一種新的高密度脂蛋白的制備的制作方法

專利名稱：一種新的高密度脂蛋白的制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的高密度脂蛋白(rhHDL)的制備，特別是涉及rhHDL調節血脂 代謝的功能，及其在生產用于預防和治療血脂代謝異常性疾病的藥物中的應用。rhHDL的 主要特征是蛋白組分包括使用甲基營養酵母生產的重組人載脂蛋白A-I、重組人載脂蛋白 A-II、重組人載脂蛋白C-I、重組人載脂蛋白C-II和重組人載脂蛋白E 5種載脂蛋白；其生 物學活性與天然高密度脂蛋白極為相似。
背景技術：
代謝綜合征患者及高脂血癥誘發的冠心病(coronary artery disease, CAD)患 者都具有明顯的脂類代謝紊亂(膽固醇升高和HDL降低)，通過大量的流行病學研究已經 證明血菜 HDL 水平與 CAD 呈負相關(Boden WE. High-density lipoprotein cholesterol as an independent risk factor in cardiovascular disease :assessing the data from Framingham to the Veterans Affairs High-Density LipoproteinIntervention Trial [J], Am J Cardiol, 2000,86 (12A) :19L_22L)。HDL 及其載脂蛋白具有抗動脈粥樣硬 化(AS)和血管保護作用，可減少心血管事件的發生(郭錦軍，蔡久英.高密度脂蛋白預防 冠心病發生的研究進展[J].中國心血管病研究，2008，6 (3) :231-234)。動物試驗證明，應 用血漿HDL可明顯預防和改善機體的脂類代謝紊亂，逆轉CAD、AS的發生、發展，提示HDL有 巨大的臨床應用前景。高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)是血漿中主要脂蛋白之一，其 密度最高，顆粒直徑最小，組成以載脂蛋白為主。HDL是一種脂質和蛋白含量大致均等的 異質性脂蛋白。磷脂、游離膽固醇、膽固醇酯和三酰甘油是HDL顆粒中四大脂質成分。蛋 白組學石if究表明(Karlsson H，Leanderson P，Tagesson C，et al. Lipoproteomics II Mapping of proteins in high-density lipoprotein using two-dimensional gel electrophoresisandmass spectrometry[J]. Proteomics，2005，5(5) :1431-1445)，HDL 的 蛋白成分極為復雜，載脂蛋白A-Kapolipoprotein A_I，ApoA-I)含量最為豐富。此外，還含 有載脂蛋白 A-II(apolipoprotein Α-ΙΙ,ApoA-II)、載脂蛋白 A_IV(apolipoprotein A-IV， ApoA_IV)、載月旨蛋白 C-I (apolipoprotein C—I，ApoC—Ι)、載月旨蛋白 C-II (apolipoprotein C-II, ApoC-II)、載脂蛋白 C-III (apolipoprotein C-III, ApoC-III)和載脂蛋白 E(apolipoprotein E，ApoE)。HDL可將膽固醇從周圍組織(包括動脈粥樣硬化斑塊)轉運到肝臟進行再循環或 以膽酸的形式排泄，這一過程就稱膽固醇逆轉運。HDL的血管保護作用在很大程度上是由于 其介導了膽固醇逆轉運。HDL顆粒在血液循環運行過程中，與其他脂蛋白或細胞膜之間不斷 地進行脂質成分或載脂蛋白交換。與此同時，HDL自身也進行相互轉化，以實現其重構及逆 向膽固醇轉運的目的。通過膽固醇逆轉運，可以減少脂質在血管壁的沉積(Gerrity RG. The role of the monocyte in atherosclerosis [J]. Am J Pathol, 1981,103(2) : 181—190) 。]lfc 外HDL還具有抗氧化、抗炎、清除毒性磷脂、抗血栓、促纖溶以及改善血管內皮功能等作用。流行病學調查顯示，血漿HDL-C水平與動脈粥樣硬化等心血管疾病的危險性呈高度負相關，并不依賴于血漿LDL-C、其他的脂類參數(三酰甘油、總膽固醇)和其他的非脂類 危險因素。在調整了其他冠心病危險因素后，HDL-C水平每增加lmg/dL，冠心病危險性就減 少2% 3%。HDL-C可作為第一次缺血性事件的獨立預測因素，如勞力型心絞痛、冠狀動脈 功能不全、非致命性心肌梗塞、冠心病死亡。HDL-C可對抗由血脂代謝紊亂引起的心血管疾 病，升高HDL-C有可能成為冠心病、代謝綜合征防治的有效措施。目前對于低HDL尚無統一的治療目標值，HDL膽固醇評估專家組建議，心血管 疾病患者群、代謝綜合征人群或冠狀動脈疾病患者群等高危人群的HDL水平應該提升到 40mg/dl 以上(Sacks FM. The role of high-density lipoprotein (HDL)cholesterol in the prevention and treat-ment of coronary heart disease :expert group recommendations[J], Am J Cardiol,2002,90(2) : 139-143)。然而，現階段獲得HDL的唯一途徑就是從血漿中分離，原料來源有限，并且生產成 本高、規模難以擴大，而使用血液制品還容易造成醫源性感染。這些因素都會增加患者的負 擔，并限制天然HDL注射劑在臨床上的廣泛應用。本發明致力于利用生物工程方法獲得與天然HDL蛋白組成、結構及功能 相 1以的重組人高密度月旨蛋白(recombinant human high-density lipoprotein, rhHDL)制劑。利用基因工程技術、發酵技術及蛋白純化技術獲得高產量、高純度的 重組人載月旨蛋白 A—I (recombinant human apolipoprotein A-I，rhApoA—I)、重組人 載月旨蛋白 A-II (recombinant human apolipoprotein A-II, rhApoA-II)、重組人載 月旨蛋白 C_I(recombinant human apolipoprotein C-I, rhApoC—I)、重組人載月旨蛋 白 C-II (recombinant human apolipoprotein C-II, rhApoC-II)禾口重組人載月旨蛋白 E(recombinant human apolipoprotein E，rhApoE)等載脂蛋白。然后按照天然HDL的組分， 利用膽酸鈉法將各種載脂蛋白與脂質按比例組合，形成重組人高密度脂蛋白(recombinant human high density lipoprotein,rhHDL)顆粒。并進一步研究rhHDL的結構和生物學活 性。

發明內容
本發明涉及一種新的高密度脂蛋白(rhHDL)，特別是涉及rhHDL預防和治療血脂 代謝異常的功能，及其在生產用于預防和治療血脂代謝異常誘發相關疾病的藥物中的應用。HDL是血漿中主要脂蛋白之一，其中脂質和蛋白含量大致均等，組成以載脂蛋白為 主，其蛋白成分極為復雜，主要包括 ApoA-I、ApoA-I I、ApoA-IV、ApoC-I、ApoC-I I、ApoC-111 和ApoE。組成HDL的各種載脂蛋白成分具有不同的功能。如=ApoA-I是HDL的主要蛋白成 分可維持其結構的穩定與完整性，激活卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(LCAT)，并可以作為HDL 受體的配體；ApoA-II可抑制LCAT活性，同時它還具有激活肝酯酶(HL)，維持HDL結構，與 磷脂結合的能力；ApoA-IV參與脂肪吸收、膽固醇逆轉運及輔助激活脂蛋白脂肪酶(LPL)； ApoE可激活LDL受體和肝ApoE受體；ApoC-I、ApoC_II分別激活LACT、LPL ；ApoC-111可降 低HDL的分解代謝率。HDL功能的多樣性是多種載脂蛋白共同作用的結果。本發明的一個目的是提供一種新的高密度脂蛋白(rhHDL)的制備方法，特征在于 它的蛋白組分包括使用甲基營養酵母生產的重組人載脂蛋白A-I、重組人載脂蛋白A-II、
4重組人載脂蛋白C-I、重組人載脂蛋白C-II和重組人載脂蛋白E 5種載脂蛋白。利用膽酸 鈉法制備 rhHDL(Kato H，Nakano ST, Arai H，et al. Purification, micoheterogeneity, and stability of human lipid transfer protein [J]J Biol Chem，1989，264(7) 4082-4087.)，可得到穩定、大小適宜的顆粒。膽酸可促進載脂蛋白進入卵磷脂的酰基鏈。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的重組人載脂蛋白A-I是使用甲基營 養酵母生產的。該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養基中培養甲基營養酵母，其中所 說的甲基營養酵母是用包括下列可操作連接的元件的DNA構建體轉化的(1)甲基可誘導 的轉錄啟動子；(2)編碼載脂蛋白A-I的DNA片段；(3)轉錄終止子和⑷可選擇標志，從而 重組表達產生人載脂蛋白A-I。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的重組人載脂蛋白A-II是使用甲基 營養酵母生產的。該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養基中培養甲基營養酵母，其中 所說的甲基營養酵母是用包括下列可操作地連接的元件的DNA構建體轉化的(1)甲基可 誘導的轉錄啟動子；(2)編碼載脂蛋白A-II的DNA片段；(3)轉錄終止子和(4)可選擇標 志，從而重組表達人載脂蛋白A-II。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的重組人載脂蛋白C-I是使用甲基營 養酵母生產的。該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養基中培養甲基營養酵母，其中所 說的甲基營養酵母是用包括下列可操作連接的元件的DNA構建體轉化的(1)甲基可誘導 的轉錄啟動子；⑵編碼載脂蛋白C-I的DNA片段；(3)轉錄終止子和⑷可選擇標志，從而 重組表達人載脂蛋白C-I。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的重組人載脂蛋白C-II是使用甲基 營養酵母生產的。該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養基中培養甲基營養酵母，其中 所說的甲基營養酵母是用包括下列可操作連接的元件的DNA構建體轉化的(1)甲基可誘 導的轉錄啟動子；⑵編碼載脂蛋白C-II的DNA片段；(3)轉錄終止子和⑷可選擇標志， 從而重組表達人載脂蛋白C-II。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的重組人載脂蛋白E是使用甲基營養 酵母生產的。該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養基中培養甲基營養酵母，其中所說 的甲基營養酵母是用包括下列可操作連接的元件的DNA構建體轉化的(1)甲基可誘導的 轉錄啟動子；(2)編碼載脂蛋白E的DNA片段；(3)轉錄終止子和(4)可選擇標志，從而重組 表達人載脂蛋白E。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的甲基營養酵母是巴斯德畢赤酵母， 并且所說的甲基可誘導的啟動子和轉錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOXl基因。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的rhHDL是用膽酸鈉法制備的。本發明的另一個目的是提供一種新的高密度脂蛋白(rhHDL)，其生物學活性與天 然高密度脂蛋白相似。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的天然高密度脂蛋白是用硫酸葡聚糖 鈉鹽沉淀法從人血漿中提取的。血脂異常是促成動脈粥樣硬化的重要致病因素，也可以是糖尿病、腎臟疾病、甲狀 腺功能減低的表現。為了深入研究rhHDL對血脂代謝的調節作用，我們在細胞水平對比觀 察了天然HDL和rhHDL對大鼠腹腔巨噬細胞內膽固醇流出的影響；對比觀察了天然HDL和rhHDL對活體動物(大鼠)實驗性高脂血癥動物模型血清中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、 低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)水平及血清和肝組織中 SOD活性的影響，同時對各實驗組動物的肝組織進行了病理學觀察和統計學分析。在使用大 鼠腹腔巨噬細胞完成的細胞水平研究中發現，rhHDL可介導大鼠腹腔巨噬細胞內膽固醇流 出，且介導細胞內膽固醇流出的能力隨時間的延長和劑量的增加而增強(詳見實施例2)。 在使用實驗性高脂血癥動物模型完成的試驗研究中發現，接受天然HDL和rhHDL治療的實 驗組動物血清TC、TG和LDL-C明顯降低，HDL-C升高，血清和肝臟中SOD活性升高，且與模 型對照組有顯著性差異。說明天然HDL和rhHDL均可通過調節血漿中HDL水平，增加高脂 血癥大鼠外周組織細胞中的膽固醇向肝臟轉運，以減少膽固醇在外周組織細胞中的聚集和 對血管內皮細胞的廣泛性損害；可通過提高自由基清除酶的活性，抵抗自由基介導的脂質 過氧化，從而降低自由基對機體的損傷，預防AS的發生及發展。另外，通過病理組織學檢查 結果可見，rhHDL治療組肝細胞脂變程度有所減輕，且有隨劑量的增大而作用效果更明顯的 趨勢。由此可見，rhHDL可降低實驗性高脂血癥大鼠肝臟脂肪蓄積，對減輕和防止肝臟的脂 肪變性具有一定作用(詳見實施例3)。本發明的研究結果表明，rhHDL可促進細胞內膽固醇流出，有效地調節血脂代謝 和改善肝組織的脂肪沉積，從而起到治療血脂異常性疾病的作用，其生物學作用與天然HDL 極為相似。進而可以初步認定，rhHDL有可能作為一種新的調節血脂的藥物，用于治療血脂 異常性疾病。因此，本發明的一個目的是提供rhHDL在生產用于預防和治療血脂代謝異常性疾 病的藥物中的應用。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的血脂代謝異常性疾病選自高脂血癥。


圖1顯示透射電鏡下觀察rhHDL的形態(放大60000倍的電鏡觀察)。圖2顯示rhHDL對實驗性高脂血癥大鼠肝臟病理組織學改變的影響(所有組織切 片均使用放大200倍的普通光學顯微鏡觀察)。其中2a為空白對照組；2b為模型對照組； 2c為小劑量rhHDL組；2d為大劑量rhHDL組；2e為陽性對照組(天然HDL)。
具體實施例方式以下借助實施例描述本發明的最佳實施方式。這些實施例旨在進一步舉例闡明本 發明，而不是以任何方式限制本發明待批權利要求的范圍。實施例1 :rhHDL的制備按照HDL2中各種載脂蛋白成分的比例合成rhHDL，HDL2中各種載脂蛋白成分的比 例如下=ApoA-I 65%,ApoA-II 10%,ApoC-1 13%,ApoC-II 1 %,ApoE 3% (劉瑞杰，牛好 敏，王景福，等.高脂血癥和相關疾病[M].北京科學技術文獻出版社，1999)。1)取卵磷脂7. 2mg，膽固醇1. 6mg，溶于0. 5ml無水乙醇。用皮試注射器吸入后快 速注入 12. Iml 1/20PBS 中，N2 下攪拌 15min。2)5.4mg 膽酸鈉溶于 0. 5ml 1/20PBS ；3. 2mg rhApoA_I、0. 5mg ApoA-II,0. 64mgApoC-I、0. 05mg ApoC-11,0. 15mg ApoE 溶于 0. 8ml 1/20PBS 中。在攪拌下加入上述
液體中。3)室溫放置 30min。4)移至 4°C 孵育 12h。5)將液體加入孔徑為IOkD的蛋白透析袋中，4°C PBS充分透析2d，以除去乙醇和
膽酸鈉。6)rhHDL形態的電鏡觀察(見圖1)。血漿HDL可通過膽固醇逆向轉運促進外周細胞(包括血管壁細胞)中堆積的膽 固醇移出、酯化并轉移至肝臟清除，減少脂質在血管壁的沉積，因此具有抗動脈粥樣的作用 (Gerrity RG. The role of the monocyte in atherosclerosis[J]. Am J Pathol，1981， 103(2) : 181-190.)。膽固醇逆轉運涉及三個環節①膽固醇外流；②膽固醇酯化；③膽固醇 清除。下列實施例舉例說明觀察rhHDL介導大鼠腹腔巨噬細胞內膽固醇流出情況，以評價 rhHDL的生物學活性。實施例2 :rhHDL介導大鼠腹腔巨噬細胞內膽固醇流出1)實驗性高脂血癥模型的建立以膽固醇、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、2%豬油、5%黃豆、0. 5%蛋清、 0. 5%魚粉、2%蛋黃粉、88. 3%基礎飼料配成的高脂飼料喂養大鼠15d，建立高脂血癥模型。2)巨噬細胞的誘導高脂血癥大鼠腹腔注射3%無菌硫代乙醇酸鈉肉湯(2ml/只)，誘導巨噬細胞產 生。4d后可收集巨噬細胞。3)巨噬細胞的分離和培養將大鼠乙醚麻醉處死，用D-Hanks液腹腔灌洗收集腹腔巨噬細胞，1000r/min離心 lOmin，將沉淀用含10%小牛血清的RPMI-1640培養基制成懸液，調節細胞濃度至1 X IO9個 /L，接種于直徑35mm培養皿中。置37°C、5% CO2孵箱中培養，3h后洗去未貼壁的細胞，加 入2ml培養液，預培養24h后，加入各種樣品。4) rhHDL介導細胞內膽固醇外流的劑量-效應關系測定取16 份細胞樣品，分別加入 12. 5 μ g rhHDL (η = 4)，25 μ g rhHDL (η = 4)， 50 μ grhHDL(n = 4)，100 μ g rhHDL (η = 4)；另取 4 份細胞樣品，加入 100 μ gBSA(n = 4)作 為陰性對照組。37°0、5%0)2孵箱中培養2411，測定細胞內膽固醇含量。以加樣前細胞內膽 固醇含量為100%，確定rhHDL介導細胞內膽固醇外流的劑量-效應關系。表IrhHDL介導細胞內膽固醇外流的劑量-效應關系(n = ^iis ) 與藥前比較**P < 0. 01，***P < 0. 001與BSA 對照組比較 ##P < 0. 01，###P < 0. 0015)rhHDL介導細胞內膽固醇外流的時間-效應關系測定各組分別取9份細胞樣品，加入50 μ g BSA, 50 μ g rhHDL和50 μ g天然HDL。每組 再分別分成3組，分別培養12h、24h和36h，測定細胞內膽固醇含量。以加樣前細胞內膽固 醇含量為100%，確定rhHDL介導細胞內膽固醇外流的時間-效應關系。表2rhHDL和天然HDL介導細胞內膽固醇外流的時間-效應關系 高脂血癥是脂質代謝異常的慣稱，主要是指血清TC或TG水平過高和/或血清 HDL-C水平過低。其臨床表現主要包括兩大方面①脂質在真皮內沉積所引起的黃色瘤。② 脂質在血管內皮沉積所引起的AS，產生冠心病和周圍血管病。此外還可引起脂肪肝以及急 性胰腺炎等疾病。下列實施例舉例說明rhHDL對大鼠實驗性高脂血癥模型的治療作用，其 中包括對肝臟病理組織學的影響。實施例3 :rhHDL對實驗性高脂血癥大鼠血脂代謝的影響1)動物分組、給藥方法Wistar雄性大鼠50只，體重120 160g，隨機分成5組，每組10只。其中1組為 空白對照組，給予普通飼料15d。其余為高脂飲食組，給予高脂飼料15d，第15d采血測血脂， 再按血脂水平將高脂飲食組隨機分為4組，分別為模型對照組、rhHDL小劑量組、rhHDL大劑 量組、陽性對照組。分組及給藥方法見表3。表3動物分組、給藥方法 第16天起，隔日上午8:00 9:00尾靜脈給藥1次，共10次。處死動物前12h，動 物禁食不禁水。將動物用3%戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔麻醉，腹主動脈采血，并取肝臟。 中 SOD0
2)血樣與組織樣的采集與制備
①腹主動脈采血3ml，靜置分離血清，測定TC、TG、HDL-C,LDL-C, SOD。
②取200mg肝臟用冰鹽水制成10%的肝組織勻漿，用于測定組織蛋白含量及組織
③取部分肝臟，置10%甲醛溶液中固定，病理切片觀察肝組織中脂肪沉積情況。 3)實驗結果見表4 5以及圖2所示。其中數據以^is表示，采用組間差異比較t 檢驗進行統計分析。表4rhHDL對實驗性高脂血癥大鼠血脂代謝的影響(n = IO^is ) 與模型對照組比較，*Ρ< 0. 05，**Ρ < 0. 01，***Ρ < 0. 001表5rhHDL對實驗性高脂血癥大鼠SOD活性的影響(n = 10,i±s )組別
血清 SOD (U/ml) 肝臟 SOD (U/mgprot) 與模型對照組比較，*P < 0. 05，**P < 0. 01對各組大鼠肝臟進行病理觀察，結果如下①正常對照組肝細胞核呈圓形，胞漿粉紅色，肝細胞無脂肪變性和壞死。門管區 小葉間動脈、小葉間靜脈和小葉間膽管結構清楚可見，門管區無炎細胞浸潤(圖2a)。②模型對照組肝細胞腫脹，肝竇狹窄，肝細胞質內充滿大小不一的脂滴，使肝細 胞變得疏松(圖2b)。③小劑量組肝細胞無明顯腫脹，肝竇狹窄減輕，胞質內脂滴明顯減少，病變程度 重于大劑量組，稍重于陽性組(圖2c)。④大劑量組肝細胞核呈圓形，肝細胞無明顯腫脹，胞質內僅見少量小脂滴(圖 2d)。⑤陽性對照組組肝細胞腫脹和肝竇狹窄較模型組明顯減輕，胞質內脂滴明顯減 少(圖2e)。
權利要求
一種新的高密度脂蛋白(rhHDL)的制備方法，特征在于它的蛋白組分包括使用甲基營養酵母生產的重組人載脂蛋白A I、重組人載脂蛋白A II、重組人載脂蛋白C I、重組人載脂蛋白C II和重組人載脂蛋白E5種載脂蛋白。
2.根據權利要求1的方法，其中所說的甲基營養酵母是巴斯德畢赤酵母。
3.根據權利要求1的方法，其中所說的rhHDL是用膽酸鈉法制備的。
4.rhHDL在生產用于預防和治療血脂代謝異常性疾病的藥物中的應用。
5.根據權利要求4的應用，其中所說的血脂代謝異常性疾病選自高脂血癥。包括高脂 血癥、動脈粥樣硬化以及代謝綜合征。
全文摘要
本發明涉及一種新的高密度脂蛋白(rhHDL)的制備，特別是涉及rhHDL調節血脂代謝的功能，及其在生產用于預防和治療血脂代謝異常性疾病的藥物中的應用。rhHDL的主要特征是蛋白組分包括使用甲基營養酵母生產的重組人載脂蛋白A-I、重組人載脂蛋白A-II、重組人載脂蛋白C-I、重組人載脂蛋白C-II和重組人載脂蛋白E 5種載脂蛋白；其生物學活性與天然高密度脂蛋白極為相似。
文檔編號C12P21/02GK101928739SQ20091006715
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月22日 優先權日2009年6月22日
發明者蘇曼曼, 顏煒群 申請人:吉林圣元科技有限責任公司