專利名稱：一種大腸桿菌感受態細胞的制備方法
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域。
背景技術：
轉化是將外源DNA分子引入受體細菌，使之獲得新的遺傳性狀。這是現代分子生 物學最基本的操作技術。轉化效率直接影響前后試驗的進展和工作效率，而感受態細胞的 狀態是影響轉化效率最直接、關鍵的因素之一。通常有兩種方法獲得感受態細胞，一種是購 于商業公司，這種感受態通常有較高的轉化效率，每微克質粒DNA產生108個轉化克隆的轉 化效率，但價格比較昂貴。另一種方法是實驗室自己制備。目前常用的感受態細胞制備方 法有CaC12和RbCl/KCl法。RbCl/KCl法的感受態細胞轉化效率較高，但需要特殊的試劑 RbCl, CaC12法簡便易行，但轉化效率較低。除上述兩種方法外，還有制備超級感受態細胞 的Inoue法和電穿孔法，Inoue法細菌的培養條件是18°C，一般的實驗室很難達到。電穿孔 法要求電穿孔儀，一般實驗室不具有該設備。因而，研究一種轉化效率高，重復性好，操作簡 單適用于普通實驗室的感受態制備方法對與分子生物學的研究尤為必要，對分子克隆實驗 具有重要意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種大腸桿菌感受態細胞(E. col !Competent Cells)的制 備方法，它是一種轉化效率高、方便、快捷、重復性好的感受態細胞制備和質粒轉化方法。本發明的制備方法是1)材料LB液體培養基蛋白胨8-12，酵母膏4-6，NaCl 8_12，蒸餾水定容900-1100， PH7. 0,121°C滅菌20min。上述材料均為重量單位。新型制備液0. 06M-0. IM的氯化鈣溶液中PEG3350占體積比6_12%，甘油占體積 比10-15%，加超純水定容，121°C滅菌20min。2)方法預先將滅菌的離心管和新型制備液放入-20°C冰箱8-14小時，待制備感受態細胞 時備用。所有的操作均要在冰上執行。取菌株分區劃線接種于LB平板，倒置37°C培養12-16小時；挑取單菌落接種于 5ml LB液體培養基中，37°C搖床生長，取2ml培養物轉種于200ml新鮮LB培養液中繼續生 長至菌液0D600為0. 3-0. 5 ；將菌液分裝于冰凍的離心管中冰浴5min，4°C，離心5min，回收 細胞；棄盡上清，將細菌沉淀重新懸浮于預冷的新型制備液中，冰浴5min ；4°C離心5min ；棄 盡上清液將細菌沉淀重新懸浮于預冷的新型制備液，于4°C離心5min ；棄盡上清液，加入預 冷的新型制備液重懸沉淀，分裝。本發明的有益效果是將氯化鈣，甘油，PEG3350有機的按照一定的比例混在一 起，制備感受態細胞，獲得了較高的轉化率，對分子克隆實驗意義重大。該方法操作簡單，重復性好，轉化效率高，不但能滿足常規的分子實驗要求，還能夠滿足構建文庫等復雜實驗對 轉化效率的要求，是一項較為實用的新技術，具有極高的應用價值。表1三種方法制備感受態轉化效率比較
權利要求
一種大腸桿菌感受態細胞的制備方法，其制備方法是a、材料LB液體培養基蛋白胨8 12，酵母膏4 6，NaCl 8 12，蒸餾水定容900 1100，PH7.0，121℃滅菌20min；上述材料均為重量單位；新型制備液0.06M 0.1M的氯化鈣溶液中PEG3350占體積比6 12％，甘油占體積比10 15％，加超純水定容，121℃滅菌20min；b、方法預先將滅菌的離心管和新型制備液放入 20℃冰箱8 14小時，待制備感受態細胞時備用，所有的操作均要在冰上執行；取菌株分區劃線接種于LB平板，倒置37℃培養12 16小時；挑取單菌落接種于5ml LB液體培養基中，37℃搖床生長，取2ml培養物轉種于200ml新鮮LB培養液中繼續生長至菌液OD600為0.3 0.5；將菌液分裝于冰凍的離心管中冰浴5min，4℃，離心5min，回收細胞；棄盡上清，將細菌沉淀重新懸浮于預冷的新型制備液中，冰浴5min；4℃離心5min；棄盡上清液，將細菌沉淀重新懸浮于預冷的新型制備液，于4℃離心5min；棄盡上清液，加入預冷的新型制備液重懸沉淀，分裝。
全文摘要
一種大腸桿菌感受態細胞的制備方法，屬于微生物技術領域，其制備方法是將離心管和新型制備液放入-20℃8-14小時，取菌株接種于LB平板，倒置37℃培養12-16小時；挑取單菌落接種于5mlLB液體培養基中，37℃搖床生長，取2ml培養物轉種于200ml新鮮LB培養液中繼續生長至菌液OD600為0.3-0.5；將菌液分裝于冰凍的離心管中冰浴5min，4℃，離心5min，回收細胞；棄盡上清液，加入預冷的新型制備液重懸沉淀分裝。有益效果是獲得了較高的轉化率，對分子克隆實驗意義重大。該方法操作簡單，重復性好，轉化效率高，具有極高的應用價值。
文檔編號C12R1/19GK101993830SQ20091006745
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月28日 優先權日2009年8月28日
發明者劉基偉, 吳健, 張國梁, 張鵬舉, 李旭, 胡成華 申請人:吉林省農業科學院