專利名稱：一種采用組合抑菌劑從天然水域中快速分離異養微藻的方法
技術領域：
本發明涉及一種采用組合抑菌劑從天然水域中快速分離異養微藻的方法，屬于微藻生 物技術領域。
背景技術：
微藻富含蛋白質、脂肪、EPA、 DHA等多種功能活性物質，具有重要的經濟價值。開 發利用微藻已成為人類獲得食品、藥品、生物燃料等的新途徑。微藻屬于低等植物，主要 是利用光合作用轉化無機碳源而進行生長。傳統的開放光合自養方式存在光照限制、易污 染和占地面積大等問題，因而生產效率不高。研究表明，某些單細胞微藻(如小球藻)可 在無光照條件下利用有機碳源進行異養生長，其生物量及生產效率均得到大幅度提高，這 為微藻的高效規模化生產提供了可能。
從自然界篩選異養微藻，是為工業生產提供高效藻株，以及進一步深入研究微藻異養 生長的機制的需要。到目前為止，常用的微藻純化方法主要是在光照自養或混養條件下， 采用物理方法如涂布、劃線、毛細吸管等方法。對于異養藻株篩選來說，這些研究的主要 不足之處在于；(1)主要依賴于光照自養培養的反復分離純化，周期長，設備要求較高 (一般需要光照培養裝置)；(2)分離的藻株缺乏針對性，大多數藻株不能在異養條件 下生長；(3)藻種的無菌化效率較低，在多次傳代培養、尤其是異養培養之后易污染雜 菌；(4)目前采用抗生素的微藻無菌化方法主要針對細菌，然而在我們的研究中發現， 對于異養藻種的篩選來說，克服霉菌污染是一個更為困難的問題。
通過對國內專利和文獻檢索，還未見關于從天然水域中直接分離純化異養微藻方法的 報道。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足而提供一種采用組合抑菌劑從天然水域中快速 地分離異養微藻的方法。
本發明的目的由以下技術措施實現
采用組合抑菌劑從天然水域中快速分離異養微藻的方法包括以下步驟(1) 配制微藻自養液體培養基(如水生4號培養基、Basal培養基或Kuhl培養基等)；將 配制好的液體培養基裝入三角瓶中，加硅膠塞，在溫度121。C滅菌15-20min，冷卻備用。
(2) 配制微藻固體異養培養基在微藻自養液體培養基中加入1%葡萄糖及1.5-2%瓊脂， 在水浴中加熱攪拌煮沸，裝入三角瓶中，加硅膠塞，在溫度121。C滅菌15 20min，冷卻備 用；
(3) 含組合抑菌劑的培養基平板制備將微藻固體異養培養基加熱融化，冷卻至50-6(TC， 加入20-60pg/mL的氨芐青霉素和200-600pg/mL的納他霉素，混勻后倒平板；
(4) 取天然水樣如水樣中的微藻數量較多，直接進入步驟(5);如水樣中微藻數量較 少，則將水樣高速離心(轉速^3000rpm,時間》15min)，棄去上清液，重復離心并棄去 上清液3-5次，加入微藻自養液體培養基，自然光照增殖培養一周左右；
(5) 將水樣或經過步驟(4)增殖培養的培養液均勻涂布于含組合抑菌劑的培養基平板， 然后于恒溫培養箱中倒置培養；
(6) 待平板上長出有色藻落后，用接種環挑取到空白的含組合抑菌劑的培養基平板上劃 線，于溫度25-35'C恒溫培養箱中倒置培養2-3天；
(7) 重復步驟(6) 3-5次，獲得純化的可異養培養的微藻。 本發明具有如下優點
1. 不依賴于光照自養培養的反復分離純化，周期短，操作簡單，設備要求低，不需要
光照培養裝置。
2. 分離藻株具有明確的針對性，可確保分離到的藻株能在異養培養條件下生長。
3. 藻種的無菌化效率高，在多次異養傳代培養之后不易污染雜菌。
4. 能夠有效克服異養藻種篩選過程中的霉菌污染問題。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發明進行具體的描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對本 發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員可以 根據上述本發明的內容對本發明作出一些非本質的改進和調整。 實施例1
(1) 配制Basal液體培養基(1000mL) : KN03 1.25g， KH2P04 1.25g, MgS04 lg, A液100mL， B液10mL。其中A液配方(lOOOmL) : H3B031.142 g， CaCl2 '2H:;0 1.11 g, ZnS04 7H20 0. 882 g， MnCl2 4H20 0.142 g， CuS04 5H20 0.157 g， Mo03 0.071 g， Co(N03)2 6H20 0.049 g， EDTA 4 g; B液配方(lOOmL) : FeS04 7H20 0.498 g， EDTA1 g。用5%的NaOH將培養基的pH調為6.1 。在500 mL三角瓶中加入50mL配制好的Basal 培養基，將瓶口用硅膠塞封閉后在溫度12rC滅菌15min，冷卻備用。
(2) 配制異養Basal固體培養基在Basal液體培養基中加入1 %的葡萄糖和1.5% 的瓊脂，在水浴中加熱攪拌煮沸，稍冷卻后，用5。/。的NaOH將培養基的pH調為6.1，將 調好pH的培養基放入三角瓶，將瓶口用硅膠塞封閉后在溫度121'C滅菌15min，冷卻備用。
(3) 抑菌劑平板制備將異養Basal固體培養基加熱融化后冷卻至50°C，加入 40嗎/mL的氨節青霉素和400嗎/mL的納他霉素，迅速混勻后倒平板。
(4) 將含有微藻的成都府南河水樣，經離心機離心(3000rpm, 15min)后倒去上清 液，重復3次后，搖勻離心管底部的藻細胞溶液懸浮，并將此溶液(約共有50mL)移入 裝有50 mL滅菌Basal液體培養基的三角瓶中，放于自然光照下增殖培養一周。
(5) 將增殖培養的培養液均勻涂布于含組合抑菌劑的培養基平板，然后于28'C恒 溫培養箱中倒置培養。
(6) 待平板上長出綠色藻落后，用接種環挑取到空白的含組合抑菌劑的培養基平板 上劃線，然后于溫度28'C恒溫培養箱中倒置培養2天。
(7) 重復步驟(6) 3次，獲得純化的可異養培養的綠藻(初步鑒定為小球藻)。
該藻株可在含葡萄糖的液體或固體Basal培養基上生長。 實施例2
(1) 配制水生4號液體培養基(1000mL) : (NH4)2S04 0.2g ，過磷酸鈣 Ca(H2P04) 'H20+2(CaS。4 'H2。)0.03g ， MgS04 '7H2O0.08g, NaHC03 0.10g， KC10.025g， FeCl3(l。/。溶液)0.15mL, 土壤浸出液0.5mL;用5%NaOH將pH調為6.1。在500mL三角 瓶中加入50mL配制好的Basal培養基，將瓶口用硅膠塞封閉后在溫度121'C滅菌15min， 冷卻備用。
(2) 配制異養水生4號固體培養基在水生4號液體培養基中加入1%的葡萄糖和 1.5%的瓊脂，在水浴中加熱攪拌煮沸，稍冷卻后，用5y。的NaOH將培養基的pH調為6.1， 將調好pH的培養基放入三角瓶，將瓶口用硅膠塞封閉后在溫度12rC滅菌15min，冷卻備用。
(3) 抑菌劑平板制備將異養水生4號固體培養基加熱融化后冷卻至5(TC，加入 60嗎/mL的氨芐青霉素和600嗎/mL的納他霉素，迅速混勻后倒平板。
(4) 將含有微藻的成都江安河水樣，經離心機離心(3000rpm， 15min)后倒去上清 液，重復3次后，搖勻離心管底部的藻細胞溶液懸浮，并將此溶液(約共有50mL)移入裝有50 mL滅菌Basal液體培養基的三角瓶中，放于自然光照下增殖培養一周。
(5) 將增殖培養的培養液均勻涂布于含組合抑菌劑的培養基平板，然后于35°。直 溫培養箱中倒置培養。
(6) 待平板上長出綠色藻落后，用接種環挑取到空白的含組合抑菌劑的培養基平板 上劃線，然后于溫度35'C恒溫培養箱中倒置培養3天。
(7) 重復步驟(6) 5次，獲得純化的可異養培養的綠藻。該藻株可在含葡萄糖的 液體或固體水生4號培養基上生長。
實施例3
(1) 配制Basal液體培養基(1000mL) : KN03 1.25g， KH2P04 1.25g， MgS04 lg， A液100mL， B液10mL。其中A液配方(lOOOmL) : H3B031.142 g， CaCI2 '2H20 1.11 g， ZnS04 7H20 0.882 g， MnCl2 4H20 0.142 g， CuS04 5H20 0.157 g， Mo03 0.071 g， Co(N03)2 6H20 0.049 g， EDTA 4 g; B液配方(lOOmL) : FeS04 7H20 0.498 g， EDTA 1 g。用5%的NaOH將培養基的pH調為6.1 。在500 mL三角瓶中加入50mL配制好的Basal 培養基，將瓶口用硅膠塞封閉后在12rC滅菌15min，冷卻備用。
(2) 配制異養Basal固體培養基在Basal液體培養基中加入1 %的葡萄糖和2%的 瓊脂，在水浴中加熱攪拌煮沸，稍冷卻后，用5n/。的NaOH將培養基的pH調為6.1，將調 好pH的培養基放入三角瓶，將瓶口用硅膠塞封閉后在溫度12rC滅菌15min，冷卻備用。
(3) 抑菌劑平板制備將異養Basal固體培養基加熱融化后冷卻至50°C，加入 20嗎/mL的氨芐青霉素和200ng/mL的納他霉素，迅速混勻后倒平板。
(4) 將含有微藻的成都府南河水樣，經離心機離心(3000rpm， 15min)后倒去上清 液，重復3次后，搖勻離心管底部的藻細胞溶液懸浮，并將此溶液(約共有50mL)移入 裝有50 mL滅菌Basal液體培養基的三角瓶中，放于自然光照下增殖培養一周。
(5) 將增殖培養的培養液均勻涂布于含組合抑菌劑的培養基平板，然后于25'C恒 溫培養箱中倒置培養。
(6) 待平板上長出紅色藻落后，用接種環挑取到空白的含組合抑菌劑的培養基平板 上劃線，然后于溫度25'C恒溫培養箱中倒置培養3天。
重復步驟(6) 4次，獲得純化的可異養培養的紅球藻。該藻株可在含葡萄糖的液體或 固體Basal培養基上生長。
權利要求
1.一種從天然水域中快速分離可異養培養微藻的方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)配制微藻自養液體培養基將配制好的液體培養基裝入三角瓶中，加硅膠塞，在溫度121℃滅菌15-20min，冷卻備用；(2)配制微藻固體異養培養基在微藻自養液體培養基中加入1％葡萄糖及1.5-2％瓊脂，在水浴中加熱攪拌煮沸，裝入三角瓶中，加硅膠塞，在溫度121℃滅菌15～20min，冷卻備用；(3)含組合抑菌劑的培養基平板制備，將微藻固體異養培養基加熱融化后冷卻至50-60℃，加入20-60μg/mL的氨芐青霉素和200-600μg/mL的納他霉素，混勻后倒平板；(4)取天然水樣如水樣中微藻數量較多，直接進入步驟(5)；如水樣中微藻數量較少，則將水樣高速離心，轉速≥3000rpm，時間≥15min，棄去上清液，重復離心并棄去上清液3-5次，加入微藻自養液體培養基，自然光照增殖培養一周左右；(5)將水樣或經過步驟(4)增殖培養的培養液均勻涂布于含組合抑菌劑的培養基平板，于溫度25-35℃恒溫培養箱中倒置培養；(6)待平板上長出有色藻落后，用接種環挑取到空白的含組合抑菌劑的培養基平板上劃線，然后于恒溫培養箱中倒置培養2-3天；(7)重復步驟(6)3-5次，獲得純化的可異養培養的微藻。
全文摘要
本發明公開了一種采用組合抑菌劑從天然水域中快速分離純化異養微藻的方法。其特點是該方法包括以下步驟a)配制微藻自養液體培養基；b)配制微藻固體異養培養基(在微藻自養液體培養基中加入1％葡萄糖及1.5-2％瓊脂)；c)制備含組合抑菌劑(20-60μg/mL氨芐青霉素，200-600μg/mL納他霉素)的培養基平板；d)將天然水樣或經過增殖培養的水樣涂布于含組合抑菌劑的培養基平板，于溫度25-35℃的恒溫培養箱中培養；e)待平板上長出有色藻落后，用接種環挑取到空白的含組合抑菌劑的培養基平板上劃線，然后于25-35℃恒溫培養箱中培養；f)重復步驟e)3-5次，即可獲得純化的可異養培養的微藻。本發明具有操作簡便、快速、可靠，能在較短時間內從天然水域中分離純化出可異養培養微藻的優點。
文檔編號C12N1/12GK101608164SQ20091006001
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月17日 優先權日2009年7月17日
發明者吳正云, 張文學, 娟 曾 申請人:四川大學