解產物馬尿酸(ffip)，但也存在成本高等 弊端；而傳統的熒光分光光度計檢測法由于存在肽與鄰苯二甲醛(OPA)反應的千擾使得檢測不穩定，同 時也存在藥品用量大的問題。
發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有的檢測方法操作步驟復雜、操作人員直接接觸有害溶劑、檢測藥品用量高等技術缺點。本發明提供了一種運用鄰苯二甲醛(OPA)與組胺酰亮氨酸(HL)反應生成熒光 物質，經高效液相色譜分離，通過熒光檢測器進行定量的檢測方法。本方法方便，靈敏，藥品用量少。 本方法的技術方案如下
本方法需要對比兩組反應，要求這兩組反應在同樣外界條件下單獨進行，其中，有一組中存在抑制劑 (用B表示)，另一組不存在抑制劑(用A表示)。兩組反應按如下步驟進行
1、 組胺酰亮氨酸(HL)生成反應首先在30。C 4(TC條件下將反應容器預熱5 15min， A、 B反應分 別加入相同劑量(10 50nL0.05U/ml 0.5U/ml)的血管緊張素轉化酶(ACE)， A反應中加入10pL的硼酸 鹽緩沖溶液(0.1mol/LpH=8.3含0.3 mol/L NaCl)， B反應中加入與A相同體積一定濃度的降壓肽硼酸鹽 緩沖溶液。兩組反應同時加入10 30nL3 5mmol/L的馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL),在30。C 40'C條件下 反應2(K50min，反應過程中要保持溫度恒定。
2、 組胺酰亮氨酸(HL)生成反應的終止及堿性條件的建立通過改變pH值，使酶的活性降低至幾 乎不再催化水解反應。加入300 400nL0.2""0.4mol/LNaOH溶液終止反應。保證pH值為10.5~14.0
3、 熒光物質生成在3(TC 4(TC條件下加入鄰苯二甲醛(OPA)反應5 15min。此反應要求在堿性條 件下進行，在稀酸性或中性條件下逆反應反應速率較快，影響檢測準確性。
4、 熒光物質生成反應的終止通過調節pH值來終止反應，加入30~40pL 2~4mol/L的HC1來終止反 應。最終整個反應體系為中性或偏酸性。注本反應終止后應盡快稀釋檢測。
5、 液相色譜的分離采用高效液相色譜法來分離熒光物質，將反應液稀釋10 200倍，在流動相水與 乙腈比例在3: 1~5: 1，流速在0.5 0.8ml/min條件下進樣l~10pL，通過高效液相色譜法將組胺酰亮氨酸
(HL)與鄰苯二甲醛(OPA)反應產物充分分離，避免因肽與鄰苯二甲醛(OPA)反應以及肽本身在該條 件下發射熒光干擾。使得檢測準確。通過如下公式計算血管緊張素轉化酶(ACE)抑制率
抑制率/(%) =x 100%
注A為抑制劑不存在條件下的峰面積；B為抑制劑存在條件下的峰面積。
熒光檢測方法學驗證本發明的檢測方法在0.0016nmol^0.128nmol線性范圍時其線性關系良好，反應 的回收率為99.26%~403鄰％，反應的靈敏度較高，反應的重現性較好。
本發明的有益效果在于簡化操作的整體步驟，尤其是分離操作的步驟；采用高效液相色譜法提高分 離效率，分離效果好；減少藥品的使用量，使檢測成本降低；避免與有害溶劑的接觸，保證操作人員的身 體健康。
具體實施例方式
實施例1
在30'C條件下，將反應容器預熱15min， A、 B反應同時加入50pL0.05U/ml血管緊張素轉化酶(ACE), A反應中加入10nL的硼酸鹽緩沖體系(0.1mol/LpH=8.3含0.3 mol/LNaCl)， B反應中加入與A相同體積 一定濃度的降壓肽硼酸鹽緩沖溶液。A、B反應同時加入40)iL4mmol/L的HHL，在3(TC條件下反應50min， 加入400nL 0.2mol/L的NaOH溶液終止反應，加入20|_iL的鄰苯二甲醛(OPA)反應15min，加入40|iL2mol/L 的HC1，終止反應，將反應液稀釋200倍，流動相水與乙腈比例在3: 1流速0.5ml/nun條件下進樣5nL, 記錄出峰面積，出峰時間為5 15rmn。
實施例2
在37。C條件下將反應容器預熱10min， A、 B反應同時加入20nL0.2 U/ml血管緊張素轉化酶(ACE)， A反應中加入10nL的硼酸鹽緩沖體系(0.1mol/LpH=8.3含0.3 mol/LNaCl)， B反應中加入與A相同體積 一定濃度的降壓肽硼酸鹽緩沖溶液。A、 B反應同時加入30|aL底物5mmo1/ L的HHL，在37'C條件下反應30min，加入360nL0.3mol/L的NaOH溶液終止反應，加入lOpL的鄰苯二甲醛(OPA)反應lOmin，加入 36nL3mol/L的HCl，終止反應，將反應液稀釋10倍，在流動相水與乙腈比例在4: 1,流速0.8ml/min條 件下進樣1HL，記錄出峰面積。 實施例3
在40'C條件下將反應容器預熱15rmn， A、 B反應同時加入10nL0.5 U/ml血管緊張素轉化酶(ACE)， A反應中加入10nL的硼酸鹽緩沖體系(0.1mol/LpH=8.3含0.3 mol/LNaCl) B反應中加入與A相同體積 一定濃度的降壓肽硼酸鹽緩沖溶液。A、 B反應同時加入10(aL底物5mmol/L的HHL，在4(TC條件下反應 20min，加入300nL 0.4mol/L的NaOH溶液終止反應，加入50jiL的鄰苯二甲醛(OPA)反應5mm，加入 30nL4mol/L的HCl，終止反應，將反應液稀釋100倍，在流動相水與乙腈比例在5: 1，流速在0.6ml/min 條件下進樣10nL，記錄出峰面積。
權利要求
1、一種檢測降壓肽體外活性，即檢測血管緊張素轉化酶(ACE)抑制率的方法，采用高效液相色譜與熒光檢測器聯用的方法對血管緊張素轉化酶(ACE)的抑制率進行測定；其特征在于檢測過程主要包括組氨酰亮氨酸(HL)生成、組胺酰亮氨酸(HL)生成反應的終止及堿性條件的建立、熒光物質生成、熒光物質生成反應的終止、熒光物質的檢測五部分。
2、 根據權利1所述的檢測降壓肽體外活性的方法，其特征在于所述的組氨酰亮氨酸(HL)生成過程 包括對比兩組獨立的反應A、 B，其中A為沒有降壓肽存在下馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL)水解生成組 胺酰亮氨酸(HL), B為有降壓肽存在條件下馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL)水解生成組胺酰亮氨酸(HL)。 具體步驟為在30。C 40'C條件下將反應容器預熱5 15min， A、 B反應分別加入相同劑量(10 50& 0.05U/ml~0.5 U/ml)的血管緊張素轉化酶(ACE)， A反應中加入lO^L的硼酸鹽緩沖溶液(0.1mol/LpH=8.3 含0.3 mol/LNaCl), B反應中加入與A相同體積一定濃度的降壓肽硼酸鹽緩沖溶液；A、 B反應同時加入 1(K30nL底物3 5mmol/L的馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL),在30'C 4(TC條件下反應20 50min。
3、 根據權利1所述的降壓肽體外活性的方法，其特征在于所述的組胺酰亮氨酸(HL)生成反應的終 止及堿性條件的建立過程為加入300~400nL0.2~0.4mol/L的NaOH溶液終止組胺酰亮氨酸(HL)生成反 應，同時提供堿性反應條件(pH值10.5~14.0)。
4、 根據權利1所述的檢測降壓肽體外活性的方法，其特征在于所述的熒光物質生成過程為在 3(TC 40。C條件下加入10~50pL的鄰苯二甲醛(OPA)反應5 15min。
5、 根據權利l.所述的檢測降壓肽體外活性的方法，其特征在于所述的熒光物質生成反應的終止過程 為加入30~40nL 2~4mol/L的HC1。
6.根據權利1所述的檢測降壓肽體外活性的方法，其特征在于所述的熒光物質檢測為將反應液稀釋 10~200倍，在流動相水與乙腈比例在3: 1~5: 1,流速在0.5 0.8ml/min條件下進樣1 10pL，通過熒光檢測器檢測，記錄出峰面積。
7、根據權利1所述的檢測降壓肽體外活性的方法，通過方法學檢驗得到本發明的檢測方法線性范圍 在0.0016nmol 0.128nmo1時其線性關系良好，回收率為99.26%~103.98%，反應的靈敏度較高，反應的重 現性較好。
全文摘要
本發明屬于功能食品的檢測方法領域，涉及降壓肽活性檢測的方法，尤其涉及利用高效液相色譜與熒光檢測器聯用對蛋清降壓肽的檢測。采用高效液相色譜與熒光分光光度計聯用技術，通過生成的熒光物質來檢測血管緊張素轉化酶(ACE)的活性，進而確定降壓肽的體外活性。本發明主要步驟包括組氨酰亮氨酸(HL)生成，組氨酰亮氨酸(HL)生成反應終止，熒光物質生成，熒光物質生成反應終止，熒光物質的檢測五部分。經方法學驗證該方法線性關系良好，回收率為99.26％～103.98％，反應的靈敏度較高，重現性較好。本發明操作簡單易行，藥品用量少，更加經濟節約。
文檔編號C12Q1/37GK101638682SQ20091006748
公開日2010年2月3日 申請日期2009年9月2日 優先權日2009年9月2日
發明者劉博群, 劉靜波 申請人:吉林大學