微生物油脂及其短鏈醇脂肪酸酯提取方法

專利名稱：微生物油脂及其短鏈醇脂肪酸酯提取方法
技術領域：
本發明涉及微生物油脂提取方法，具體的說是一種以微生物油脂為提取目 標，同時可制備短鏈醇脂肪酸酯的方法。
背景技術：
微生物油脂是指由真菌(包括酵母)、細菌或微藻等微生物在特定培養環 境下在細胞內部合成并儲存的脂質，其化學成分主要包括甘油三酯和磷脂。某
些微生物能夠在細胞內積累大量油脂，可達到細胞干重的20%以上，被稱為產 油微生物，是尚待深入開發的天然油脂資源。由于微生物油脂的生產不受地域， 氣候和季節影響，而且可采用廉價的工農業廢棄物作為原料用于微生物發酵以 生產天然油脂，因此有望成為動植物油脂的補充和替代來源。天然油脂是一種 環境友好的可再生資源，在能源、精細化學品和新材料方面有著廣泛的應用， 然而目前絕大部分提供食用，剩余部分尚難以滿足其它工業日益增長的需求。 因此，開發微生物油脂意義重大。
微生物在特定培養環境下可在細胞內部積累微生物油脂，而能否對胞內油 脂實施高效提取將對整個微生物油脂的生產成本和環境友好性產生重要影響。
目前，對于微生物油脂的提取主要存在兩類方法其一是干法提取，即將 微生物菌體經脫水和干燥處理使之含水量低于10%，然后再利用有機溶劑進行 淋洗和浸泡，以固-液萃取胞內油脂，再將萃取液蒸發脫去溶劑從而獲得微生物
油脂。如CN1304986公開了"一種微生物油脂的制備方法"，利用蒸炒和壓搾處 理菌體后以正己垸萃取微生物油脂；此外工業上利用6號溶劑(主成分為己垸) 或4號溶劑(主成分為丁烷)對微生物菌體實施浸出操作；以及在實驗中廣泛 采用的索氏抽提操作均屬于干法提取。其二是濕法提取，即當菌體含水量在50% 以上時就進行破胞處理，然后對破胞液以有機溶劑進行液-液萃取，待萃取相和 萃余相分離后收集萃取相，蒸發脫去辯劑從而獲得微生物油脂。如CN101323865 公開"微生物油脂分離提取方法"中以高壓均質破碎細胞，然后用有機溶劑萃取油 脂；此外工業上以酶處理或超聲波處理破胞，然后以己烷-乙醇混合溶劑萃取破 胞液以提取油脂；以及實驗中以酸熱法處理破胞，然后以氯仿-甲醇混合溶劑萃 取提油均屬濕法提取。上述方法雖然各有長處，甚至部分已成功投入工業生產， 但是存在諸多不足(1)提取不徹底，如干法提取在工業上往往難以將菌渣殘油 率降低至1%以下，而濕法提取損失更大；(2)運行效率低，如工業上的濕法提取需要實施長時間的酶處理及多級平衡萃取，操作周期很長；(3)操作過程復雜，如濕法提取往往發生萃取乳化現象，難以分離萃取相和萃余相；采用混合溶劑又將導致溶劑回收困難；(4)過程安全性差，如干法提取往往采用易燃易爆的烴
類溶劑，有時還需在髙壓下操作。據此可知，綜合考慮設備投資和操作費用，現有的微生物油脂提取方法總體運行成本較高，對于大規模的微生物油脂提取
而言不夠經濟。

發明內容
本發明的目的是針對現有微生物油脂提取方法的不足之處，提供一種高效、經濟、安全的微生物油脂提取方法。
本發明的微生物油脂的提取方法，包括如下步驟
(1) 調節水分產油微生物的發酵培養物經水分調節，制得濕培養物，所述濕培養物包括含油脂微生物，且所述濕培養物的含水量為20 90%;
(2) 微波處理對步驟(1)得到的濕培養物進行微波輻射，使處理后培養物的含水量降至5% 40%;
(3) 短鏈醇處理將所述微波處理后培養物與短鏈醇混合，并加熱、攪拌，在堿性催化劑的作用下部分地醇解所述含油脂微生物體內的油脂，并同時萃取所述微生物體內的油脂，其中，所述短鏈醇為碳原子數為1 6的低級醇；
(4) 回收溶劑，對步驟(3)得到的處理液作固液分離，所得液相經蒸發
回收短鏈醇后得到微生物油脂與短鏈醇脂肪酸酯的混合物。
在本發明微生物油脂的提取方法的具體實施方式
中，在(4)回收溶劑步驟
之后還包括對所述微生物油脂與短鏈醇脂肪酸酯的混合物進行分離，以得到微生物油脂，同時得到短鏈醇脂肪酸酯。
本發明的另一方面，還提供一種制備短鏈醇脂肪酸酯的方法，其包括，按照本發明的微生物油脂的提取方法得到微生物油脂與短鏈醇脂肪酸酯的混合物，并對其進行分離，以制取短鏈醇脂肪酸酯。
本發明方法的優點是，(1)利用微波處理在短時間內加熱菌體內部水分，并使之迅速氣化，導致細胞膨脹破裂，從而迅速破壞細胞壁結構，為溶劑的滲透
創造了有利條件。比酶處理破胞方法處理速度大幅提高，且沒有酶的消耗費用；比超聲波處理破胞方法能量利用效率更高，也不會導致乳化現象。(2)利用醇解
反應將磷脂和甘油三酯部分轉化為易溶于短鏈醇的短鏈醇脂肪酸酯，瓦解了細胞膜對溶劑的阻隔作用，并大大提高了短鏈醇溶劑的溶解能力。比已報道的烴類溶劑或混合溶劑萃取方法傳質阻力小，溶劑溶解能力強，而且操作安全性高。
(3)可獲得由微生物油脂轉化而來的短鏈醇脂肪酸酯，該產物作為原料在生產
生物燃料、精細化學品以及新材料等方面比油脂更為經濟便利。綜上所述，本
5發明方法具有工藝簡單、效率高、安全性好的特點。
具體實施例方式
本發明所提方法的基本原理是，利用微波作用對極性分子(如水分子)的選擇性，迅速加熱細胞內的水分，使之在短時間內迅速氣化膨脹并從胞內釋放出來，從而破壞細胞壁結構；利用短鏈醇類溶劑對細胞膜磷脂層的溶解作用，破壞細胞膜和脂質內含體膜結構；利用短鏈醇與甘油三酯及磷脂的醇解反應，將難溶于短鏈醇的油脂轉化為易溶于短鏈醇的短鏈醇脂肪酸酯，從而提高溶劑的溶解能力；利用短鏈醇溶劑的高滲透性和高溶解性，將微生物油脂及其衍生的短鏈醇脂肪酸酯從細胞中萃取出來。
本發明提供一種用于微生物油脂及其短鏈醇脂肪酸酯的提取方法，包括如下步驟
(1) 調節水分。
對經發酵得到的含油脂微生物培養物含水量的目的在于，保證供后續微波處理的微生物培養物中有適宜的水分含量，從而在微波處理時可獲得足夠的能
量將菌體爆破。
對于產油酵母、細菌宜采用離心法收集菌體，而對于產油絲狀真菌、微藻則宜采用過濾法收集菌體。通常，經水分調節制得的微生物培養物，即濕培養物的含水量為20 90%。
當所述產油微生物為絲狀真菌且所述發酵為液態發酵時，所述水分調節優選采用過濾除水，以得到含水量50 70%的濕培養物。當所述產油微生物為酵母或細菌且所述發酵為液態發酵時，所述水分調節優選離心除水，以得到含水量為60 90%的所述濕培養物。上述液態發酵液經脫水得到的濕培養物基本上為濕的菌體。
當所述發酵為固態發酵，培養物中除菌體外還會含有大量的固體培養基，如麩皮等，因此含水量往往較低。其發酵培養物含水低于20%時，可用水浸泡發酵培養物，以得到含水量為30 70%的所述濕培養物，浸泡條件為，固液比1: 5到1: 20，溫度4-30。C，時間0.5-6h。優選的，浸泡固液比為1: 5，溫度40°C，時間0.5h。
(2) 微波處理。
對含油微生物作微波處理的目的在于迅速加熱菌體內部的水分，并使之過熱氣化導致細胞破壞，因此采用大功率短時間處理比較有效；此外水分經氣化脫除將有利于后續醇解過程的進行。然而處理功率過大或時間過長可導致微生物油脂氧化或聚合，將不利于微生物油脂的提取，因此微波處理的強度也不宜過大。
本步驟包括，將(1)中得到的濕培養物置于微波輻射裝置中進行微波輻射，使處理后培養物的含水量降至5% 40%。
優選地，微波處理所采用的微波頻率為2.45GHz、 0.915GHz和0.896GHz中的一種，微波處理的功率在10W/g-2000W/g濕菌體之間，處理時間在15s到600s之間。
通常，對于絲狀真菌發酵液的過濾除水，可得到含水量為55-65%的絲狀真菌菌體。對此，較佳地，微波處理的微波頻率可以是2.45GHz，且微波功率為500W/g濕菌體，輻射時間為120s。
(3) 短鏈醇處理。
在微波處理后的濕培養物中加入短鏈醇，在加熱攪拌的條件下，以堿性催化劑催化微生物油脂的醇解反應，可將微生物內的油脂部分地生成短鏈醇脂肪酸酯。
在醇處理中所用的短鏈醇可以是碳數為1 6的低級醇，優選地，可以是甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇和丁醇中的一種。所采用的堿性催化劑指氫氧化鈉、氫氧化鉀、甲醇鈉等均相催化劑(溶于短鏈醇)以及單獨或復合堿金屬氧化物等非均相催化劑(不溶于短鏈醇)中的一種。優選的，甲醇可用于該反應，而氫氧化鈉可用作催化劑。
醇處理的實施條件可以是，微生物培養物與短鏈醇固液比為h 1到1:
20(w/v)，催化劑用量為短鏈醇重量的0.01-5%(w/v)，反應溫度20-100°C，反應時間20min到300min。優選的，固液比約1: 5(w/v)，催化劑用量為短鏈醇的l%(w/v)，反應溫度約64。C，反應時間約120min。
除非有特別說明，本文所用的單位中，單獨的％指重量百分比，％ (w/v)指g/100ml，固液比中提及的w/v指固體重量(g)與液體(ml)之比。
在短鏈醇處理中，部分短鏈醇起到反應劑的作用，經醇解反應將微生物油脂部分轉化為短鏈醇脂肪酸酯，而未反應的短鏈醇起到萃取劑的作用，將油脂和反應生成的短鏈醇脂肪酸酯萃取出來。在醇解反應過程中所生成的短鏈醇脂肪酸酯對于尚未轉化的微生物油脂也具有良好的溶解力，因此在萃取過程中充當了助溶劑的作用，可以強化萃取效果。因此該過程并非只是一個化學反應過程，也不只是一個物理萃取過程，而是一個反應-萃取耦合過程。
(4) 回收溶劑。
對上述處理液經離心或過濾與微生物培養物中的固體渣分離，得到短鏈醇、
7短鏈醇脂肪酸酯及油脂的混合物。經蒸發回收短鏈醇，蒸發殘留物經水洗脫除蒸發殘留物中的水溶性雜質，并干燥脫除殘留水分，可得微生物油脂提取產物。此步驟得到的微生物油脂產物中還含有醇解反應中生成的短鏈醇脂肪酸酯。本發明提取方法得到的微生物油脂產品可以是微生物油脂與短鏈醇脂肪酸酯的混合物，但也可以通過下述的進一步純化分離得到較純的微生物油脂。
(5)分離油脂。
對上述微生物油脂與短鏈醇脂肪酸酯的混合物進行分離，在得到微生物油脂的同時得到短鏈醇脂肪酸酯。
關于分離方法，本領域技術人員可以根據油脂與短鏈醇酯之間沸點的不同，以蒸發的方法實施物理分離；或者通過醇解反應將上述微生物油脂與短鏈醇脂肪酸酯的混合物中的油脂全部轉化為短鏈醇脂肪酸酯，從而以反應分離的方式獲得短鏈醇脂肪酸酯產物。
前述短鏈醇處理條件對提取物即所得油脂與短鏈醇脂肪酸酯的含量比例有影響。當催化劑用量較大、反應溫度較高且反應時間較長時，提取物中短鏈醇脂肪酸酯含量將增大，反之則油脂含量增大。可以根據實際產品要求，通過控制催化劑用量、反應時間以及反應溫度調節油脂及短鏈醇脂肪酸酯的生成量。
以下通過實施例和對比例，對本發明作進一步說明。
分析方法
總脂質(包括油脂、磷脂和短鏈醇脂肪酸酯)含量可采用乙醚溶解法測定。具體可如下準確稱取5g提取物，以20mL乙醚萃取3輪，將不溶物加熱至60°C脫除殘留溶劑后稱重，即獲得乙醚不溶物含量，溶解部分為總脂質含量。
可采用氣相色譜法測定提取產物中短鏈醇脂肪酸酯的含量。具體的分析方法為準確稱取O.lg提取產物，溶解于正己烷中，加入十三酸甲酯內標，并定溶至10mL。采用GC9800氣相色譜儀分析，裝備FFAP 25mx0.25mmx0.25pm石英毛細管色譜柱，FID檢測，高純氮氣為載氣。氣化室溫度20(TC，柱溫18(TC，檢測器溫度22(TC,進樣量0.5pL，根據短鏈醇脂肪酸酯峰面積定量。
根據總脂質含量與短鏈醇脂肪酸酯含量之差可求出甘油三酯含量。
油脂分離方法例
可用如下方法分離油脂和短鏈醇脂肪酸酯將所制得的混合物5mmHg殘壓下，加熱至220-24(TC，以蒸發短鏈醇脂肪酸酯，經冷凝后可獲得短鏈醇脂肪酸酯產物；未蒸發成分為甘油三酯產物。也可采用如下反應分離方法分離油脂和短鏈醇脂肪酸酯在所制得的混合
物中增補等體積的相應短鏈醇，加入0.1%的NaOH催化劑，在6(^C下攪拌反應2h，可將混合物中的油脂轉化為短鏈醇脂肪酸酯，再經回收溶劑和水洗干燥
后制得脂肪酸短鏈醇產物。
實施例1:
真空抽濾收集液體培養基中的深黃被孢霉Mor"e^//a /sa6e///"a CGMCC3.3410菌絲體，經分析該菌絲體含水量63% (質量百分比)，干菌含油量56%(質量百分比)。將該菌絲體置于微波爐中以頻率為2.45GHz，強度為200W/g濕菌體的微波處理130s。然后，投入短鏈醇處理反應器中，加入含0.5 mol/L KOH的甲醇溶液，焚固液比達1: 5 (w/v)，在64。C下攪拌反應180min，將反應液真空抽濾得到濾液。將抽濾所得菌渣加熱至8(TC以蒸發回收短鏈醇溶劑，并分析其殘油量為0.3% (質量百分比)。將抽濾所獲濾液置于50"C， 60mmHg的殘壓下蒸發溶劑，所得未蒸發液相以15% (體積百分比)的清水洗滌3次至洗滌液pIK7，剩余油相在95"C， 60mmHg殘壓下真空干燥lh得微生物油脂及其甲酯衍生物的混合物，計算產物得率為99%。按上述分析方法測得該混合物中油脂與脂肪酸甲酯的重量比為1: 20。
對比例1:
真空抽濾收集液體培養基中的深黃被孢霉AfoWere//a ^a6e仍"a CGMCC3.3410菌絲體，經分析該菌絲體含水量63% (質量百分比)，干菌含油量56%(質量百分比)。將該菌絲體置于真空干燥器中在70°C， 10mmHg殘壓下真空干燥5h，使菌體含水量達8.6% (質量百分比)。置于萃取罐中以新鮮正己烷在45。C下浸泡萃取3h，固液比1: 5 (w/v)，采用該條件萃取3輪，加壓過濾分離溶劑相和固相(菌渣)，合并溶劑相并在12(TC下蒸發回收正己垸溶劑，從而獲得微生物油脂。所得菌渣于8CTC下蒸發回收溶劑，并分析其殘油量為2% (質量百分比)。該過程微生物油脂得率為91%。
對比例2:
真空抽濾收集液體培養基中的深黃被孢霉^foW/ere/to /^6e〃/"a CGMCC3.3410菌絲體，經分析該菌絲體含水量63% (質量百分比)，干菌含油量56%(質量百分比)。將該菌絲體置于微波爐中以頻率為2.45GHz，強度為200W/g濕菌體的微波處理130s。置于萃取罐中以新鮮正己烷在45t:下浸泡萃取lh，固液比1: 5 (w/v)，采用該條件萃取3輪，加壓過濾分離溶劑相和固相(菌渣)，合并溶劑相并在12(TC下蒸發回收正己烷溶劑，從而獲得微生物油脂。所得菌渣于8crc下蒸發回收溶劑，并分析其殘油量為1% (質量百分比)。該過程微生物
油脂得率為95%。
以上實例說明，采用本發明所提供的微波破胞方法可有效降低溶劑萃取過 程的傳質阻力，從而提高萃取效率；此外采用醇解反應和固液萃取相結合的處 理方式，可大幅提高微生物油脂的提取效率，減少微生物油脂的提取時間，并 降低菌渣含油量，提高產物得率。
實施例2
8000g離心收集液體培養基中的油脂酵母丄^om;;c^ Warfe_yZ CGMCC 2.1608
菌體，經分析該菌體含水量76% (質量百分比)，干菌含油量46% (質量百分 比)。將該菌體置于微波爐中以頻率為2.45GHz，強度為400W/g濕菌體的微波 處理100s。然后，投入短鏈醇處理反應器中，加入含0.08% CH3ONa的甲醇溶 液，使固液比達l: 2 (w/v)，在50。C下攪拌反應60min，將反應物離心分別得 到上清液和殘渣。將殘渣加熱至8(TC以蒸發回收溶劑，并分析其殘油量為0.1% (質量百分比)。將離心所得上清液液置于5(TC， 60mmHg的殘壓下蒸發溶劑， 所得未蒸發液相以15% (體積百分比)的清水洗滌3次至洗滌液pH〈，剩余油 相在95。C， 60mmHg殘壓下真空干燥lh得微生物油脂及其甲酯衍生物，計算產 物得率達98%。按上述分析方法測得該混合物中油脂與脂肪酸甲酯的重量比為 1: 2。
實施例3
10000g下離心收集液體培養基中的M少co6a"e〃'ww sp. QJ3011 (產油細菌) 菌體，經分析該菌體含水量89% (質量百分比)，干菌含油量31% (質量百分 比)。將該菌體置于微波爐中以頻率為2.45GHz，強度為100W/g濕菌體的微波 處理300s。然后，投入短鏈醇處理反應器中，加入含0.1mol/LNaOH的異丙醇 溶液，使固液比達l: 2 (w/v)，在8(TC下攪拌反應90min，將反應物離心分別 得到上清液和殘渣。將殘渣加熱至12(TC以蒸發回收溶劑，并分析其殘油量為 0.12%(質量百分比)。將離心所得上清液液置于8(TC， 60mmHg的殘壓下蒸發 溶劑，所得未蒸發液相以15% (體積百分比)的清水洗滌3次至洗滌液pIK7， 剩余油相在95X:， 60mmHg殘壓下真空干燥lh得微生物油脂及其異丙醇酯衍生 物，計算產物得率達98%。按上述分析方法測得該混合物中油脂與脂肪酸甲酯 的重量比為1: 6。
以上實施例1 3得到的混合物用油脂分離方法實施例中的方法分離，可以
10分別得到較純的微生物油脂和相應的短鏈醇脂肪酸酯。
以上實施例表明，本發明所提供的方法可通用于多種產油微生物，采用不 同的短鏈醇作為溶劑即可獲得各類短鏈醇酯。為了達到良好的破胞效果，微波 處理的時間和強度應根據菌體含水量及菌體種類實施調整。為了調整提取產物 中微生物油脂和相應短鏈醇脂肪酸酯的比例，可通過調整反應溫度，反應時間 和催化劑濃度來實現。
1權利要求
1. 一種微生物油脂及其短鏈醇脂肪酸酯的提取方法，其特征在于，包括如下步驟(1)調節水分產油微生物的發酵培養物經水分調節，制得濕培養物，所述濕培養物包括含油脂微生物，且所述濕培養物的含水量為20～90％；(2)微波處理對步驟(1)得到的濕培養物進行微波輻射，使處理后培養物的含水量降至5％～40％；(3)短鏈醇處理將所述微波處理后培養物與短鏈醇混合，并加熱、攪拌，在堿性催化劑的作用下部分地醇解所述含油脂微生物體內的油脂，并同時萃取所述微生物體內的油脂，其中，所述短鏈醇為碳原子數為1～6的低級醇；(4)回收溶劑對步驟(3)得到的處理液作固液分離，所得液相經蒸發回收短鏈醇后得到微生物油脂與短鏈醇脂肪酸酯的混合物。
2. 如權利要求1所述的提取方法，步驟(1)中所述濕培養物的含水量為30 90%。
3. 如權利要求1所述的提取方法，步驟(1)中，當所述產油微生物為絲狀真 菌或微藻且所述發酵為液態發酵時，所述水分調節包括過濾除水，以得到含 水量50 70%的所述濕培養物；當所述產油微生物為酵母或細菌且所述發酵 為液態發酵時，所述水分調節包括離心除水，以得到含水量為60 卯％的所 述濕培養物；當所述發酵為固態發酵，且其發酵培養物含水低于20%時，所 述水分調節包括用水浸泡發酵培養物，以得到含水量為30 70%的所述濕培 養物。
4. 如權利要求l所述的提取方法，步驟(2)中，所用微波的頻率為2.45GHz、 0.915GHz和0.896GHz中的一種，且微波的功率為10W/g 2000W/g濕培養 物，輻射時間為15s 600s。
5. 如權利要求1所述的提取方法，步驟(1)得到的所述濕培養物為含水量為 55-75%的絲狀真菌菌體，步驟(2)所用微波的頻率為2.45GHz，且微波功 率為500W/g濕培養物，輻射時間為120s。
6. 如權利要求1所述的提取方法，步驟(3)中，所述微波處理后培養物與短 鏈醇混合比為1: l至l: 20 (w/v)，堿性催化劑用量為短鏈醇的的0.01 5% (w/v)，反應溫度20 100°C，反應時間20min 300min。
7. 如權利要求1所述的提取方法，步驟(3)中所述的短鏈醇選自甲醇、乙醇、 丙醇、異丙醇和丁醇；所述堿性催化劑為選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、甲醇鈉的溶于短鏈醇的均相催化劑，或選自堿金屬氧化物的不溶于短鏈醇的非均相 催化劑。
8. 如權利要求6所述的提取方法，其中所述微波處理后培養物與短鏈醇的混合 比為1: 5 (w/v)，堿性催化劑用量為短鏈醇的1% (w/v)，反應溫度64匸， 反應時間120min。
9. 如權利要求1所述的提取方法，在步驟(4)之后還包括對所述微生物油脂 與短鏈醇脂肪酸酯的混合物進行分離，以得到微生物油脂，同時得到短鏈醇 脂肪酸酯。
10. —種通過權利要求1 8中任一項所述的提取方法來制備短鏈醇脂肪酸酯的 方法，其特征在于，對步驟(4)得到的所述微生物油脂與短鏈醇脂肪酸酯 的混合物進行分離，以制取短鏈醇脂肪酸酯。
全文摘要
一種微生物油脂及其短鏈醇脂肪酸酯的提取方法，包括調節水分以得到包括含油脂微生物的含水量為20～90％的濕培養物；微波處理對濕培養物進行微波輻射，使含水量降至5％～40％；短鏈醇處理在堿性催化劑的作用下部分醇解微生物體內油脂，同時萃取油脂；回收溶劑作固液分離，并經蒸發回收短鏈醇后得到微生物油脂與短鏈醇脂肪酸酯的混合物。本方法提取效率高，并能同時得到微生物油脂和短鏈醇脂肪酸酯。
文檔編號C12P7/64GK101481711SQ200910060589
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月21日 優先權日2009年1月21日
發明者曄 劉, 莉 吳, 韋一良, 高新蕾 申請人:武漢工業學院