專利名稱：豬wfikkn2基因作為胴體性狀相關的分子標記及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于豬的分子標記制備領域，具體涉及一種作為豬標記輔助選擇的與胴體性狀相關的分子標記的制備及應用。
背景技術：
豬胴體性狀一直是豬遺傳改良的目標性狀，是重要的經濟性狀之一。胴體性狀主要有背膘厚度、胴體長度、眼肌面積、腿臀比例、胴體瘦肉率等。屠宰率和胴體瘦肉率高的豬能帶來更高的經濟效益。由于胴體性狀無法進行活體測定，常規育種方法對這類性狀的改良無法實施個體選擇，往往采用同胞選擇進行改良，其改良效果往往不佳。近年來隨著豬QTL和分子標記的研究進展以及標記輔助選擇在育種中的應用，豬胴體性狀的改良速度得到了很大的提高。但是豬的胴體性狀是一類數量性狀是受多基因控制的，目前的研究還僅僅發現少數控制胴體性狀的基因和分子標記，大量的候選基因和分子標記還有待進一步發現。
目前與豬胴體性狀相關的QTL幾乎分布于豬的所有染色體，通過功能候選基因法或位置克隆的策略篩選了一些與胴體性狀相關的分子標記。目前已發現許多與胴體性狀存在顯著關聯的基因瘦素受體(Leptinreceptor，LEPR)基因和心臟脂肪酸結合蛋白(Heart fatty acid binding protein，H-FABP)是豬6號染色體上影響背膘厚度，肌內脂肪含量和眼肌面積等QTL區域候選基因，連鎖分析表明H-FABP和LEPR基因位于SSC685.4cM和107cM位置，PCR-RFLP分析表明H-FABP基因單核苷酸多態與肌內脂肪和眼肌面積顯著相關，LEPR基因單核苷酸多態與背膘厚和肌內脂肪是顯著相關的(G.Muz et al，J.Anim.Sci.，2009，87459-468；Cristina
et al.，Genet.Sel.Evol.，2002，34465-479)。Lpin1，Lpin2和Lpin3是與脂肪代謝相關的三個基因，屬于一個基因家族，豬上分別位于3q21-27，6q24-(1/2)q31和17(1/2)q21-q23，PCR-RFLP表明Lpin1基因第二外顯子的C93T單核苷酸突變與板油率和肌內脂肪這兩個胴體性狀相關(Bang Liuet al，Investigation of Lpin1as a candidate gene for fat deposition in pigs.Mol.Biol.Rep，2009，361175-1180；Bang Liu et al，Molecular characterization，chromosomal localization andassociation analysis with back-fat thickness of porcine LPIN2and LPIN3.Mol.Biol.Rep.，2008Nov 7，DOI 10.1007/s11033-008-9385-2)。原發性心肌癥相關蛋白1和4(cardiomyopathy-associated 1and1，CMYA1和CMYA4)基因定位于豬SSC13和SSC12分別SW344與SW62微衛星標記緊密相連的區域。CMYA1基因編碼區一個同義突變c.1053C＞T和三個錯義突變c.1394A＞G(p.His 465Arg)，c.1751A＞G(p.Asp582Gly)和c.3290C＞A(p.Thr1097Asp)關聯分析結果表明與不同背膘后存在顯著相關；CMYA4基因第十五內含子上A558G單核苷酸突變產生一個MspI酶切位點，性狀關聯分析結果與六七肋骨背膘厚和肩膘厚存在顯著相關(BangLiu et al，Molecular characterization，expression and association analysis of the porcine CMYA4gene with carcass traits.J.Anim.Breed Genet.，2008Aug，125(4)234-239；Bang Liu et al.，Porcineskeletal muscle differentially expressed gene CMYA1isolation，characterization，mapping，expression and association analysis with carcass traits.Anim.Genet.，2009Jun，40(3)255-261)。
WFIKKN2(又名growth and differentiation factor-associated serum proein-1，Gasp1)基因編碼蛋白是通過親和純化和質譜的方法在正常的老鼠和人的血清中發現的一個與內源肌肉生長抑制素(Myostatin)相關的蛋白，在鼠的骨骼肌和心臟中表達最高，在肝臟和腎臟中表達相對較低，在腦、脾、肺、睪丸等組織也有表達，該基因編碼的蛋白具有5個保守蛋白酶抑制劑結構域，能通過抑制對堿性蛋白酶活性來阻止Myostatin的加工，使Myostatin處于失活的前體狀態，而Myostatin是肌肉發育負調控因子。豬中該基因定位在12p11，與微衛星SSC8F12(LOD＝9.86，43cR)和SW874(LOD＝6.74，59cR)緊密連鎖，目前已經報道很多豬12號染色體上與背膘厚，眼肌面積等胴體性狀相關QTL，根據位于該區域的QTL有眼肌面積，肌纖維數目，肌纖維直徑，胸腰椎間背膘厚，脂肪比率等與胴體性狀相關的QTL。由上述資料我們不難發現WFIKKN2基因在肌肉發育過程中具有重要作用，因此我們開展豬WFIKKN2基因的克隆和SNP篩查、檢測及與性狀關聯分析等相關工作。
發明內容
本發明的目的在于克隆一種作為豬標記輔助選擇的與胴體性狀相關的分子標記，為豬標記輔助選擇育種提供有用的分子標記。
本發明通過以下技術方案實現 從豬WFIKKN2基因片段中克隆得到一種作為豬標記輔助選擇的與胴體性狀相關的分子標記，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，在序列表的第109bp處有一個G109-A109的突變，導致Eco72I-RFLP多態性。
申請人:制備了擴增如序列表SEQ ID NO1所述G109-A109的堿基突變的引物對，該引物對的DNA序列如下所示 正向引物5′-CTATGAGAAGTGCTGTCCCAACG-3′， 反向引物5′-CAGGGTGATGCCTTTGGAGC-3′。
申請人:設計了四對克隆豬WFIKKN2基因組序列的引物，這四對引物擴增的DNA序列拼接結果如附圖3所示。
申請人:提供了一種制備上述分子標記的方法，它按照以下步驟實施 用人和鼠WFIKKN2基因mRNA進行序列比對，用獲得的保守序列作為模版，根據該模版設計引物，用成年中國地方豬“通城豬”血樣提取總DNA為模板進行PCR擴增，對PCR產物進行純化和克隆測序，進行序列分析，獲得如序如圖2所示的cDNA序列和圖3所示的基因組核苷酸序列。
應用常規的PCR-RFLP的方法對序列SEQ ID NO1所示的第109位堿基突變進行了檢測，并初步進行其基因型與豬胴體性狀之間的關聯分析的應用，為豬的分子標記輔助選擇提供了一個新的分子標記。
更詳細的技術方案參見《具體實施方式
》。
序列表SEQ ID NO1是本發明制備的豬基因WFIKKN2與胴體性狀相關的分子標記的核苷酸序列； 圖1是本發明的分子標記的制備流程圖； 圖2是本發明中獲得豬WFIKKN2基因用于克隆的CDS片段； 圖3本發明用于篩查SNP的DNA片段； 圖4本發明篩查SNP的測序峰圖； 圖5是本發明中豬WFIKKN2基因Eco72I-RFLP的三種基因型(GG AG AA)電泳結果。圖中MarkerDNA分子量標準(DL2000ladder)。
具體實施例方式 實施例1、WFIKKN2基因的克隆 1、引物設計 用人(GenBank收錄號NM_175575.4)和鼠(GenBank收錄號NM_181819.1)WFIKKN2基因mRNA用DNAstar進行兩序列比對獲得一保守序列，利用獲得保守序列設計一對引物擴增WFIKKN2基因第二外顯子序列，該引物對的DNA序列如下所示 WFIKKN2W2-F15′-AGGGCTCTGAGTGTGACATCTGG-3′ W2-R15′-TCCTTGAGGACGTCACAGGTCTT-3′ 2、PCR產物的克隆和測序 將純化后的PCR產物與pGEM-T載體(購自Promega公司)在4℃水浴過夜連接；無菌狀態下取100-120μl感受態細胞于1.5ml Ependorff管中，將7μl的連接產物加入混勻，在冰上放置30min，42℃熱激90s，后冰浴3-4min，加入450μl無抗生素的LB液體培養基，37℃振蕩培養45min。取100μl涂布于帶有氨芐抗生素平板，37℃平放1h后倒置培養。挑取平板上的單菌落，接種于1ml LB中，37℃220r/min培養過夜。取1μl菌液PCR擴增驗證后，用雙脫氧末端終止法在DNA自動測序儀上對重組質粒采進行測序，序列測定由北京奧科生物技術有限公司完成。用DNASTAR軟件中的Seqman程序進行拼接，得到一條長度為1357bp的CDs序列。
DNA序列同源性檢索鑒定 通過美國國家生物技術信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)軟件，將測序后獲得的DNA序列與GenBank數據庫中公布的已知生理功能基因進行序列同源性比較，以鑒定和獲得該CDs序列的功能信息。檢索結果表明所測序列與人WFIKKN2基因mRNA(GenBank收錄號NM_175575.5)的部分序列同源性達90％。
3、基因組序列獲得 利用人鼠保守序列和已經獲得CDs序列信息，設計一對引物，擴增得到包含唯一內含子和部分第一外顯子的序列，引物對的DNA序列如下 WFIKKN2W2-F25′-ACGACATGAATCCCAACCTCT-3′ W2-R25′-TGCTTCTCCCAAGTGATCTCT-3′ 將純化后PCR產物進行上述克隆測序以及生物信息學分析鑒定，再用已經獲得基因組序列在NCBI豬記HTG基因組數據庫中進行檢索，獲得了一條同源性達98％的未注釋的豬基因組序列(GenBank收錄號CU929570.2)，將獲得序列，進行內含子外顯子分析，并找到相應讀碼框架。利用該序列設計兩對引物獲得了WFIKKN2基因完整編碼區(見圖2所示)。相應引物對的DNA序列如下 WFIKKN2W2-F35′-GATACGCCGCCTAAACTGCTTCC-3′ W2-R35′-GGCTTCCAGATTCGCACTCACC-3′ W2-F45′-GATACGCCGCCTAAACTGCTTCC-3′ W2-R45′-GGCTTCCAGATTCGCACTCACC-3′ 實施例2、WFIKKN2基因SNP的篩查和PCR-RFLP診斷方法的建立 1、SNP的篩查 運用W2-F1/W2-R1和W2-F2/W2-R2引物分離豬基因組片段，通過在不同豬種(包括中國地方豬種和國外豬種)的基因組中擴增，通過回收獲得PCR產物pool送北京奧科生物技術有限公司測序，發現在該基因編碼區(見附圖2)的第342位堿基處有一個G-A的堿基突變(即與序列表SEQ ID NO的G109-A109的突變相同)，導致Eco72I-RFLP多態性。測序結果如圖4所示。
基因組測序的引物對的DNA序列如下 WFIKKN2W2-F15′-AGGGCTCTGAGTGTGACATCTGG-3′/W2-R15′-TCCTTGAGGACGTCACAGGTCTT-3′ W2-F25′-ACGACATGAATCCCAACCTCT-3′/W2-R25′-TGCTTCTCCCAAGTGATCTCT-3′ 2、PCR-RFLP診斷方法的建立 (1)、擴增SEQ ID NO1的引物對的DNA序列如下 WFIKKN2WSNP2-F5′-CTATGAGAAGTGCTGTCCCAACG-3′ WSNP2-R5′-CAGGGTGATGCCTTTGGAGC-3′ (2)、PCR擴增條件 PCR反應總體積10μl，其中豬基因組DNA約100ng，含1×buffer(購自寶生物工程(大連)有限公司，TaKaRa)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP終濃度為150μmol/L，引物終濃度為0.4μmol/L，0.5U TaqDNA聚合酶(TaKaRa)。PCR擴增程序是94℃3min，循環38次94℃30s，61℃30s，然后72℃15s，最后72℃延伸5min。PCR反應產物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。得到289bp特異擴增片段，該片段位于第二外顯子內(如圖2)。測序的結果發現在該289bp片段中存在一個Eco72I酶切位點(CA↓CGTG)，其中第109bp處為多態性切點，位于第二外顯子中。
(3)、PCR-RFLP檢測條件 PCR產物酶切反應體積是10μl，其中1×buffer 1μl，PCR產物3-5μl，限制性內切酶Eco72I為0.1μl(10U)，用H2O補足10μl，將樣品混勻后離心，37℃水浴4h，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，凝膠成像系統中拍照。對該位點兩個純合子的測序結果顯示，當第109bp位置是A109時，則該Eco72I酶切位點不存在，Eco72I酶切后檢測結果只有1個片段，長度是289bp(定為等位基因A)；但存在A109→G109的替換時，其結果導致第109bp處一個Eco72I酶切位點的產生，得到2個片段，長度分別為109bp和181bp(定為等位基因G)，三種基因型GG，GA，AA如圖5所述。
(4)、本發明的分子標記在豬肉質性狀標記性狀關聯分析中的應用 試驗共檢測了153個豬個體中國地方豬“通城純種”31頭，外來豬“大白純種”32頭，“長白純種”27頭，中國地方豬與外來豬的雜交豬“大長通”(大白×(長白×通城))31頭、“長大通”(長白×(大白×通城))32頭的多態，確定其基因型，并進行基因型與生產性狀(出生至上市平均日增重、胴體直長、胴體斜長、腿臀比率、腿臀肉骨率、板油率、皮脂重、失水率、滴水損失、肌肉pH值、肌內脂肪含量、肉色、眼肌面積、臀部膘厚)的關聯分析。建立如下所述的最小二乘模型 yijk＝μ+Gi+Cj+Pk+Bj+εijk 其中，yijk是性狀觀察值，μ為總體均數，Gi為基因型效應，Cj為品種效應，Pk為父本效應，Bj為批次效應，εijk為隨機誤差，假定εijk相互獨立，服從N(0，σ2)分布。基因型檢測結果表明在153個個體中AA基因型有29個個體，AG基因型有70個個體，GG基因型有54個個體。基因型與性狀關聯分析的結果是WFIKKN2基因與屠宰率，內脂率和眼肌面積呈顯著相關，見表1。
由表1可知，WFIKKN2基因SNP位點對屠宰率，內脂率和眼肌面積有顯著影響(P＜0.05)，此位點對其它胴體性狀沒有顯著影響。
表1WFIKKN2基因Eco72I-RFLP多態不同基因型與部分肉質性狀的關聯分析
對屠宰率，內脂率和眼肌面積有顯著影響(P＜0.05)的WFIKKN2基因的SNP位點基因型的最小二乘均數如表2所示。
表2SNP位點(WFIKKN2)基因型滴水損失和失水率的最小二乘均數
注**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
表2表明，GG基因型個體的屠宰率，內脂率和眼肌面積都顯著高于GA、AA基因個體的對應值，因此可以看出GG基因型個體的屠宰率，內脂率和眼肌面積較高。
<110>華中農業大學
<120>豬WFIKKN2基因作為胴體性狀相關的分子標記及應用
<130>
<141>2009-06-16
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>289
<212>DNA
<213>豬(Sus scrofa)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(289)
<223>
<220>
<221>primer_bind
<222>(270)..(289)
<223>
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(23)
<223>
<220>
<221>mutation
<222>(109)..(109)
<223>
<400>1
ctatgagaag tgctgtccca acgtgtgcgg gaccaagagc tgtgtggcag cccgctacat 60
ggacgtgaag gggaagaagg gccctgtggg catgcccaag gaggccacgt gcgaccactt120
catgtgtctg cagcagggct ccgagtgtga cacctgggat ggccagcccg tgtgcaagtg180
cagagaccgc tgcgagaagg agcccagctt tacctgcgcc tccgacggcc ttacctacta240
taaccgctgc tacatggacg ccgaggcctg ctccaaaggc atcaccctg289
權利要求
1、豬WFIKKN2基因作為胴體性狀相關的分子標記，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO1所述，在序列表SEQ ID NO1的109bp處有1個G109-A109的堿基突變，導致Eco72I-RFLP的多態性。
2、檢測權利要求1所述堿基突變的引物對的DNA序列如下所示
正向引物5′-CTATGAGAAGTGCTGTCCCAACG-3′，
反向引物5′-CAGGGTGATGCCTTTGGAGC-3′。
3、權利要求1所述的分子標記在豬分子標記輔助選擇中的應用。
全文摘要
本發明屬于家畜分子標記制備技術領域，具體涉及一種作為豬標記輔助選擇應用的與豬胴體性狀相關的分子標記的制備及應用，所述的豬胴體性狀涉及屠宰率，內脂率和眼肌面積相等相關性狀。本發明制備的分子標記從豬WFIKKN2基因中克隆得到，所述的分子標記的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，在序列表SEQ ID NO1的第109bp處有一個G109-A109的堿基突變，導致Eco72I-RFLP多態性。本發明為豬的標記輔助選擇提供了一個新的分子標記。
文檔編號C12Q1/68GK101586164SQ20091006266
公開日2009年11月25日 申請日期2009年6月16日 優先權日2009年6月16日
發明者榜 劉, 玲 孫, 斌 樊, 徐學文, 梅 余, 趙書紅, 朱猛進, 彭中鎮 申請人:華中農業大學