從人類早期流產(chǎn)的胎兒組織分離純化和培養(yǎng)增殖全能干細(xì)胞的方法

專利名稱：從人類早期流產(chǎn)的胎兒組織分離純化和培養(yǎng)增殖全能干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離純化干細(xì)胞的方法，具體的說，該方法能夠從早期 流產(chǎn)的胎兒組織，包括胎兒的臍帶或腸組織中分離純化和培養(yǎng)增殖全能干細(xì) 胞。
背景技術(shù)：
對(duì)因各種因素所造成的人體組織器官缺損和功能障礙的疾病，如帕金森 氏病、糖尿病、外傷性脊髓損傷、細(xì)胞變性病、燒傷、心肌病和骨損傷等， 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無有效的治療方法。但隨著干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和近年來對(duì)干細(xì)胞研究 的不斷深入和發(fā)展，為治愈這些疾病帶來了新的希望。因此，人類干細(xì)胞的 研究己成為繼人類基因組計(jì)劃后，生命科學(xué)中最活躍的研究領(lǐng)域；也將是人 類疾病治療模式劃時(shí)代的革新(Guillot etal. 2007; Bajada et al. 2008)。
干細(xì)胞是一種來自胚胎、胎兒或成人組織器官中具有持久或終身自我更 新能力的細(xì)胞。它能產(chǎn)生特異的細(xì)胞類型，形成人體組織和器官。根據(jù)個(gè)體 發(fā)育過程中出現(xiàn)的先后次序不同，干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells)和成體干細(xì)胞(adult stem cell)。根據(jù)干細(xì)胞分化的能力又可將干 細(xì)胞分為全能干細(xì)胞(pluripotent stem cell),全能干細(xì)胞(multipotent stem cell)禾口專會(huì)b干細(xì)胞 (unipotent stem cell)。
成體干細(xì)胞是指從兒童和成人組織中存在的全能干細(xì)胞和專能干細(xì)胞 (Young and Black . 2004)。成體千細(xì)胞可從患者自身獲得，從而不存在組 織相容性的問題。但成體干細(xì)胞的增殖能力和向多系分化的效率很不理想。 比如，從新生兒臍帶血收集的造血干細(xì)胞在體外無法大量增殖，其數(shù)量僅能 用于兒童的治療(Rogers and Casper .2003)。
人胚胎干細(xì)胞則是一種全能干細(xì)胞。體內(nèi)和體外的研究都表明胚胎干 細(xì)胞能分化成人體的絕大多數(shù)細(xì)胞類群，諸如神經(jīng)細(xì)胞、心肌、骨骼肌、內(nèi) 皮細(xì)胞、胃腸組織、肝細(xì)胞、胰島e—細(xì)胞、骨、軟骨、造血細(xì)胞等。與成 體干細(xì)胞相比，胚胎干細(xì)胞具有無限的增殖能力，能為細(xì)胞、組織或器官的 移植治療提供無限的來源(Pera and Trounson. 2004)。但從胚泡僅能獲得 200-250個(gè)細(xì)胞；而且，胚胎干細(xì)胞的研究受阻于倫理、道德、法律等問題。 最近，美國和日本的兩組科學(xué)家分別宣稱利用"再程序化"技術(shù)成功地誘導(dǎo)人皮膚細(xì)胞生成胚胎樣干細(xì)胞系。研究人員認(rèn)為這.一發(fā)明最終會(huì)解決干細(xì)胞
的來源，結(jié)束胚胎干細(xì)胞倫理學(xué)之爭(Takahashi and Yamanaka . 2006; Yu etal. 2007)。但是，從成體細(xì)胞來源的干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞有顯著的不同。 這些誘導(dǎo)多效性干細(xì)胞系只是具有人胚胎干細(xì)胞的基因表達(dá)特點(diǎn)，在體外小 規(guī)模增殖幾個(gè)月，能誘導(dǎo)生成幾種功能細(xì)胞。但在很多特性上與胚胎干細(xì)胞 相去甚遠(yuǎn)(Chan and Harris. 2008)。因此，從新的途徑尋找新的自然全能 干細(xì)胞來源，同時(shí)又避免干細(xì)胞倫理學(xué)之爭，是現(xiàn)今干細(xì)胞研究和臨床應(yīng)用 的發(fā)展方向之一。
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)是具有自我更新能力且 能向多個(gè)方向分化的干細(xì)胞。MSC最早發(fā)現(xiàn)于骨髓中。當(dāng)前用于基礎(chǔ)和臨床 研究的MSC主要來源于骨髓。但是，成人骨髓中MSC的含量極低(0.01% 0.001%)，并且其數(shù)量隨人的年齡增長而下降。進(jìn)一步的研究證實(shí)除骨髓外， 在外周血、羊膜液、胎盤、臍帶血、脂肪、關(guān)節(jié)滑膜、骨骼肌和皮膚的結(jié)締 組織等多種組織中均發(fā)現(xiàn)有MSC的存在(Anker etal. 2003; et al. Romanov et al 2003; Lee et al. 2004; McElreavey et a1.1991)。石開究還表明: 這類干細(xì)胞像其它成人干細(xì)胞一樣，可以自身增殖，能夠分化成間質(zhì)細(xì)胞系， 而且可以分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元等(Wang et al.2004; Mitchell et al. 2003)。但這類干細(xì)胞不表達(dá)胚胎干細(xì)胞特有 的細(xì)胞表面標(biāo)志物，也無形成胚胎體(embryonic bodies, EB)的能力。因 此，不完全具有胚胎干細(xì)胞的特點(diǎn)。
從胚胎著床到懷孕第十二周，稱之為妊娠第一周期。在此期間，胎兒各 種組織器官基本成型，但仍處于早期發(fā)育階段。不管科技如何發(fā)達(dá)，也不管 人們?nèi)绾握J(rèn)識(shí)，自然流產(chǎn)或人工流產(chǎn)總是難以避免，我們假設(shè)從早期流產(chǎn) 的胎兒組織分離純化出的干細(xì)胞比從出生后分離出的干細(xì)胞可能具有全能干 細(xì)胞的潛力。早期流產(chǎn)的胎兒組織是一種醫(yī)源性廢棄物，從早期流產(chǎn)的胎兒 組織尋找自然全能干細(xì)胞則是利用已經(jīng)死亡的胎兒，不存在摧毀活體胚胎的 問題，即所謂的干細(xì)胞的倫理學(xué)問題。
關(guān)鍵是，如何找到一種方法，可以比較方便地從妊娠一期人工流產(chǎn)的胎 兒組織中成功地分離純化出干細(xì)胞并且穩(wěn)定保持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)。當(dāng)這 種方法能夠方便可靠地從不同的早期流產(chǎn)胎兒組織中分離純化、冷凍保存和 復(fù)蘇全能干細(xì)胞時(shí)，建立全能千細(xì)胞庫就成為可能，也就為干細(xì)胞移植治療 各種人體組織器官缺損和功能障礙的疾病，如帕金森氏病、糖尿病、外傷性 脊髓損傷、細(xì)胞變性病、燒傷、心肌病和骨損傷等，帶來希望。

發(fā)明內(nèi)容
5為此，我們釆用一種相對(duì)簡單的方法從妊娠一期人工流產(chǎn)的胎兒組織成 功地分離純化出干細(xì)胞。
本發(fā)明分離純化來自人早期流產(chǎn)胎兒組織的全能干細(xì)胞的方法包括a、 收集妊娠第一周期流產(chǎn)的胎兒-胎盤組織樣品；b、從步驟a的樣品中分離獲 得胎兒臍帶或腸組織；c、從步驟b的胎兒臍帶或腸組織中得到胎兒臍帶或腸 組織細(xì)胞；d、從步驟c得到的胎兒臍帶或腸組織細(xì)胞中分離純化表達(dá)胚胎干 細(xì)胞標(biāo)志物OCT-4， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60和TRA-1-81的干細(xì)胞，這些 干細(xì)胞可以形成胚胎體。
本發(fā)明的方法還包括e、凍存步驟d得到的純化干細(xì)胞；f、復(fù)蘇凍存 的純化干細(xì)胞。 ^
本發(fā)明方法還包括維持這些干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。
本發(fā)明方法首先是收集妊娠一期流產(chǎn)的各種胎兒組織。組織的收集是通 過人工流產(chǎn)或自然流產(chǎn)的方法。然后從收集到的這些醫(yī)源性廢物中找尋胎兒 臍帶或腸組織。找到這些組織后，對(duì)這些組織進(jìn)行處理。其步驟包括用膠原 酶消化這些組織來獲取這些組織的細(xì)胞。然后用生理鹽水洗滌分離的細(xì)胞。 任何類型的膠原酶如果能消化這些組織來獲取這些組織的細(xì)胞均可采用；比 如lmg/ml的I型膠原酶。
更具體的，本發(fā)明方法步驟a所述的妊娠第一周期流產(chǎn)胎兒組織為妊娠 8周至12周人工流產(chǎn)或自然流產(chǎn)的胎兒一胎盤組織。
在步驟c中，先將胎兒臍帶或腸組織用滅菌的生理鹽水洗滌，再剪成小 塊，用膠原酶消化至細(xì)胞成分離狀態(tài)后，離心獲得細(xì)胞沉淀，用生理鹽水洗 滌備用。
步驟d中分離純化干細(xì)胞時(shí)，可以采用層析柱純化的方式，先用免疫磁 珠技術(shù)將表達(dá)OCT—4， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60禾卩/或TRA-1-81的干細(xì)胞 純化(Durcova et al. 1998)，再將洗脫的干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)， 得到純化的干細(xì)胞株。
也可以采用體外傳代培養(yǎng)的方式純化干細(xì)胞，將步驟c得到的胎兒臍帶 或腸組織細(xì)胞用干細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)傳代，培養(yǎng)條件為，在.37°C 和5%0)2的條件下培養(yǎng)3-7天或細(xì)胞增殖約占培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底面積的70% 以上，轉(zhuǎn)移傳代至少5次，得到純化的干細(xì)胞。
所述的干細(xì)胞培養(yǎng)液由體積百分含量88X的a-MEM培養(yǎng)基，10%的胎牛 血清或bFGF(O. lng/ml)， 1%的100 X青/鏈霉素，1%的100X 二性酶素B 組成。其它的培養(yǎng)液或培養(yǎng)條件，如能維持細(xì)胞的活力亦可采用。
干細(xì)胞是具有持久或終身自我更新能力的細(xì)胞；而其它組織細(xì)胞在體外 培養(yǎng)一段時(shí)間后將自然死亡。細(xì)胞體外培養(yǎng)換代的方法包括首先將已增殖至約占培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底面積70%以上的細(xì)胞用磷酸緩沖液洗滌；然后用胰
蛋白酶-EDTA溶液處理，將生長時(shí)粘貼在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞懸??； 將這些懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，離心分離；再用新鮮的培養(yǎng)液將細(xì)胞重新 懸浮并稀釋；最后將稀釋的胎兒組織細(xì)胞重新放置到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿， 用干細(xì)胞培養(yǎng)液在5%的C02和37°C的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每3-5天換新鮮培 養(yǎng)液一次，直至細(xì)胞增殖至約占培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底面積的70%以上。再重復(fù) 上述步驟到培養(yǎng)中的細(xì)胞顯示一致的類似纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。其它的培養(yǎng) 液或培養(yǎng)條件，如能維持細(xì)胞的活力亦可采用。
維持這些干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)的方法包括上述的干細(xì)胞培養(yǎng)液，或在 無血清的干細(xì)胞培養(yǎng)液中加入某些細(xì)胞因子，如堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (basic fibroblast growth factor, bFGF)，在5%的C02和37。C的條件下 培養(yǎng)。其它的培養(yǎng)液或培養(yǎng)條件，如能維持細(xì)胞的未分化狀態(tài)亦可采用。
冷凍儲(chǔ)藏分離純化后并培養(yǎng)增殖的干細(xì)胞的方法則是首先將已增殖至約 占培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底面積70%以上的細(xì)胞用磷酸緩沖液洗滌；然后用胰蛋白 酶-EDTA溶液處理，將生長時(shí)粘貼在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞懸浮；將這 些懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，離心分離。再將分離的干細(xì)胞放置4°C，然后 用干細(xì)胞儲(chǔ)藏液重新懸浮，轉(zhuǎn)移至冷凍儲(chǔ)藏管。將裝有千細(xì)胞的冷凍儲(chǔ)藏管 放置于-70°C， 24小時(shí)，最后將裝有干細(xì)胞的冷凍儲(chǔ)藏管轉(zhuǎn)移至液氮罐長期儲(chǔ) 藏。干細(xì)胞儲(chǔ)藏液含有40%的胎牛血清，5(F。的a-MEM培養(yǎng)基和1CF。的DMS0。 其它的干細(xì)胞儲(chǔ)藏液如能維持細(xì)胞的活力亦可采用。
解凍儲(chǔ)藏干細(xì)胞的方法是將裝有干細(xì)胞的冷凍儲(chǔ)藏管從液氮罐取出，立 即放置在37。C解凍；然后離心分離；并用磷酸緩沖液洗滌。再將解凍的細(xì)胞 放置在培養(yǎng)瓶或培，養(yǎng)皿用干細(xì)胞培養(yǎng)液，在5%的C02和37°C的條件下培 養(yǎng)24小時(shí)。然后，置換新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)在5%的C02和37C。的條件下培 養(yǎng)；每3-5天換新鮮培養(yǎng)液一次。其它的培養(yǎng)液或培養(yǎng)條件，如能恢復(fù)儲(chǔ)藏 干細(xì)胞的活力亦可采用。
本發(fā)明的另一目的是提供一種來自人早期流產(chǎn)胎兒組織的全能干細(xì)胞， 是由權(quán)利要求1所述的方法分離得到的。這些分離純化的干細(xì)胞能夠表達(dá)未 分化的胚胎干細(xì)胞表達(dá)的胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物，如0CT-4， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-和TRA-1-81;以及某些轉(zhuǎn)錄因子，如OCT-4 ， Telemerase和Nanog; 并能形成胚胎體。
這些分離純化的干細(xì)胞能夠在一定的體外培養(yǎng)條件下定向分化成各種不 同類型的細(xì)胞，如心肌細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，胰島P-細(xì)胞或骨細(xì)胞。
這些能夠定向分化的全能干細(xì)胞有可能對(duì)因各種因素所造成的人體組織 器官缺損和功能障礙的疾病，如心肌病、帕金森氏病、外傷性脊髓損傷、糖尿病和骨損傷等提供細(xì)胞移植的來源。
基于本發(fā)明分離純化、凍存復(fù)蘇來自人早期流產(chǎn)胎兒組織的全能干細(xì)胞 的方法，本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種建立全能干細(xì)胞庫的方法，包括
a、 對(duì)收集的早期流產(chǎn)的胎兒一胎盤組織樣品做必要的傳染病學(xué)檢查；
b、 按照權(quán)利要求1所述的方法從不同的胎兒一胎盤組織中分離純化干細(xì)
胞；
C、對(duì)步驟b得到的干細(xì)胞株的組織相容性抗原進(jìn)行分類鑒定；
d、 根據(jù)步驟C的分類鑒定結(jié)果建立干細(xì)胞株目錄；
e、 將步驟b得到的干細(xì)胞株按權(quán)利要求10所述的方法冷凍儲(chǔ)藏。 本發(fā)明還包括按照上述方法建立的全能干細(xì)胞庫。
采用胚胎干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞移植，同異體器官和骨髓移植一樣，面臨病人 對(duì)供體組織器官因組織相容抗原的不同而產(chǎn)生免疫排斥的問題。也關(guān)系到胚
胎干細(xì)胞臨床治療的成敗的關(guān)鍵的問題。解決這個(gè)問題可能有兩種途徑一
是采用分子生物學(xué)方法對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行改造，產(chǎn)生能夠移植到不同個(gè)體的干細(xì)
胞系；二是建立類似現(xiàn)今已有的骨髓庫和嬰兒臍帶血庫的胚胎干細(xì)胞庫。前 一種途徑還有很長的路要走；而后一種途徑在我們所發(fā)明技術(shù)從醫(yī)源性廢棄
物中分離純化出全能干細(xì)胞使之成為可能。
全能干細(xì)胞庫的建立使采用細(xì)胞移植治療因各種因素所造成的人體組織 器官缺損和功能障礙的疾病，如心肌病、帕金森氏病、外傷性脊髓損傷、糖 尿病和骨損傷等成為一種可以預(yù)期的潛在手段。


圖1、免疫組化檢測(cè)孕娠第一周期流產(chǎn)胎兒腸組織中表達(dá)OCT-4(圖1A)， TRA-1-60 (圖1B)， TRA-1-81 (圖1C)， SSEA-1 (圖ID), SSEA-3 (圖1E)和 SSEA-4 (圖1F)，等胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的干細(xì)胞。
圖2、免疫組化檢測(cè)孕娠第一周期流產(chǎn)胎兒臍帶組織中表達(dá)0CT-4 (圖 2A)， TRA-1-60 (圖2B)， TRA+81 (圖2C)， SSEA-1 (圖2D)， SSEA-3 (圖 2E)和SSEA-4 (圖2F)，等胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的干細(xì)胞。
圖3、從胎兒臍帶或腸組織分離純化的干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)顯示的細(xì)胞形態(tài)特 征，圖3A為第3代細(xì)胞，而圖3B則為第12代細(xì)胞。
圖4、從胎兒臍帶或腸組織分離純化的干細(xì)胞均具有形成胚胎體的能力。 圖4A和B顯示在培養(yǎng)過程中自然形成的細(xì)胞集群。圖4A圖像放大為40倍， 圖4B則為200倍。圖4C和D顯示將培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至低粘附的培養(yǎng)皿，用 胚胎體培養(yǎng)液培養(yǎng)形成的胚胎體。圖4C圖像放大為40倍，圖4D則為100 倍。時(shí)形成的胚胎體所表達(dá)的三個(gè)胚層標(biāo)志
物，圖5B為Nestin (外胚層)，圖5C為AFP (內(nèi)胚層)，圖5D為SAM(中胚 層)及對(duì)照(圖5A)。
圖6、從胎兒臍帶或腸組織分離純化的干細(xì)胞的生長特性。
圖7、免疫組化檢測(cè)培養(yǎng)的第3代干細(xì)胞表達(dá)SSEA-1 (圖7A)， OCT-4 (圖 7B)， SSEA-3 (圖7C)， SSEA-4 (圖7E)， TRA-1-60 (圖7D)禾口TRA-1-81 (圖7F) 等胚胎千細(xì)胞標(biāo)志物。
圖8、免疫組化檢測(cè)培養(yǎng)的第12代干細(xì)胞表達(dá)SSEA-1 (圖8A)， OCT-4 (圖8B)， SSEA-3 (圖8C)， SSEA-4 (圖8E)' TRA-1-60 (圖8D)和TRA-1-81 (圖8F)等胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物。
圖9、 RT-PCR檢測(cè)培養(yǎng)的第1至第12代的干細(xì)胞表達(dá)的OCT-4， Nanog， Telemerase等胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的mRNA。
圖10、從這些干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成胰島p-細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。圖10A 和圖10B為誘導(dǎo)過程中的第III階段的胰島細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)學(xué)特征；圖10A圖 像放大100倍，圖10B圖像放大400倍。圖10C和圖10D為誘導(dǎo)過程中的第 IV階段的胰島細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)學(xué)特征；圖10C圖像放大100倍，圖10D圖像放 大400倍。
圖11、免疫組化檢測(cè)定向誘導(dǎo)分化成胰島P-細(xì)胞表達(dá)胰島l3-細(xì)胞特異性 標(biāo)志物(圖IIA為Insulin,圖11B為Nestin)。圖像放大200倍。
圖12、定向誘導(dǎo)分化成胰島p-細(xì)胞能夠在體外對(duì)葡萄糖濃度變化反應(yīng)， 分泌胰島素。
圖13、從這些干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。圖13A圖 像放大100倍；圖13B圖象放大200倍
圖14、免疫組化檢測(cè)定向誘導(dǎo)分化的細(xì)胞表達(dá)心肌細(xì)胞的特異性標(biāo)志物 (圖14A為P-MHC，圖14B為cTNI)。
圖15、 RT-PCR檢測(cè)定向誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞表達(dá)a-MHC， ANF， MLC2v和 Nkx2. 5的m腿。
圖16、從這些干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。圖16A圖 像放大100倍，圖16B圖像放大400倍。
圖17、免疫組化檢測(cè)定向誘導(dǎo)分化的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物 (圖17A為Nestin,圖17B為卩-tubulin,圖17C為MAP-2和圖17D為MPB)。
圖18、 RT-PCR檢測(cè)定向誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)Bfl， NF， Noggin的 mRNA。
圖19、從這些干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。圖19A和B 為在培養(yǎng)第14天的骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，圖19A圖像放大400倍；圖19B
9放大100倍。圖19C和D為在培養(yǎng)第22天的骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征；圖像放大 100倍。
圖20、 von Kossa染色檢測(cè)定向誘導(dǎo)分化的骨細(xì)胞中骨小結(jié)的形成。圖 20A圖像放大100倍；圖20B圖像放大200倍。
圖21、免疫組化檢測(cè)誘導(dǎo)分化的骨細(xì)胞表達(dá)后期骨生成標(biāo)志物(ONC)。 圖21A圖象放大100倍；圖21B圖象放大200倍
上述附圖均為黑白圖片，為了更清楚地說明本發(fā)明方法得到的干細(xì)胞特 征，發(fā)明人同時(shí)提交圖1 圖8、圖10 圖14、圖16、圖17、圖19 圖21
的彩色圖片作為參考。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:來自人早期流產(chǎn)胎兒組織的全能干細(xì)胞的分離純化，培養(yǎng)增 殖和鑒定
1. 1材料和方法 1. 1-1.試劑
a-MEM培養(yǎng)基(a-MEM)，胎牛血清(FCS)和胰蛋白酶-EDTA( trypsin-EDTA) 溶液購自Invirogen (美國)。青/鏈霉素和二性酶素B， I型膠原酶和羊抗鼠 抗體-HRP復(fù)合物購自Sigma (美國)?？筄CT-4， SSEA-1， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60和TRA-1-81的單克隆抗體購自R&D System(美國)?？笰FP， Nestin 和SMA的單克隆抗體購自Sigma (美國)和Dako (丹麥)。反轉(zhuǎn)錄(RT)試 劑盒購自Promega(美國)；DNATaq酶試劑盒購自Qiogen (德國)。用于RT-PCR 的引物則由Invirogen合成。
1. 1-2.收集樣品和分離胎兒組織細(xì)胞
收集妊娠第一周期(>8周〈12周)通過人工流產(chǎn)手術(shù)獲得的胎兒-胎盤組 織。將組織收集于高壓滅菌后的器皿中，并立即送到細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室處理。 先將組織放置在100 X 15 mm的培養(yǎng)盤，用鑷子和外科手術(shù)剪從胎兒-胎盤組 織中仔細(xì)地尋找胎兒的臍帶或腸等組織。然后棄去其余組織。 將尋找到的胎兒臍帶或腸等組織用高壓滅菌的生理鹽水洗滌3次。再用外科 手術(shù)剪將洗滌過的組織剪碎并轉(zhuǎn)移至15 ml的離心管。用I型膠原酶(lmg/ml) 在37。C水浴鍋內(nèi)消化1小時(shí)。然后將樣品用離心機(jī)在4°C以800 rpm離心 15分鐘，棄去上清液，獲得細(xì)胞沉淀。再將細(xì)胞用高壓滅菌的生理鹽水洗滌兩次。
1. 1-3.細(xì)胞培養(yǎng)
將洗滌的胎兒組織細(xì)胞用干細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，并轉(zhuǎn)移至75 cm的細(xì)胞培 養(yǎng)瓶。50 ml的干細(xì)胞培養(yǎng)液由44 ml的a-MEM培養(yǎng)基，5 ml的胎牛血清，0. 5 ml的100X青/鏈霉素和0. 5 ml的100X 二性酶素B組成。 1. 1-4.細(xì)胞體外換代培養(yǎng)
將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于C02培養(yǎng)箱，在37°C和5%C02的條件下培養(yǎng)3-7天或 細(xì)胞增殖約占培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿庫面積的70%以上，視為一代。然后將細(xì)胞培 養(yǎng)液棄去，.用磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞兩次。再用0. 25。/。的胰蛋白酶-EDTA溶液將 生長時(shí)粘貼在培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞懸浮，并將這些懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管， 室溫下800 rpm離心分離。最后用干細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮，并將約10%的 細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個(gè)75 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。該過程至少重復(fù)5至7 次。
1. 1-5.干細(xì)胞未分化狀態(tài)的維持
維持這些干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)的方法包括使用上述的干細(xì)胞培養(yǎng)液， 或以bFGF (0.1pg/ml)代替上述干細(xì)胞培養(yǎng)液中的胎牛血清，在5%的C02 和37。C的條件下培養(yǎng)。
1.1-6.干細(xì)胞的凍存
在每次細(xì)胞培養(yǎng)換代的過程中，將室溫下800 rpm離心分離的細(xì)胞用干 細(xì)胞儲(chǔ)藏液(40%的胎牛血清，50%的01-MEM培養(yǎng)基和1(F。的DMS0)懸浮，轉(zhuǎn)移 至冷凍儲(chǔ)藏管并放置-70°C過夜，于第二天轉(zhuǎn)移至液氮罐長期保存。
1.卜7.干細(xì)胞的解凍和細(xì)胞活力的復(fù)蘇
將裝有干細(xì)胞的冷凍儲(chǔ)藏管從液氮罐取出，立即放置在37。C解凍；然后 離心分離，并用磷酸緩沖液洗滌一次。再將解凍的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，用干 細(xì)胞培養(yǎng)液在5%的C02和37°C的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。置換新鮮的培養(yǎng)液繼 續(xù)在5%的C02和37°C的條件下培養(yǎng)，并且每3-5天換新鮮培養(yǎng)液一次。
1. 1-8.免疫組織化學(xué)和細(xì)胞免疫化學(xué)
將尋找到的胎兒臍帶或腸組織一部分用10%福爾馬林固定。然后石臘包 埋，制備成4 p厚的切片。免疫組化分析時(shí)，對(duì)石蠟包埋的切片，按標(biāo)準(zhǔn) 操作進(jìn)行直接免疫過氧化物酶染色(Bullock Gr and Petrusz P. 1982)。首 先，組織內(nèi)源性過氧化物酶活性和非特異蛋白結(jié)合位點(diǎn)分別用1%過氧化氫處 理及含10%正常山羊血清的溶液封閉30分鐘。然后加入OCT-4， SSEA-1， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60和TRA-1-81單抗，于4°C保溫過夜。第二天， 用PBS洗滌切片后與1:2000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP復(fù)合物室溫下保溫1 小時(shí)。PBS洗片，用二氨基聯(lián)苯胺.(DAB)使結(jié)合抗體顯色5分鐘。特異性 質(zhì)控對(duì)照包括用PBS或正常小鼠IgG (Sigma公司產(chǎn)品)替換特異性抗體。
細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)按標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行直接免疫過氧化物酶染色.(Javois 1999)。首先將培養(yǎng)的胚胎體或細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)載片上，37°C， 5%0)2條 件下培養(yǎng)2-3天。然后將載片在-20。C丙酮中固定10分鐘。內(nèi)源性過氧化物
ii酶活性和非特異蛋白結(jié)合位點(diǎn)分別用1%過氧化氫處理及含10%正常山羊血清 的溶液封閉30分鐘。然后與OCT-4， SSEA-1， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60 和TRA-1-81單抗于4。C保溫過夜。第二天用PBS洗滌后，與1:2000稀釋的 羊抗小鼠IgG-HRP復(fù)合物室溫下保溫1小時(shí)。PBS洗片，用二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)使結(jié)合抗體顯色5分鐘。特異性質(zhì)控對(duì)照包括用PBS或正常小鼠IgG (Sigma公司產(chǎn)品)替換特異性抗體。 1. 1-9. RT-PCR
將培養(yǎng)的每一代部分細(xì)胞轉(zhuǎn)移儲(chǔ)藏在-70。C待用。檢測(cè)時(shí)，采用Trizon 試劑(Invirogen)提取樣品的總RNA。 cDNA的合成則采用Promega公司的反 轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒，按說明書進(jìn)行。OCT-4, Nanog和端粒酶的PCR引物分別 為OCT-4 ( gagcaaaacccggaggagt ( sense ) ， ttctctttcgggcctgcac (antisense ) 5310bp ) ;Nanog( gcttgccttgctttgaagca (sense ) , ttcttgactgggaccttgtc ( antisense ) ; 225 bp ) ; hTERT (cagctcccatttcatcagca (sense) ， cgacatccctgcgttcttg (antisense); 114 bp); (3-actin (cgcaccactggcattgtcat (sense), ttctccttgatgtcacgcac (antisense), 207 bp)(Beattie et al. 2005)。0CT-4的PCR的條件為94。C， 30 秒，55。C， l分鐘，72。C， l分鐘35個(gè)循環(huán);Nanog的PCR的條件為94°C， 30秒，57。C， l分鐘，72。C， l分鐘35個(gè)循環(huán);Telomease的PCR的條件為 94°C， 30秒，53°C， l分鐘，72°C， 1分鐘35個(gè)循環(huán)；P-actin的PCR的條 件為94。C， 30秒，54°C， l分鐘，72°C， 1分鐘35個(gè)循環(huán)；，PCR的產(chǎn)物則釆 用Golden染色的2°/。瓊脂檢測(cè)，并以卩-actin的RT-PCR產(chǎn)物作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。 1.2結(jié)果
1. 2-1.免疫組化確定胎兒組織中的類胚胎干細(xì)胞
圖1顯示用免疫組化方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)孕娠第一周期流產(chǎn)的胎兒腸組織中有 表達(dá)早期胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的干細(xì)胞。其中0CT-4， SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60 和TRA-1-81等標(biāo)志物均為陽性，而SSEA-1 (為鼠胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志物)則 為陰性。表達(dá)OCT-4， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60和TRA-1-81陽性的細(xì)胞位 于腸粘膜細(xì)胞的周圍。該發(fā)現(xiàn)證明在早期流產(chǎn)的胎兒腸組織中存在具有胚胎
干細(xì)胞特征的干細(xì)胞。圖像放大為ioo倍。
圖2顯示用免疫組化方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)孕娠第一周期流產(chǎn)的胎兒臍帶組織中 有表達(dá)早期胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的干細(xì)胞。其中OCT-4， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60和TRA-1-81等標(biāo)志物均為陽性，而SSEA-1 (為鼠胚胎干細(xì)胞的標(biāo) 志物)則為陰性。表達(dá)OCT-4， SSEA-3， SSEA-4， TRA-l-60和TRA-1-81陽性 的細(xì)胞主要位于臍帶膠質(zhì)。該發(fā)現(xiàn)證明在早期流產(chǎn)的胎兒臍帶組織中存在具 有胚胎干細(xì)胞特征的干細(xì)胞。圖像放大為IOO倍。1. 2-2.類胚胎干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征
圖3顯示從孕娠第一周期流產(chǎn)的胎兒臍帶或腸組織分離純化和培養(yǎng)后的
類胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)特征。這些細(xì)胞顯示出均勻的類似成纖維細(xì)胞的細(xì)
胞形態(tài)。圖3A為第3代細(xì)胞，而圖3B則為第12代細(xì)胞。圖3A和圖3B的圖 像放大均為100倍。
1.2-3.分離純化的干細(xì)胞能形成胚胎體
圖4顯示從孕娠第一周期流產(chǎn)的胎兒臍帶或腸組織分離純化和培養(yǎng)的干 細(xì)胞均具有形成胚胎體的能力。圖4A和B顯示在培養(yǎng)過程中自然形成的細(xì)胞 集群。圖4A圖像放大為40倍，圖4B則為200倍。圖4C和D顯示將培養(yǎng)的 細(xì)胞轉(zhuǎn)移至低粘附的培養(yǎng)皿，用胚胎體培養(yǎng)液培養(yǎng)形成的胚胎體。圖4C圖像 放大為40倍，圖4D則為100倍。
圖5顯示用免疫組化方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)用這些分離純化和培養(yǎng)干細(xì)胞所形成 的胚胎體能夠表達(dá)內(nèi)胚層(a-fetoprotein, ， AFP，甲胎蛋白，圖5C)，中胚 層(smooth muscle actin, SMA，平滑肌細(xì)胞特異性蛋白，圖5D)和外胚層 (Nestin，神經(jīng)元特異性烯醇化酶，圖5B)三個(gè)胚層細(xì)胞表達(dá)特異性標(biāo)志物。 圖5A則為陰性對(duì)照(在免疫組化檢測(cè)中未加抗AFP ， SMA或Nestin的特異 性抗體)。圖像放大為100倍。
1. 2-4.分離純化的類胚胎干細(xì)胞的生長特性
圖6顯示從孕娠第一周期流產(chǎn)的胎兒臍帶或腸組織分離純化和培養(yǎng)的干 細(xì)胞的生長曲線。在培養(yǎng)3天內(nèi)，四個(gè)不同個(gè)體分離純化的細(xì)胞數(shù)目平均增 長約100倍。
1. 2-5.對(duì)分離純化培養(yǎng)后的干細(xì)胞免疫組化的鑒定
圖7和圖8分別顯示細(xì)胞免疫組化檢測(cè)培養(yǎng)的第3和第12代干細(xì)胞表達(dá) 早期胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物。如腸組織和臍帶組織的免疫組化的結(jié)果一樣(圖1 和圖2)，其中OCT-4, SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60和TRA-1-81等標(biāo)志物均 為陽性，而SSEA-1則為陰性。表明這些干細(xì)胞在本發(fā)明的培養(yǎng)條件下一直 處于未分化狀態(tài)。圖像放大為IOO倍。
1. 2-6.對(duì)分離純化的干細(xì)胞分子生物學(xué)的鑒定
圖9顯示RT-PCR檢測(cè)培養(yǎng)的第3至第12代的干細(xì)胞持續(xù)地表達(dá)的早期 轉(zhuǎn)錄基因OCT-4， Nanog和端粒酶的mRNA。以|3-actin的RT-PCR產(chǎn)物作為內(nèi) 標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)顯示這些早期轉(zhuǎn)錄基因和端粒酶表達(dá)的量從第3至第12代相近， 表明這些干細(xì)胞在該發(fā)明的培養(yǎng)條件下一直處于未分化狀態(tài)。
1.3.結(jié)論
從孕娠第一周期流產(chǎn)組織中收集的臍帶或腸組織成功地分離純化出具有 胚胎干細(xì)胞特性的千細(xì)胞。該種干細(xì)胞(1)能夠在體外培養(yǎng)中形成胚胎體；
13(2)具有無限的增殖能力3天就有100個(gè)倍增，并且這種增殖能力傳代一
年半后仍然保持這種增殖能力；(3)免疫組織化學(xué)，細(xì)胞組織化學(xué)和分子生
物學(xué)檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞表達(dá)所有的人胚胎干細(xì)胞特有的細(xì)胞表面標(biāo)志物和
表達(dá)維持胚胎干細(xì)胞增殖能力和全能性的早期轉(zhuǎn)錄基因0ct4， Nanog和端粒 酶。表明這些干細(xì)胞可能具有類似全能干細(xì)胞潛力。
實(shí)施例2:干細(xì)胞的體外分化----胰島卩-細(xì)胞 2. 1材料和方法
2. l-l.試劑:從Invitrogen公司購置磷酸緩沖液(PBS); oc-minimal essential medium (ot-MEM); Dulbecco modified Eagle， s medium (DMEM); F12培養(yǎng)基，胎牛血清(FCS); knockout血清；青/鏈霉素；二性霉素B; L-glutamin; 0. 25% Trypsin-EDTA; B27-s叩plement， bFGF。從Sigma公司 貝勾置 insulin, transferrin, selenium chloride, fibronectin 禾口 putrescine?？笽nsulin和Nestin抗特異性抗體購自Dako (丹麥)。Insulin 酶聯(lián)免疫試劑盒購自Abbott (美國)。
2-1-2.方法胰島p-細(xì)胞的定向分化的方法主要參考Lumelsky等人發(fā) 表的文獻(xiàn)(Lumeksky et al. 2006)。該方法將體外分化過程分為五個(gè)階段。 在階段I，將未分化的干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增。在第n階段，讓擴(kuò)增的干細(xì)胞形成 胚胎體。在第III階段將胚胎體定向分化成類似胰島的細(xì)胞團(tuán)。第IV和第V
階段將胰島細(xì)胞團(tuán)進(jìn)一步分化成具有功能的p-細(xì)胞。詳述如下
2. 1-2-l.將凍存的干細(xì)胞從液氮罐取出，37。C迅速解凍；在室溫下離心 800轉(zhuǎn)10分鐘，棄去上清液；再將細(xì)胞沉淀用1 ml的PBS懸浮，轉(zhuǎn)移至15-ml 的無菌離心管，加入9 ml的PBS在室溫下離心800轉(zhuǎn)10分鐘洗滌一次。
2-1-2-2.棄去上清液；將細(xì)胞沉淀用lml的千細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，轉(zhuǎn)移至 75-cm2培養(yǎng)瓶在細(xì)胞培養(yǎng)箱中5%C02， 37。C條件下培養(yǎng)。
2-1-2-3. 4-5天培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖覆蓋70-90%的培養(yǎng)瓶底面。將培養(yǎng)液 棄去；用10-20 ml的PBS將細(xì)胞洗滌兩次。然后加入5 ml的0.25% Trypsin-EDTA， 37°C下孵化5分鐘。
2. 1-2-4.將懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15-ml的無菌離心管，在室溫下離心800 轉(zhuǎn)10分鐘分離；并用10 ml的PBS離心洗滌一次。
2.1-2-5.將洗滌的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至低粘附的6-孔培養(yǎng)皿，用胚胎體培養(yǎng)液 (80%的knockout dMEM， 20%胎牛血清，1 mM的L-glutamine， 0. 1M的 f3-mercaptoethano1和1%非必須氨基酸)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中5%C02， 37°C條件 下培養(yǎng)6-7天；培養(yǎng)第二天這些干細(xì)胞既形成胚胎體。每3天換液一次。
2. 1-2-6.將胚胎體轉(zhuǎn)移至10-cm2的培養(yǎng)皿，用1: 1 DMEM/F12培養(yǎng)液加insulin (10mg/L) -Transferrin (6. 7ng/L) -Selenium (5.5mg/L) (ITS) 和1 mM的L-glutamine及5 |ig/L的Fivronectin培養(yǎng)7天。
2. 1-2-7.將細(xì)胞用0. 25% Trypsin-EDTA懸浮并轉(zhuǎn)移至10-cm2培養(yǎng)皿， 用1: 1 dMEM/F12培養(yǎng)液加N2補(bǔ)充液(500 |ag/ml的Insulin, 10 mg/ml的 Transferrin, 0. 63 pg/ml的孕酮，1611 |iig/ml的Putrascine和0. 52 pg/ml 的Selenium)以及B27培養(yǎng)液，1 mM的L-glutamine及10 ng/ml的bFGF 形成類胰島細(xì)胞團(tuán)。培養(yǎng)6-7天，每3天換液一次。
2. 1-2-8.第6-7天，將bFGF換成10 mM的Nicotimide，并在低糖條件 下培養(yǎng)4天。將胰島細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板用上述培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4天。
2. 1-2-9.將培養(yǎng)液換成不含血清的高糖或低糖培養(yǎng)液，觀察分化的胰島 p-細(xì)胞對(duì)葡萄糖濃度變化產(chǎn)生的insulin分泌。
2. 1-2-10.用倒置光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。
2. 1-2-ll.在分化第V階段，采用特異性抗Insulin和Nestin抗體按 1. 1-8所描述的細(xì)胞免疫組化方法鑒定分化的胰島(3-細(xì)胞。
2. 1-2-12.收集2. 1-2-9的培養(yǎng)液，采用Insulin酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒按 試劑盒的說明書檢測(cè)培養(yǎng)液中的Insulin濃度。
2.2結(jié)果
圖10顯示從這些干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成胰島細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)學(xué)特征。圖 10A和圖10B為誘導(dǎo)過程中的第III階段的胰島細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)學(xué)特征；圖10A 圖像放大100倍，圖10B圖像放大400倍。圖IOC和圖10D為誘導(dǎo)過程中的 第IV階段的胰島細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)學(xué)特征；圖10C圖像放大100倍，圖10D圖像 放大400倍。
圖11顯示用免疫組化檢測(cè)分化的胰島細(xì)胞團(tuán)表達(dá)f3-細(xì)胞的特異性標(biāo)志 物。圖IIA為Insulin,圖llB為Nestin。圖像放大200倍。
圖12顯示定向誘導(dǎo)分化的胰島p-細(xì)胞團(tuán)對(duì)高濃度的葡萄糖能分泌較高 濃度的胰島素。比較低濃度的葡萄糖培養(yǎng)液有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)。 說明這些分化的胰島P-細(xì)胞具有調(diào)節(jié)糖代謝的功能。
2. 3結(jié)論
從孕娠第一周期流產(chǎn)組織中收集的臍帶或腸組織分離純化出的具有胚胎
干細(xì)胞特性的干細(xì)胞能夠在體外培養(yǎng)中定向誘導(dǎo)分化為具有調(diào)節(jié)糖代謝的功 能的胰島(3-細(xì)胞。
實(shí)施例3:干細(xì)胞的體外分化--一心肌細(xì)胞
3. 1材料和方法
3.1-1試劑從Invitrogin公司購置磷酸緩沖液(PBS); a-minimalessential medium (a-MEM); Dulbecco modified Eagle， s medium (DMEM); 胎牛血清(FCS); knockout血清；青/鏈霉素；二性霉素B; L-glutamin; 0. 25% Trypsin-EDTA; (3-mercaptoethanol;非必須氨基酸；抗卩-肌球蛋白重鏈 (P-myosin heavy chain, MHC)抗體禾口抗肌拷蛋白I (cardiac troponin I ， cTnl)抗體購自Chemicon (美國)；RT-PCR的引物a-肌凝蛋白重鏈 (myosin light chain ventricular, oc-MHC) (ggggacagtggtaaaagcaa (sense ) ， tccctgcgttccactatctt ( antisense ) ; 512bp ) ， Nkx2. 5 (ggtggagctggagaagacaga (sense), cgacgccgaagttcacgaagt (smtisense) 536bp) (Passier et al. 2005)。心鈉素(Atrial natriuretic factor, ANF ) (gaaccagaggggagagacagag(senseX ccctcagcttgctttttaggag(antisense)， 406bp)和心肌肌凝蛋白輕鏈2v (myosin light chain 2v， MLC2v) (first round : gcgccaactccaacgtgttct ( sense ) ; gtgatgatgtgcaccaggttc
(antisense ) ; nested PCR : aggaggccttcactatcatgg ( sense ); gtgatgatgtgcaccaggttc (antisense); 444 bp) (Mummery et al. 2003)。 a-MHC的PCR的條件為94°C， 1分鐘，55°C， 1分鐘，72°C， 1分鐘35個(gè)循 環(huán)；Nkx2. 5的PCR的條件為94。C， 1分鐘，57°C， 1分鐘，72°C， 1分鐘35 個(gè)循環(huán)；ANF的PCR的條件為94°C， 1分鐘，53°C， 1分鐘，72°C， 1分鐘35 個(gè)循環(huán)；MLC2v的第一次PCR的條件為94°C， 1分鐘，62°C， 1分鐘，72°C， 1 分鐘35個(gè)循環(huán)；巢式PCR的條件為94°C， 1分鐘，62°C， 1分鐘，72°C， 1 分鐘35個(gè)循環(huán)；(3-actin的PCR的條件為94。C， 30秒，60。C， 1分鐘，72°C， 1分鐘35個(gè)循環(huán)；PCR的產(chǎn)物則采用GOLDEN染色的2%瓊脂檢測(cè)，并以p-actin 的RT-PCR產(chǎn)物作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。
3. 1-2方法心肌細(xì)胞的定向分化的方法主要參考He JQ等人發(fā)表的文 獻(xiàn)(He JQ et al. 2003)。
3. 1-2-l.將凍存的干細(xì)胞從液氮罐取出，37。C迅速解凍；在室溫下離心 800轉(zhuǎn)10分鐘，棄去上清液；再將細(xì)胞沉淀用1 ml的PBS懸浮，轉(zhuǎn)移至15-ml 的無菌離心管，加入9 ml的PBS在室溫下離心800轉(zhuǎn)10分鐘洗滌一次。
3. 1-2-2.棄去上清液；將細(xì)胞沉淀用1 ml的干細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，轉(zhuǎn)移至 75-cm2培養(yǎng)瓶在細(xì)胞培養(yǎng)箱中5%C02， 37。C條件下培養(yǎng)。
3.1-2-3. 4-5天培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖覆蓋70-90%的培養(yǎng)瓶底面。將培養(yǎng)液 棄去；用10-20 ml的PBS將細(xì)胞洗滌兩次。然后加入5 ml的0.25% Trypsin-EDTA， 37。C孵化5分鐘。
3. 1-2-4.將懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15-ml的無菌離心管，在室溫下離心800 轉(zhuǎn)10分鐘分離；并用10 ml的PBS離心洗滌一次。
3.1-2-5.將洗滌的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6-孔培養(yǎng)皿，用胚胎體培養(yǎng)液(Dulbecco， s modified Eagle， s培養(yǎng)基力口 20%的knockout血清，1 mM 的L-glutamine， 0. 1M的(3-mercaptoethanol和非必須氨基酸)在細(xì)胞培 養(yǎng)箱中5%0)2， 37。C條件下培養(yǎng)形成胚胎體。
3. 1-2-6.培養(yǎng)4-6天后，胚胎體的大小可達(dá)300-2000 pm。然后將胚胎 體轉(zhuǎn)移至10-cm2培養(yǎng)皿，用分化培養(yǎng)液(DMEM加15%的FCS，2 mM L-glutamine和1%的非必須氨基酸)培養(yǎng)，每天換液一次。 3. 1-2-7.用倒置光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)的變化。
3. 1-2-8.免疫組化鑒定采用P-MHC和cTnl抗體按1.卜8所描述的細(xì)胞 免疫組化方法鑒定分化的心肌細(xì)胞。P-MHC為心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)和收縮 蛋白的成分，而cTnl則為心肌的特異性蛋白， 一種心肌細(xì)胞的特異性標(biāo)志 物(Aubin JE. 1998)。
3. 1-2. 9. RT-PCR檢測(cè)a-MHC ， Nkx2. 5， ANF和MLC2v的mRNA的表達(dá).。 Nkx2. 5是一同源盒區(qū)塊的轉(zhuǎn)錄因子，在早期心臟發(fā)育起著重要的作用。ANF 由心肌細(xì)胞分泌一種調(diào)節(jié)電介質(zhì)平衡的蛋白，為心肌細(xì)胞的早期標(biāo)志物。 a-MHC是在心肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)和收縮的成分。在成人心肌細(xì)胞表達(dá)。MLC2v 僅在有收縮的心肌細(xì)胞表達(dá)(Segev et al. 2005)。
3. 3結(jié)果
圖13顯示從這些干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。圖13A 圖像放大100倍；圖13B圖象放大200倍。
圖14顯示免疫組化檢測(cè)定向誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞表達(dá)特異性標(biāo)志物。圖 14A為p-MCH，圖14B為cTnl。圖像放大200倍。
圖15顯示RT-PCR檢測(cè)定向誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞表達(dá)特異性標(biāo)志物的 m隱o
3.4結(jié)論
從孕娠第一周期流產(chǎn)組織中收集的臍帶或腸組織分離純化出的具有胚胎 干細(xì)胞特性的干細(xì)胞能夠在體外培養(yǎng)中定向誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞。
實(shí)施例4:干細(xì)胞的體外分化----神經(jīng)細(xì)胞
4. 1材料和方法
4. 1-l.試劑從Invitrogen公司購置磷酸緩沖液(PBS); a-minimal essential medium (a-MEM); Dulbecco modified Eagle， s medium (DMEM); F12培養(yǎng)基，胎牛血清(FCS); knockout血清；青/鏈霉素；二性霉素B; L-glutamin; 0. 25% Trypsin—EDTA; B27-supplement, bFGF。從SIGMA公司 購置 insulin, "transferrin, selenium chloride, fibronectin， putrescine?？股窠?jīng)元微管木目關(guān)蛋白一2 (mcrotubul—associated ptotein—2,MAP-2)抗體，抗髓鞘堿性蛋白(Myelin basic protein, MPB)抗體，抗Nestin 抗體和抗p微管蛋白，p-tubulin)抗體購自Sigma (美國)。RT-PCR的引物 Bfl: (actcaaaactcgctgggcaac (sense) , cgtgggggaaaaagtaactgg, 226 bp) ■(Yan et al. 2005); Noggin: (taatggatccatggagcgctgccccagcctag(sense)， gcagaagcttctagcacgagcacttgcactcg (antisense) ， 771 bp); 神經(jīng)絲蛋白 (Neurofilament ， . NF):gagtgaaatggcacgataccta( sense ) ， ttcctctccttcttcaccttc (antisense) ， 473 bp) (Kim et al. 2005)。 Bfl 的PCR的條件為94°C， 30秒，57。C， 1分鐘，72°C， 1分鐘35個(gè)循環(huán);Noggin 的PCR的條件為94。C， l分鐘，57°C， l分鐘，72°C， 2分鐘35個(gè)循環(huán);NF 的PCR的條件為94°C， l分鐘，55°C， l分鐘，72°C， l分鐘35個(gè)循環(huán)。 4. 1-2.方法
4. 1-2-l.將凍存的干細(xì)胞從液氮罐取出，37。C迅速解凍；在室溫下離心 800轉(zhuǎn)10分鐘，棄去上清液；再將細(xì)胞沉淀用1 ml的PBS懸浮，轉(zhuǎn)移至15-ml 的無菌離心管，加入9 ml的PBS在室溫下離心800轉(zhuǎn)10分鐘洗滌一次。
4. 1-2-2.棄去上清液；將細(xì)胞沉淀用1 ml的干細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，轉(zhuǎn)移至 75-cm2培養(yǎng)瓶在細(xì)胞培養(yǎng)箱中5%C02， 37。C條件下培養(yǎng)。
4.1-2-3. 4-5天培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖覆蓋70_90%的培養(yǎng)瓶底面。將培養(yǎng)液 棄去；用10-20 ml的PBS將細(xì)胞洗滌兩次。然后加入5 ml的0.25% Trypsin-EDTA， 37。C孵化5分鐘。
4. 1-2-4.將懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15-ml的無菌離心管，在室溫下離心800 轉(zhuǎn)10分鐘分離；并用10 ml的PBS離心洗滌一次。
4.1-2-5.將洗滌的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6-孔培養(yǎng)皿，用胚胎體培養(yǎng)液 (Dulbecco， s modified Eagle， s培養(yǎng)基力口 20%的knockout血清，1 mM 的L-glutamine， 0. 1M的j3-mercaptoethanol和非必須氨基酸)在細(xì)胞培 養(yǎng)箱中59&C02, 37。C條件下培養(yǎng)形成胚胎體。
4. 1-2-6.將胚胎體轉(zhuǎn)移至10 cm2培養(yǎng)皿，在DMEM-10%FCS培養(yǎng)液中讓 胚胎體展開。
4. 1-2-7.第二天將培養(yǎng)液換成含有ITSFn (insulin 5 |ig/ml ， transferring 50|ig/ml， selenium chloride 30 nM， fibronectin 5|ig/ml) 的DMEM/F12 (1: 1)培養(yǎng)液，培養(yǎng)6-8天；每兩天換一次液。以選擇Nestin 陽性細(xì)胞。
4. 1-2-8.將細(xì)胞用0. 259&Trypsin-EDTA懸浮，洗滌；然后轉(zhuǎn)移至另一個(gè) 10 cm2培養(yǎng)皿，用含有N2的DMEM/F12培養(yǎng)液和bFGF以增殖Nestin陽性細(xì) 胞。
4. 1-2-9.用倒置光學(xué)顯微鏡觀察分化成神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。4. 1-2-10.采用特異性抗MAP-2， MPB， Nestin和]3-tubulin抗體按 1. 1-8所描述的細(xì)胞免疫組化方法鑒定分化的神經(jīng)細(xì)胞(Aubin JE. 1998)。 MAP-2是樹狀突神經(jīng)細(xì)胞特異性神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白；MPB是由分化完全的少 突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocytes)表達(dá)的髓鞘堿性蛋白；Nestin是神經(jīng)組細(xì) 胞表達(dá)的中間絲蛋白(Intermediate filament structural protein); 卩-tubulin為神經(jīng)元重要的結(jié)構(gòu)蛋白，是神經(jīng)元分化的標(biāo)志物。
4.1-2-11. RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)，鑒定分化的神經(jīng)細(xì)胞。Noggin是在神 經(jīng)元發(fā)育過程中表達(dá)的神經(jīng)細(xì)胞特異基因。NF是神經(jīng)細(xì)胞重要的結(jié)構(gòu)蛋白， 用以鑒定已經(jīng)分化的神經(jīng)細(xì)胞.Bfl是前腦細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子.
4. 3結(jié)果
圖16顯示從這些干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。圖16A 圖像放大100倍，圖16B圖像放大400倍.。
圖17顯示免疫組化檢測(cè)從這些干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化神經(jīng)細(xì)胞的特異性 標(biāo)志物(Nestin (A) ， (3-Tubulin (B)， MAP-2 (C)和MPB (D))，圖像放 大200倍。
圖18顯示RT-PCR檢測(cè)分化成神經(jīng)細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化神經(jīng)細(xì)胞時(shí)(12天， 24天和36天)的特異性標(biāo)志物的mRNA。
4. 4結(jié)論
從孕娠第一周期流產(chǎn)組織中收集的臍帶或腸組織分離純化出的具有胚胎 干細(xì)胞特性的干細(xì)胞能夠在體外培養(yǎng)中定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞。
實(shí)施例5:干細(xì)胞的體外培養(yǎng)分化一--骨細(xì)胞
5. 1材料和方法
5. 1-l.試劑:從Invitrogen公司購置磷酸緩沖液(PBS); a-minimal essential medium (a-MEM); Dulbecco modified Eagle， s medium (DMEM); 胎牛血清(FCS); 0. 25%Trypsin-EDTA;青/鏈霉素;二性霉素B; knockout 血清；L-glutamin;非必須氨基酸禾口(3-me:rcaptoe1:hanol; 從Sigma公司 購置L-asorbic acid (AA); dexamethasome (DEX) ; hexamethyldisilazane (HMDS) 禾口 sodium-p-glycerophosphate ((3gp); vonKossa染色試劑盒 購自Polysciences Inc (美國),抗骨鈣素(osteocacin， 0CN)單克隆抗 體購自腿D System (美國)。
5. 1-2.方法骨組織的定向分化的方法主要參考Karp JM等人發(fā)表的文 獻(xiàn)(Karp et al. 2006)。
5. 1-2-l.將凍存的干細(xì)胞從液氮罐取出，37。C迅速解凍；在室溫下離心 800轉(zhuǎn)，10分鐘，棄去上清液；再將細(xì)胞沉淀用1 ml的PBS懸浮，轉(zhuǎn)移至15-ml的無菌離心管，加入9 ml的PBS在室溫下離心洗滌一次(S00轉(zhuǎn)，10 分鐘)。
5. 1-2-2.棄去上清液；將細(xì)胞沉淀用lml的千細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，轉(zhuǎn)移至 75-cm2培養(yǎng)瓶在細(xì)胞培養(yǎng)箱中5%C02， 37。C條件下培養(yǎng)。
5. l-2-3.4-5天培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖覆蓋70-90%的培養(yǎng)瓶底面。將培養(yǎng)液 棄去；用10-20 ml的PBS將細(xì)胞洗滌兩次。然后加入5 ml的0.25% Trypsin-EDTA， 37。C孵化5分鐘。
5. 1-2-4.將懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15-ml的無菌離心管，在室溫下離心800 轉(zhuǎn)10分鐘分離；并用10 ml的PBS離心洗滌一次。
5.1-2-5.將洗滌的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至低粘附的6-孔培養(yǎng)皿，用胚胎體培養(yǎng)液 (DMEM培養(yǎng)基加20%的knockout血清，1 mM的L-glutamine， 0. 1M的 P-mercaptoethanol和1%的非必須氨基酸)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中5%C02， 37°C條
件下培養(yǎng)形成胚胎體。
5. 1-2-6.培養(yǎng)4-6天后，胚胎體的大小可達(dá)300-2000 )am。然后將胚胎 體轉(zhuǎn)移至10-cm2培養(yǎng)皿，用分化培養(yǎng)液(oc-MEM加10%的FCS， 10-8M的DEX， 50嗎/ml的AA和5 mM的pgp)培養(yǎng)，每2 - 3天換液一次。
5. 1-2-7.用倒置光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)的變化分化的組織中有無礦物 化區(qū)域。
5. 1-2-8.組織學(xué)鑒定采用von Kossa染色確定骨小結(jié)的形成(Purpura KA et al. 2004)。
5-1-2-9.免疫組化鑒定采用0CN特異性抗體按1. 1-8所描述的細(xì)胞免 疫組化方法鑒定確定骨組織的形成(Aubin JE. 1998)。
5.2結(jié)果
在加入分化培養(yǎng)液培養(yǎng)的第14天左右，用倒置光學(xué)顯微鏡觀察大約90% 以上的胚胎體分化形成骨細(xì)胞。圖19顯示從這些干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成骨細(xì) 胞的形態(tài)學(xué)特征。圖19A和B為在培養(yǎng)第14天的骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，圖 19A圖像放大400倍；圖19B放大100倍。圖19C和D為在培養(yǎng)第22天的骨 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征；圖像放大100倍。顯微鏡下可見分化的組織中有礦物化 區(qū)域。分化第22天的骨組織比分化第14天的較大，礦物化區(qū)域也較明顯。
采用von kassa染色顯示定向誘導(dǎo)分化第22天的骨細(xì)胞有骨小結(jié)的形成 (圖20，圖20A圖像放大100倍；圖20B圖像放大200倍)。圖21則顯示免 疫組化檢測(cè)定向誘導(dǎo)分化第22天的骨細(xì)胞有OCN的表達(dá)。0CN是骨生成的后 期標(biāo)志物；與骨細(xì)胞的礦物化一致。圖21A圖象放大100倍；圖21B圖象放 大200倍。
5.3結(jié)論.從孕娠第一周期流產(chǎn)組織中收集的臍帶或腸組織分離純化出的具有胚胎 干細(xì)胞特性的干細(xì)胞能夠在體外培養(yǎng)中定向誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞。
實(shí)施例6全能干細(xì)胞庫的建立 ，
1、 對(duì)要建庫收集的妊娠第一周期流產(chǎn)的胎兒-胎盤組織樣品進(jìn)行各種傳
染性疾病包括HIV， HBC， HCV， HTLV等按常規(guī)方法進(jìn)行檢測(cè)；
2、 按照實(shí)施例1的方法從不同的胎兒一胎盤組織中分離純化干細(xì)胞；
3、 對(duì)分離純化的干細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行染色體檢測(cè)；
4、 采用MTT的方法對(duì)分離純化的干細(xì)胞株活性進(jìn)行檢測(cè)；
5、 采用PCR的方法對(duì)各干細(xì)胞株的組織相容性抗原類型進(jìn)行分類鑒定；
6、 用上述分類鑒定數(shù)據(jù)建立凍存干細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫；
7、 按照實(shí)施例1的方法凍存分離純化的干細(xì)胞株。
本發(fā)明的方法可以比較方便地從妊娠一期人工流產(chǎn)的胎兒組織中成功地 分離純化出全能干細(xì)胞并且穩(wěn)定保持全能干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，進(jìn)而建立了 全能干細(xì)胞庫，為干細(xì)胞移植治療各種人體組織器官缺損和功能障礙的疾病， 如帕金森氏病、糖尿病、外傷性脊髓損傷、細(xì)胞變性病、燒傷、心肌病和骨 損傷等提供了一種新途徑。
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權(quán)利要求
1、一種分離純化來自人早期流產(chǎn)胎兒組織的全能干細(xì)胞的方法，包括a、收集妊娠第一周期流產(chǎn)的胎兒-胎盤組織樣品；b、從步驟a的樣品中分離獲得胎兒臍帶或腸組織；c、從步驟b的胎兒臍帶或腸組織中得到胎兒臍帶或腸組織細(xì)胞；d、從步驟c得到的胎兒臍帶或腸組織細(xì)胞中分離純化表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物OCT-4，SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60和TRA-1-81的干細(xì)胞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括e、凍存步驟d得到的純化干 細(xì)胞；f、復(fù)蘇凍存的純化干細(xì)胞。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟a所述的妊娠第一周期 流產(chǎn)胎兒組織為妊娠8周至12周人工流產(chǎn)或自然流產(chǎn)的胎兒一胎盤組織。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟c中，先將胎兒臍帶或 腸組織用滅菌的生理鹽水洗滌，再剪成小塊，用膠原酶消化至細(xì)胞成分離狀 態(tài)后，離心獲得細(xì)胞沉淀，用生理鹽水洗滌備用。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟d中，先用免疫磁珠分 離技術(shù)將表達(dá)OCT-4， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60和/或TRA-1-81的干細(xì)胞 純化，再將洗脫的干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，得到純化的干細(xì)胞。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟d中，將步驟c得到的 胎兒臍帶或腸組織細(xì)胞用干細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)傳代，培養(yǎng)條件為， 在37°C和5%0)2的條件下培養(yǎng)3-7天或細(xì)胞增殖約占培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底面積 的70%以上，轉(zhuǎn)移傳代至少5次，得到純化的干細(xì)胞。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是所述的干細(xì)胞培養(yǎng)液由體積 百分含量88X的a-MEM培養(yǎng)基，10%的胎牛血清或0. l|ug/ml的bFGF， 1%的 100X青/鏈霉素，1X的100X 二性酶素B組成。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是轉(zhuǎn)移傳代時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)液 棄去，用磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞；再用胰蛋白酶-EDTA溶液將生長時(shí)粘貼在培 養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞懸浮，室溫下離心分離得到細(xì)胞；用干細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞懸 浮，并將約1096的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
9、 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征是所述的純化干細(xì)胞能夠 形成胚胎體。
10、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是凍存干細(xì)胞時(shí)，先用干細(xì) 胞儲(chǔ)藏液懸浮傳代過程中離心分離的細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移至冷凍儲(chǔ)藏管并放置 _70°C過夜，再轉(zhuǎn)移至液氮罐長期保存；所述干細(xì)胞儲(chǔ)藏液由體積百分含量 4Qo/o的胎牛血清，509&的a-MEM培養(yǎng)基和10°/。的DMSO組成。
11、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是復(fù)蘇干細(xì)胞時(shí)，將裝有干 細(xì)胞的冷凍儲(chǔ)藏管從液氮罐取出，放置在37。C解凍；然后離心分離，并用磷酸緩沖液洗滌，再將解凍的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，用干細(xì)胞培養(yǎng)液在5%的C02 和37°C的條件下培養(yǎng)24小時(shí)，置換新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)在5%的C02和37°C的 條件下培養(yǎng)，并且每3-5天換新鮮培養(yǎng)液一次。
12、 一種來自人早期流產(chǎn)胎兒組織的全能干細(xì)胞，是由權(quán)利要求l所述 的方法分離純化得到的。
13、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的干細(xì)胞，其表達(dá)的胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物為 OCT-4， SSEA-3， SSEA-4， TRA-1-60和TRA-1-81。 、
14、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的干細(xì)胞，其表達(dá)一種或多種胚胎干細(xì)胞特異 性轉(zhuǎn)錄因子。
15、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的干細(xì)胞，其表達(dá)的胚胎干細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因 子為0CT-4， Nanog或Telemerase。
16、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的干細(xì)胞，其能夠形成胚胎體。
17、 權(quán)利要求12所述的干細(xì)胞，其誘導(dǎo)分化為胰島P —細(xì)胞、心肌細(xì)胞、 神經(jīng)細(xì)胞、骨細(xì)胞的用途。
18、 一種建立全能干細(xì)胞庫的方法，包括a、 對(duì)收集的早期流產(chǎn)的胎兒一胎盤組織樣品做必要的傳染病學(xué)檢查；b、 按照權(quán)利要求1所述的方法從不同的胎兒一胎盤組織中分離純化干細(xì)胞；c、 對(duì)步驟b得到的干細(xì)胞株的組織相容性抗原進(jìn)行分類鑒定；d、 根據(jù)步驟c的分類鑒定結(jié)果建立干細(xì)胞株目錄；e、 將步驟b得到的干細(xì)胞株按權(quán)利要求10所述的方法冷凍儲(chǔ)藏。
19、 一種由權(quán)利要求18的方法建立的全能干細(xì)胞庫。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離純化來自人早期流產(chǎn)胎兒組織的多能干細(xì)胞的方法，包括a.收集妊娠第一周期流產(chǎn)的胎兒-胎盤組織樣品；b.從步驟a的樣品中分離獲得胎兒臍帶或腸組織；c.從步驟b的胎兒臍帶或腸組織中得到胎兒臍帶或腸組織細(xì)胞；d.從步驟c得到的胎兒臍帶或腸組織細(xì)胞中分離純化表達(dá)OCT-4，Nanog，SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60和TRA-1-81等胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物，并能夠形成胚胎體的干細(xì)胞。本發(fā)明方法獲得的干細(xì)胞一直處于未分化狀態(tài)。同時(shí)，本發(fā)明還公開了將這些干細(xì)胞分化成不同人體細(xì)胞，如心肌，神經(jīng)，胰島β-細(xì)胞或骨細(xì)胞的應(yīng)用。該方法避免了從胚胎獲取全能干細(xì)胞所面臨的干細(xì)胞倫理學(xué)之爭，并且能夠獲取比從胚泡更多的干細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101538553SQ20091005829
公開日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2009年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月6日
發(fā)明者葉尚勉 申請(qǐng)人:葉尚勉