專利名稱：一種制備肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶的方法
技術領域：
本發明涉及利用重組DNA技術生產蛋白質或多肽藥物領域，更具體的，本發明 涉及大腸桿菌表達生產并純化肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶的方法。
背景技術：
肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是一種人類常見的和重要的病原體之
一。肺炎鏈球菌可引起肺炎、敗血癥、腦膜炎、中耳炎、鼻炎等疾病。在耐藥性菌株日 益加劇和疫苗療效不甚理想的情況下，肺炎鏈球菌造成了高發病率和死亡率，尤其是嬰 幼兒，老年人和免疫功能低下患者。噬菌體是一類專門侵染原核細胞的病毒，于1917年被發現。噬菌體寄生于細菌 中，并在細菌中復制。在感染細菌的后期，噬菌體表達出細胞壁裂解酶，從而釋放出子 代噬菌體，用于感染其它細菌。當這種裂解酶在細胞外部結合到細菌細胞壁時也能裂解 細菌細胞壁上的肽聚糖，從而使細菌裂解死亡。噬菌體裂解酶在體外能高效、專一地殺 死細菌，對感染細菌的模型動物有很好的治療作用。噬菌體編碼的裂解酶主要有三種類型，分別為溶菌酶(肽聚糖上氨基糖之間的 糖苷鍵)、酰胺酶(水解細菌細胞壁肽聚糖上糖與氨基酸間的酰胺鍵)和內肽酶(肽聚糖 上肽交聯橋)。研究表明所有的噬菌體裂解酶在結構上具有相似性，即含有2個結構域 比較保守的N端催化區和差異較大的C端特異性結合區。裂解酶的高親和性與種屬特異 的細胞壁糖基有關，而后者常常是細菌存活的必要成分，因而細菌難以產生對裂解酶的 抗性。噬菌體裂解酶具有較高的特異性，僅攻擊特定細菌，因此該酶不影響無害或有益 的人體寄生菌，也不影響其他細胞。所以，裂解酶作為新型抗菌藥物具有一定的優勢。CPL-I是肺炎鏈球菌的噬菌體CP-I表達的裂解酶，于1987年由Jose L.Garcia和 Ernesto Garcia 首次在肺炎球菌噬菌體 CP-I 中克隆到(Jose L.Garcia，Ernesto Garcia, Ana Arraras, et al.Cloning, Purification, and Biochemical Characterization of the Pneumococcal Bacteriophage Cp-I Ly sin [J], Journal of Virology, 1987，61: 2573-2580.)，該酶由 339 個 氨基酸組成，其分子量為39KD，等電點4.62，含一對二硫鍵。CPL-I屬于糖基水解 酶GH25家族，能特異性的裂解肺炎鏈球菌細胞壁肽聚糖的β 1-4糖苷鍵。體外殺菌和 感染細菌的動物模型方面的實驗證明其對肺炎球菌具有很強的抗菌活性(J.M.Entenza， J.M.Loeffler, D.Grandgirard, et al.Therapeutic Effects of Bacteriophage CPL-I Lysin against Streptococcus pneumoniae Endocarditis in Rats [J] .Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2005，49: 4789-4792)，基于其高效、專一的抗菌活性以及肺炎球菌耐藥性的日趨嚴 重，將其開發成新型的抗菌藥物具有很好的應用前景，利用基因工程技術低成本、大規 模制備噬菌體裂解酶也具有重要意義。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是提供了一種大腸桿菌高效表達并純化重組CPL-I的方法。本發明的發明構思是這樣的1987年Jose L.Garcia等克隆表達的CPL-I方法是將肺炎球菌噬菌體CP-1中的 CPL-I基因和CPL-I的啟動子一起克隆至大腸桿菌，但是表達效率并不高，因為原始 CPL-I基因中有大約5%的大腸桿菌稀有密碼子，會直接影響到CPL-I在大腸桿菌中的表 達。本發明通過對編碼CPL-I的原始基因序列進行分析，發現其中有54個氨基酸 (占總體的15.8% )的編碼子在大腸桿菌中使用頻率非常低，會嚴重影響該基因序列在大 腸桿菌中的表達。因此本發明根據CPL-I的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子，人 工設計合成了編碼CPL-I的基因序列SEQ.ID.NO 1。本發明的技術方案是這樣的本發明提供了一種大腸桿菌表達肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶CPL-I的方法，包括 如下步驟(1)表達載體的構建將編碼肺炎球菌噬菌體裂解酶CPL-I氨基酸序列的基因 序列與啟動子相連；(2)轉化大腸桿菌，使其含有步驟(1)所構建的載體，培養發酵；(3)從發酵液中分離純化肺炎球菌噬菌體裂解酶CPL-1。其中步驟(2)中噬菌體裂解酶CPL-I的表達為誘導表達。所述及的載體是大腸桿菌表達用載體，是pET28a。啟動子是T7啟動子。步驟(3)采用的分離純化重組CPL-I的方法為膽堿類似物DEAE-Sepharose親和
層析純化。具體步驟是，首先根據CPL-I氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子，人工設 計合成編碼CPL-I的基因序列，該基因編碼序列全長1027bp。其5’端加上了 Nco I限 制性核酸內切酶位點的基因序列，以及3’端加上了 HindIII限制性核酸內切酶位點的基 因序列。人工合成的基因經Nco I和HindIII雙酶切，割膠回收CPL-1基因片段，將酶切 后的片段用T4DNA連接酶與同樣用Nco I和Hind III酶切過的pET28a載體在16°C連接2 小時，即連入pET28a載體的T7啟動子之后，連接液再轉化大腸桿菌DH5a，便得到重組 表達質粒 pET28a-cpl_l。將測序正確的表達質粒轉化BL21 (DE3)感受態細胞，獲得cpl_l的表達工程菌 BL21 (DE3) /pET28a-cpl-l。挑單克隆接種于50ml LB培養液(含30 μ g/ml卡那霉素)， 37°C振蕩培養過夜，按接種到相同的LB培養液中，37°C振蕩培養至光密度值(波長 600nm)為0.6時，然后加入IPTG到終濃度為ImM誘導蛋白表達，繼續培養4小時，發 酵液離心，收集菌體。重組 CPL-I 的分離純化方法可參考文獻Immobilization and single-step purification of fusion proteins using DEAE_cellulose[Eur.J.Biochem.203，3 53-159(1992)]。比較好的 純化步驟如下菌體沉淀重懸于破菌緩沖液(20mmol/L Tris-HCl, 2mmol/L EDTA，pH
7.0-9.0)，在冰浴下超聲破菌。破菌液離心，收集上清液部分。破菌上清液上樣至用25mM 磷酸緩沖液 pH6.0-8.0 平衡 DEAE-Sepharose 層析柱；用含 1-2M NaCl 的 25mM
磷酸緩沖液pH6.0-8.0清洗至紫外檢測保證層析柱平衡至基線；再用25mM磷酸緩沖液 PH6.0-8.0清洗2-5個柱體積；用含1-5%氯化膽堿的25mM磷酸緩沖液pH6.0_8.0洗脫， 洗脫液經透析和凍干后即得重組CPL-1。本發明利用基因重組技術，將人工合成的噬菌體裂解酶CPL-I基因克隆至大腸 桿菌，IPTG誘導表達，再利用肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶CPL-I的結合域能與肺炎鏈球菌 細胞壁上磷壁酸中的膽堿(choline)相結合的特性，采用膽堿類似物DEAE-Sepharose進 行親和層析來純化重組CPL-I，最后經透析和冷凍干燥制得重組CPL-I產品，其純度達 97%,生產工藝快速簡易，純化效率高，能最大限度地保持酶活性，適合大規模生產。
圖1為重組CPL-I的DEAE-Sepharose親和純化圖2為SDS-PAGE分析CPL-1的表達其中泳道M 蛋白分子量標準泳道1-4:超聲破菌上清液，分別為空載體未誘導；空載體誘導后4小時；重 組質粒未誘導；重組質粒誘導后4小時圖3為純化重組CPL-I的SDS-PAGE分析其中泳道M 蛋白分子量標準泳道1-4 經DEAE-Sepharose親和純化后的重組CPL-I
圖4為重組CPL-I對肺炎球菌的抑菌活性1-3 重組 CPL-I 的濃度分別為 lmg/ml、2mg/ml 和 4mg/ml
具體實施例方式實施例1.獲取噬菌體裂解酶CPL-I基因根據大腸桿菌偏愛密碼子，全基因合成CPL-I基因，該基因編碼序列全長 1027bp。SEQ.ID.NO 15 ‘ -CCATGGTTAAAAAGAATGATCTGTTTGTAGATGTTTCTTCCCACAACGG TTACGATATCACTGGTATCCTGGAGCAAATGGGCACCACTAACACCATCATTAAAATTT CTGAATCCACGACCTATCTGAACCCTTGCTTGTCTGCTCAAGTGGAGCAGTCCAACCC TATTGGCTTTTATCACTTCGCACGCTTTGGCGGTGACGTAGCAGAAGCCGAACGTGAA GCGCAGTTTTTCCTGGACAACGTGCCTATGCAAGTTAAATACCTTGTATTGGACTACG AGGACGACCCAAGCGGTGACGCACAAGCGAACACTAACGCATGCCTGCGCTTTATGC AGATGATTGCTGACGCTGGCTATAAACCTATTTATTATTCTTATAAACCGTTTACCCATG ATAATGTGGACTATCAGCAAATCCTTGCACAGTTCCCTAATTCTCTGTGGATTGCAGGC TATGGCCTGAACGATGGTACTGCTAACTTTGAATACTTCCCAAGCATGGACGGCATCC GTTGGTGGCAGTATTCTTCCAACCCGTTTGACAAGAATATTGTACTGTTAGACGATGA AGAAGACGACAAGCCAAAGACCGCTGGTACGTGGAAACAAGACAGCAAGGGTTGGT GGTTCCGCCGTAACAATGGCTCTTTCCCTTATAATAAATGGGAAAAAATCGGTGGTGT GTGGTACTACTTCGATTCTAAAGGCTATTGCCTGACGAGCGAATGGCTCAAAGATAATGAAAAATGGTACTACCTCAAGGACAACGGCGCAATGGCGACTGGTTGGGTGCTGGTC GGTTCTGAGTGGTATTATATGGACGATTCTGGCGCTATGGTTACTGGTTGGGTCAAGTA TAAGAATAACTGGTACTATATGACCAATGAACGTGGTAACATGGTTTCTAATGAATTTA TTAAGTCTGGCAAAGGTTGGTATTTCATGAACACCAACGGTGAGCTGGCAGACAATC CATCCTTCACGAAAGAACCAGACGGCCTGATCACCGTAGCATGAAGCTT-3'在設計的SEQ.ID.NO 1中，5，端加上了 Nco I限制性核酸內切酶位點(斜體 部分)的基因序列，以及3’端加上了 HindIII限制性核酸內切酶位點(斜體部分)的基 因序列。實施例2.工程菌的構建和表達人工合成的基因經Nco I和HindIII雙酶切，割膠回收cpl_l基因片段，將酶切后 的片段用T4DNA連接酶與同樣用Nco I和HindIII酶切過的pET28a載體在16°C連接2小 時，即連入pET28a載體的T7啟動子之后，連接液再轉化大腸桿菌DH5a，便得到重組表 達質粒 pET28a-cpl_l。重組質粒通過DNA自動測序儀測序，經過序列比較證實獲得的DNA序列與設 計的編碼噬菌體裂解酶CPL-I的基因序列完全一致。構建的重組質粒pET28a_cp卜1編碼CPL-1的氨基酸序列如下SEQ.ID.NO 2 MVKKNDLFVD VSSHNGYDIT GILEQMGTTN TIIKISESTT YLNPCLSAQVEQSNPIGFYH FARFGGDVAE AEREAQFFLD NVPMQVKYLV LDYEDDPSGD AQANTNACLR FMQMIADAGYKPIYYSYKPF THDNVDYQQI LAQFPNSLWI AGYGLNDGTA NFEYFPSMDG IRWWQYSSNP FDKNIVLLDDEEDDKPKTAG TWKQDSKGWW FRRNNGSFPY NKWEKIGGVW YYFDSKGYCL TSEWLKDNEK WYYLKDNGAMATGWVLVGSE WYYMDDSGAM VTGWVKYKNN WYYMTNERGN MVSNEFIKSG KGWYFMNTNG ELADNPSFTKEPDGLITVA將測序正確的表達質粒轉化BL21 (DE3)感受態細胞，獲得cpl_l的表達工程菌 BL21 (DE3) /pET28a-cpl-l。挑單克隆接種于50ml LB培養液(含30 μ g/ml卡那霉素)， 37°C振蕩培養過夜，按接種到相同的LB培養液中，37°C振蕩培養至光密度值(波長 600nm)為0.6時，然后加入IPTG到終濃度為ImM誘導蛋白表達，繼續培養4小時，發 酵液6000r/min離心IOmin收集菌體。實施例3.重組CPL-I的純化實施例2獲得的菌體沉淀重懸于破菌緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTApH 8.0),在冰浴下超聲破菌。破菌液4°C，12000r/min離心20min，收集上清液部 分。樣品經15% SDS-PAGE分析，在40KD處有一條明顯的重組蛋白表達條帶，目的蛋 白約占菌體總蛋白的30%，菌體超聲破菌上清中有明顯的表達產物(如圖2)，說明表達 的目的蛋白都是以可溶的形式存在。破菌上清液上樣至用25mM磷酸緩沖液pH7.0平衡DEAE-Sepharose層析柱；用 含1.5M NaCl的25mM磷酸緩沖液pH7.0清洗至基線；再用25mM磷酸緩沖液pH7.0清 洗2個柱體積；用含2%氯化膽堿的25mM磷酸緩沖液pH7.0洗脫，回收率達70% (見附 圖1)。純化后的樣品經透析和凍干后即得成品。
純化后的樣品經15% SDS-PAGE檢測顯示在40KD處有一條純度大于97%的條 帶，其分子量與理論值39KD相符(如圖3)。實施例4.重組CPL-I的抑菌活性采用紙片擴散法進行抑菌實驗，將處于對數生長期的肺炎球菌HPK146 (對紅霉 素和克林霉素耐藥)在血平板上涂布均勻，取20yL純化后的產物，濃度分別為Img/ ml、2mg/ml和4mg/ml，滴加在直徑6mm的圓形紙片上，再貼于培養基表面，將平板正 面向上37°C培養Ih后，倒置繼續培養18h。經純化的重組CPL-I對臨床分離的肺炎球 菌具有明顯的抑菌活性(如圖4)。說明CPL-I有望開發成為一個新的對付耐藥菌感染極 為有效的抗菌藥物，因此具有良好的臨床應用前景。序列表
<110>上海高科聯合生物技術研發有限公司
<120> 一種制備噬菌體裂解酶Cpl-I的方法
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<160>2
< 170>PatentIn Version2.1
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<211>1027
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CPL-1
<400>1
ccatggttaa aaagaatgat ctgtttgtag atgtttcttc ccacaacggt tacgatatca60
ctggtatcct ggagcaaatg ggcaccacta acaccatcat taaaatttct gaatccacga120
cctatctgaa cccttgcttg tctgctcaag tggagcagtc caaccctatt ggcttttatc180
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gtgagctggc agacaatcca tccttcacga aagaaccaga cggcctgatc accgtagcat10200079]gaagctt 10270080]<210>20081]<211>3390082]<212>PRT0083]<213>人工序列0084]<220>0085]<221>CHAIN0086]<400>20087]Met ValLysLysAsnAspLeuPheValAspValSerSerHisAsn0088]510150089]Gly TyrAsplieThrGlylieLeuGluGlnMetGlyThrThrAsn0090]2025300091]Thr IlelieLyslieSerGluSerThrThrTyrLeuAsnProCys0092]3540450093]Leu SerAlaGlnValGluGlnSerAsnProlieGlyPheTyrHis0094]5055600095]Phe AlaArgPheGlyGlyAspValAlaGluAlaGluArgGluAla0096]6570750097]Gln PhePheLeuAspAsnValProMetGlnValLysTyrLeuVal0098]8085900099]Leu AspTyrGluAspAspProSerGlyAspAlaGlnAlaAsnThr0100]951001050101]Asn AlaCysLeuArgPheMetGlnMetlieAlaAspAlaGlyTyr0102]1101151200103]Lys ProlieTyrTyrSerTyrLysProPheThrHisAspAsnVal0104]1251301350105]Asp TyrGlnGlnlieLeuAlaGlnPheProAsnSerLeuTrplie0106]1401451500107]Ala GlyTyrGlyLeuAsnAspGlyThrAlaAsnPheGluTyrPhe0108]1551601650109]Pro SerMetAspGlylieArgTrpTrpGlnTyrSerSerAsnPro0110]1701751800111]Phe AspLysAsnlieValLeuLeuAspAspGluGluAspAspLys0112]1851901950113]Pro LysThrAlaGlyThrTrpLysGlnAspSerLysGlyTrpTrp0114]2002052100115]Phe ArgArgAsnAsnGlySerPheProTyrAsnLysTrpGluLys0116]2152202250117]lie GlyGlyValTrpTyrTyrPheAspSerLysGlyTyrCysLeu0118]
0119]
0120] 0121] 0122]
0123]
0124]
0125]
0126]
0127]
0128]
0129]
0130]
0131]
0132]
Thr Ser Asp Asn Trp Tyr Lys Tyr Met Val Met Asn Glu Pro
Glu Gly Tyr Lys Ser Thr Asp
230 235240
Trp Leu Lys Asp Asn Glu Lys Trp TyrTyr Leu Lys
245 250255
Ala Met Ala Thr Gly Trp Val Leu ValGly Ser Glu
260 265270
Met Asp Asp Ser Gly Ala Met Val ThrGly Trp Val
275 280285
Asn Asn Trp Tyr Tyr Met Thr Asn GluArg Gly Asn
290 295300
Asn Glu Phe lie Lys Ser Gly Lys GlyTrp Tyr Phe
305 310315
Asn Gly Glu Leu Ala Asp Asn Pro SerPhe Thr Lys
320 325330 Gly Leu lie Thr Val Ala 33權利要求
1.一種制備肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶的方法，包括如下步驟(1)表達載體的構建將編碼肺炎球菌噬菌體裂解酶CPL-I氨基酸序列的基因序列 與啟動子相連；(2)轉化大腸桿菌，使其含有步驟(1)所構建的載體，培養發酵；(3)從發酵液中分離純化肺炎球菌噬菌體裂解酶CPL-I。
2.根據權利要求1所述的制備肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶的方法，其特征在于，步驟(2)中噬菌體裂解酶CPL-I的表達為誘導表達。
3.根據權利要求1所述的制備肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶的方法，其特征在于，所述及 的載體是大腸桿菌表達用載體pET28a。
4.根據權利要求1所述的制備肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶的方法，其特征在于，步驟 (1)中的啟動子是T7啟動子。
5.根據權利要求1所述的制備肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶的方法，其特征在于，步驟(3)的肺炎球菌噬菌體裂解酶CPL-I的分離純化包括如下步驟(1)菌體沉淀懸浮于破菌緩沖液中，經破菌，離心，收集上清液；(2)步驟(1)的上清液上樣至用平衡緩沖液平衡好的DEAE-Sepharose層析柱，用清 洗緩沖液清洗至紫外檢測保證層析柱平衡至基線，用平衡緩沖液清洗2-5個柱體積；(3)用洗脫緩沖液將肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶從層析柱上洗脫并收集洗脫液，洗脫液 透析、凍干。
6.根據權利要求5所述的制備肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶的方法，其特征在于，所述及 的破菌緩沖液為pH7.0-9.0的含有2mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-HCl緩沖液，平衡緩 沖液為PH6.0-8.0的25mM磷酸緩沖液，清洗緩沖液為pH6.0_8.0的含1_2M NaCl的25mM 磷酸緩沖液，洗脫緩沖液為pH6.0-8.0的含1-5%氯化膽堿的25mM磷酸緩沖液。
全文摘要
本發明屬于醫藥技術領域，具體的說涉及一種制備肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶的方法。利用基因重組技術，將人工合成的噬菌體裂解酶CPL-1基因克隆至大腸桿菌，IPTG誘導表達，再利用肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶CPL-1的結合域能與肺炎鏈球菌細胞壁上磷壁酸中的膽堿(choline)相結合的特性，采用膽堿類似物DEAE-Sepharose進行親和層析來純化重組CPL-1。該方法生產工藝快速簡易，純化效率高，能最大限度地保持酶活性，適合大規模生產。
文檔編號C12R1/19GK102021161SQ20091005792
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月22日 優先權日2009年9月22日
發明者陸海榮, 黃青山 申請人:昆山博青生物科技有限公司