專利名稱：月季熱激蛋白啟動子、其克隆方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學、基因工程技術領域，涉及一種熱誘導型啟動子 RcHSP17. 8P核苷酸編碼序列的克隆，此啟動子重組表達載體的構建，以及轉入草本植物的 雙子葉植物中啟動下游蛋白表達的方法。
背景技術：
啟動子可以與依賴于DNA的RNA聚合酶識別并與之結合，從而起始基因轉錄的一 段DNA序列，是基因表達調控的重要元件，一般位于轉錄起始位點上游幾十個堿基處.在核 心啟動子上游通常會有一些特殊的DNA序列，即順式作用元件，轉錄因子與之結合從而激 活或抑制基因的轉錄。它與RNA聚合酶及其他蛋白輔助因子等反式作用因子的相互作用是 啟動子調控基因轉錄的實質。根據啟動子的轉錄模式可將其分為3類組成型啟動子、組織或器官特異性啟動 子和誘導型啟動子。誘導型啟動子與另外兩類相比特點在于它可根據需要在植物特定的 發育階段、組織器官或特定的生長環境下，誘導基因準確而又選擇的起始轉錄。溫度效應啟動子是受溫度誘導活性的啟動子，可分為熱效應和冷效應啟動子 兩類。熱效應啟動子對高溫產生響應，含HSE、CCAAT-盒、AT-rich等活性元件序列。 HSE含有一個3堿基的5’ -GAA-3，序列，或反方向的5’ -TTC-3’序列，這種三核苷重 復序列相間排列，兩者之間被兩個堿基隔開，形成5’-[nGAAn][nTTCn]-3’結構。Coca 等(Maria A. Coca, ConcepcionAlmoguera, Terry L. Thomas and Juan Jordano(1996) Differential regulation ofsmall heat-shock genes in plants analysis of a water-stress-inducible anddevelopmentally activated sunflower promoter. Plant Molecular Biology, 31 863-876)將向日葵的 HaHSP17. 7G4 基因的啟動子與 gus 連接， 轉化煙草，發現其對對高溫(42°C)、脫落酸都有應答，在胚胎形成過程中也有積累。擬 南芥AtHsp90-l基因啟動子CCAAT-box缺失表明，CCAAT-box自身對熱激無反應，只有與 啟動子中其它的熱激元件，如HSEs或STREs(stressresponse elements)共同作用才 能增加熱誘導啟動子的特性(Haralampidis K.，Milioni D. and Rigas S. (2002)Plant Physiol, 129，1138-1149·)。將大豆熱激蛋白 GmHSP17. 3B 啟動子與 gus、GFP-talin 融 合，轉入苔蘚。通過控制熱激溫度和來調節⑶S的表達量(Younousse Saidi, Andrija Finka, MickhailChakhporanian, Jean-Pierre Zry “ d, Didier G. Schaefer and Pierre Goloubinoff, (2005)Plant Molecular Biology，59，697-711)，這使將啟動子調節功能應 用于生物技術，使在植物細胞中表達可控制數量的內源或重組蛋白成為可能。與本發明相 關的參考文獻有1. Concepcion Almoguera, Pilar Prieto-Dapena and Juan Jordano (1998)Dual regulation of a heat shock promoter during embryogenesis stage-dependentrole of heat shock elements. The plant Journal,13 (4),437-4462. D. CRONE, J. RUEDA, K. L MARTIN, D. A. HAMILTON and J. P. MASCARENHAS (2001)The differential expression of a heat shock promoter infloral and reproductive tissues. Plant. Cell and Environment,24,869-8743. Dorothea K.Thompson and Charles J. Daniels (1998) Heat shockinducibility of an archaeal TATA-Iike promoter is controlled by adjacentsequence elements. Molecular Microbiology,27 (3),541-5514. Maria A. Coca, Concepcion Almoguera, Terry L. Thomas and JuanJordano (1996)Differential regulation of small heat-shock genes in plants analysis of a water—stress—inducible and developmentalIy activated sunflowerpromoter. Plant Molecular Biology,31 :863_8765. Haralampidis K. ,Milioni D. and Rigas S. (2002)Combinatorialinteraction of Cis elements specifies the exp ression of the A rabidopsisAtHsp90_l gene Plant Physiol，129，1138-1149.6. Ralf Prandl and Fritz Schoffl(1996)Heat shock elements are involved inheat shock promoter activation during tobacco seed maturation. Plant MolecularBiology,31,157-1627. Younousse Saidi, Andrija Finka, Mickhail Chakhporan i an, Jean-PierreZry “ d, Didier G.S chaefer and Pierre Goloubinoff, (2005)Controlled expressionof recombinant proteins in Physcomitrella patens by a conditional heat-shockpromoter -.a tool for plant research and biotechnology. Plant Molecular Biology,59,697-7118.夏江東等(2006)高等植物啟動子功能和結構研究進展，云南農業大學學報，第 21卷第1期P7-149.伊淑瑩等(2007)番茄多脅迫誘導型LeMTshsp啟動子的分子克隆及其功能分 析，云南植物研究，29 (2)，223 230
發明內容
本發明的目的在首先在于提出一種從月季中分離出的編碼細胞質I型小分子熱 激蛋白17.8的基因RcHSP17. 8的啟動子，該啟動子是熱誘導型，是月季中一種新的熱誘導 型啟動子。本發明的第二目的是提供這種RcHSP17. 8的啟動子的制備方法。本發明的第三目的是提供這種RcHSP17. 8P啟動子的應用。本發明提供了一種月季熱激蛋白啟動子，其核苷酸編碼序列如SEQ IDN0. 1所示。本發明的月季熱激蛋白啟動子是月季細胞質I型小分子熱激蛋的基因RcHSP17. 8 上游的一段轉錄區，全長1.91kbp，本發明中稱為RcHSP17.8P。其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示，也包括與SEQ ID NO. 1序列同源度75%甚至在90%以上，與SEQ ID NO. 1編碼的DNA 具有相同功能的核酸分子。本發明的月季熱激蛋白啟動子的順式作用元件3個熱激元件(□:標識)和2個 冷感應元件(._ 標識)，以及1個對干旱產生響應的調控元(—標識)。具體位置見圖 7中的標識元件。
本發明還提供了上述月季熱激蛋白啟動子的克隆方法，依次包括如下步驟(1)取月季嫩葉，抽提DNA;(2)選擇月季熱激蛋白ORF中無酶切位點的限制性內切酶，對(1)所得DNA充分酶 切，酶切產物經沉淀純化后環化自連；(3)根據月季熱激蛋白ORF的序列，采用反式PCR方法克隆得到權利要求1所述的 月季熱激蛋白啟動子。上述克隆方法中，所述的月季嫩葉是溫室中正常培養4周的月季組培盆苗的嫩 葉。例如，本發明的一個實施例中采用溫室中正常培養4周的月季‘曼海姆宮殿’(Schloss mannieim,以下簡寫為SM)組培盆苗，取其嫩葉。上述克隆方法中，所述的月季熱激蛋白ORF中無酶切位點的限制性內切酶是Bgl II,Apa I.BamH I.Sal I, Sph I, Sca I, Eae I, Hpa I, NotI, Rsa I 中的一種或者幾種。上述克隆方法中，步驟(3)中利用反式PCR引物進行三輪PCR擴增獲得所述的月 季熱激蛋白啟動子。反式PCR(I-PCR)可以快速、高效地擴增cDNA或基因組中已知序列兩側位置的片 段。其基本實驗程序是基因組DNA經酶切后用T4DNA連接酶進行自連接，產生環狀DNA片 段；以環化產物為底物，用根據已知片段設計的反向引物進行PCR擴增，從而得到含有未知 片段的擴增產物(流程如圖8所示)。上述克隆方法中，采用三對反式PCR引物進行擴增。較好的，第三對反式PCR引物 中一條即為ORF的5’端序列，另一條盡量靠近月季熱激蛋白ORF的3’端。本發明提供了用于調取獲得RcHSP17. 8(月季熱激蛋白)的三對核苷酸引物。該 引物根據RcHSP17. 8的ORF設計，使用此引物對BglII酶切過的月季基因組DNA進行三次 反式PCR擴增可獲得長2. 2kbp的DNA片段。具體的引物序列信息參見SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 7。上述克隆方法中，克隆此啟動子的PCR酶可以采用LA Taq，buffer為相應的GC緩 沖液(LA-Taq專用)。上述克隆方法中，克隆此啟動子的PCR程序中采用68°C進行復性及延伸。例如，可 以設定為94°C預變性4min ；98°C變性10s，68°C復性及延伸15min，30個循環；最后72°C延 伸 IOmin0本發明還提供了含有所述月季熱激蛋白啟動子的重組載體。即將本發明的月季 熱激蛋白啟動子根據常規方法與適當的植物表達載體連接，例如本發明實施例中采用的 PCAMBIA1300植物表達載體等等。最后，本發明提供了所述月季熱激蛋白啟動子的應用，即將所述啟動子的重組載 體轉入植物中，以啟動下游基因的表達。根據月季啟動子RcHSP17.8P序列1910bp，設計擴增出完整序列的引物，并在正反 向引物上分別引入限制性內切酶識別位點(視選用的載體而定)，以便構建表達載體。將 PCR產物與經過同樣雙酶切的改造過的植物表達載體連接，轉化，測序，確保序列正確。將其 轉入農桿菌中，對正常培養(生長條件為光周期16h/8h(L/D)，22°C)的目標植物進行轉基 因，采用浸花法轉化適當花期的該植物。正常培養，收取種子，獲得Tl代幼苗后GUS顯色。以雙子葉植物擬南芥為例，具體步驟如下
(1)將含有所述月季熱激蛋白啟動子的重組表達載體轉入共轉化農桿菌GV3101。(2)于中午12點接菌于有YEP培養液的試管中10 μ 1 IOml接種。28°C,3000rpm 搖過夜，約30h，次日下午6點將已搖活的菌按(1 400)及750 μ 1菌液轉至漢IOOml YEP+Kan+Rif中培養28°C，300rpm約14h，次日上午8點測OD值，用YEP+Rif作為空白對照， 當菌液達到0D600為1. 2時，可收集菌體于50ml離心管(滅菌)，4°C，4000g離心lOmin。 用5%蔗糖(含0.03% silwet)稀釋至0D600約為0. 8 1. O左右，用5%蔗糖作對照。轉 化時將花苞在溶液中浸泡5s左右，暗培養24h。轉化前一天將需要做轉化的野生型擬南芥 苗子澆水至透。(3)將轉化好的苗正常培養，每3d澆水1次。(4)收取轉化擬南芥，烘干(37°C 24h)。用乙醇消毒后并撒于抗生素潮霉素篩選培 養基上，4°C春化2d，正常培養，一周后獲得轉化植株的Tl代幼苗。(5)將Tl代幼苗移到土中培養。(6) PCR鑒定其HYG基因的表達，樣品分別為轉基因和野生型的擬南芥基因組DNA。(6)鑒定后的植株⑶S顯色。本發明中，可選用本領域已經知道的各種載體，如市售的載體以及質粒。本研究分離的月季啟動子RcHSP17. 8P，是新型的誘導型啟動子，是一種溫度依賴 型基因RcHSP17. 8的上游一段DNA序列，具體為一種編碼月季細胞質I型小分子熱激蛋 RcHSP 17. 8的啟動子，記為RcHSP17. 8P。將本發明所獲基因通過農桿菌介導的轉基因的方 法，轉入雙子葉植物擬南芥中，啟動下游重組基因在轉化細胞中具有高溫誘導表達的特性。 本發明利用分子生物學方法分析該片段控制下的報告基因GUS的表達模式，結果表明產生 的轉基因擬南芥幼苗在37°C熱激處理下誘導下游基因GUS的表達，并且表達活性隨著發育 時期而變化。本發明的月季啟動子RcHSP17. 8P將可作為一種有效的溫度感應的生物傳感 器系統的基礎。
圖1月季SM基因組酶切結果。1-10泳道分別為BglII、Apa I,BamHI,Sal I、SphI、 Sca I、Eae I、Hpa I、Not I、Rsa I 酶切產物電泳檢測。圖2為第二輪反式PCR電泳檢測結果。圖3為第三輪反式PCR電泳檢測。圖4為轉基因擬南芥潮霉素基因(HYG)和啟動子片段的PCR鑒定結果，其中，左右 兩幅分別用潮霉素基因和啟動子片段的一對特異引物PCR鑒定樣品中潮霉素(圖左)和啟 動子(右)；M 為 DL2000Marker 從上至下:2000bp，IOOObp, 750bp, 500bp ；+ 擬南芥轉基因 陽性植株苗鑒定；-未轉化啟動子序列擬南芥陰性苗鑒定。圖5為不同發育時期轉基因擬南芥植株苗熱處理下進行⑶S顯色鑒定結果，其中， aa、bb、cc、dd 為沒有處理的 12h、24h、2d、6d 的苗的 GUS 染色情況，ee、ff、gg、hh 為 12h、 24h、2d、6d的苗37°C處理Ih后GUS染色情況。圖6為花和果莢中⑶S顯色鑒定結果。a、b、e為對照，c、d、f為37°C熱激Ih后 染色。圖7為啟動子RcHSP17.8P序列中作用元件的標示圖，圖中有正、負兩條互補鏈，有3個熱激元件(1 ~~!標識)，2個冷感應元件(一.標識)，1個對干旱產生響應的調控元 (一標識)O 圖8為反式PCR的基本流程圖。
具體實施例方式下面結合具體實施實例進一步闡釋本發明。應理解，這些實例僅以用于說明本發 明而不用于限制本發明的范圍。下列實例中未注明具體的實驗方法，均可按照常規方法進 行。如 Sambrook等分子克隆實驗手冊(New York Co Id Spring Harbor Labortary Press， 1989)中所述條件，或按照制造生產廠商的使用說明。所用試劑材料如非特別標注，則是從 上海生工、上海前塵生物科技有限公司購得。實施例1月季RcHSP17. 8啟動子RcHSP17. 8P基因的克隆1月季(Rosa chinensis)品種曼海姆(Japonica)來自上海植物園；生長條件為 光周期 16h/8h(L/D)，27°C。2基因組DNA提取。取0. 05g嫩葉片，加入少許不溶性PVP，液氮中充分研磨， 迅速轉移至1.5ml的EP管中；加入500 μ 1 65°C預熱的提取緩沖液，快速混勻；65°C水 浴20min(期間倒置混勻1-2次)，冷卻至室溫；加入500 μ 1氯仿異戊醇(24 1)，輕 柔混勻，靜置l-2min ；12000rpm、室溫離心lOmin，上清轉移至新管；加入等體積的氯仿 異戊醇(24 1)，輕柔混勻，靜置l-2min;同上離心，上清轉移至新管；加入1/10體積3M NaAc (pH5. 2)、2倍體積冰冷的無水乙醇(_20°C )，輕柔混勻，_20°C靜置40min ；同上離心，棄 上清，沉淀用70 %乙醇(4°C預冷)洗滌2次；室溫涼干，25 μ ITE (含1 % (V/V) RNA酶)充 分溶解沉淀；65°C水浴消化RNA Ih ；取5 μ 1用于0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。3啟動子的克隆。選擇在RcHSP17. 8的ORF中無酶切位點(non-cutting)的限制 性內切酶Bgl II, Apa I.BamH I、Sail、SphI、Sca I, Eae I, Hpa I, Not I, Rsa I 對 SM 基 因組DNA進行充分酶切(圖1)，酶切產物經沉淀純化后用于環化自連。依據RcHSP17. 8的 ORF序列設計SM與KP的RcHSP17. 8啟動子克隆使用的引物，第三對反式PCR引物IN3-F 即為ORF的5’端序列，IN3-R盡量靠近ORF的3’端設計。以上述連接產物為模板，以反式 PCR引物進行三輪PCR擴增，從Bgl II酶切產物中擴增到一條2. 2Kb的片段(圖3)，小量 膠回收法將PCR產物進行割膠回收。反式PCR引物序列如下
第一對
INl-F 5，-AGGACAAGAACGACAAGTGG-3’
INl-R 5，-GTCATCTTCAATCTCAACCT-3’
第二對
IN2-F 5，-C GAGAGAAGCAGCGGCAAGT-3’
IN2-R 5，-CCTCTTCTTTCTTCAGCCCC-3，
第三對
IN3-F 5，-AGGCTGCTATGGAGAATGGA-3’
IN3-R 5，-GGAAATTTGGGATAAGCGACAT-3
實施例2月季啟動子RcHSP17. 8P核苷I
登陸PlantCARE數據庫在線進行預測RcHSP17. 8啟動子DNA序列上的順式作用元 件，分析其區域上的與熱激、低溫、干旱等脅迫相關，信息參見發明內容，具體序列如圖7不 同標注。實施例3轉化月季啟動子RcHSP17. 8P的擬南芥植株潮霉素基因(HYG)和啟動子片段的PCR
鑒定以SDS方法小量抽提轉基因和野生植株的基因組DNA。利用潮霉素基因和啟動子 片段的特異引物，進行PCR鑒定。檢測結果如圖4所示，PCR結果都表明攜帶啟動子基因的 載體質粒已經整合到擬南芥基因組中。實施例4轉化月季啟動子RcHSP17. 8P的雙子葉植物-擬南芥幼苗進行⑶S顯色鑒定根據月季啟動子RcHSP17.8P序列1910bp，設計擴增出完整序列的引物，并在正反 向引物上分別引入限制性內切酶識別位點，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增 產物為模板，在5’端和3’端分別加入EcoR I和SacI酶切位點。經EcoR I和SacI雙酶 切的PCR產物與經過同樣雙酶切的改造過的pCAMBIA1300植物表達載體連接，轉化，測序， 確保序列正確。將其轉入農桿菌中。將含有RcHSP17.8P啟動子序列的農桿菌，對正常培養 (生長條件為光周期16h/8h(L/D)，22°C )的擬南芥進行轉基因，采用浸花法轉化適當花期 的擬南芥。正常培養，收取種子，獲得Tl代幼苗后GUS顯色。具體步驟如下(1)將含有所述月季熱激蛋白啟動子的重組表達載體轉入共轉化農桿菌GV3101。(2)于中午12點接菌于有YEP培養液的試管中10 μ 1 IOml接種。28°C,3000rpm 搖過夜，約30h，次日下午6點將已搖活的菌按(1 400)及750 μ 1菌液轉至漢IOOml YEP+Kan+Rif中培養28°C，300rpm約14h，次日上午8點測OD值，用YEP+Rif作為空白對照， 當菌液達到0D600為1. 2時，可收集菌體于50ml離心管(滅菌)，4°C，4000g離心lOmin。 用5%蔗糖(含0.03% silwet)稀釋至0D600約為0. 8 1. O左右，用5%蔗糖作對照。轉 化時將花苞在溶液中浸泡5s左右，暗培養24h。轉化前一天將需要做轉化的野生型擬南芥 苗子澆水至透。(3)將轉化好的苗正常培養，每3d澆水1次。(4)收取轉化擬南芥，烘干(37°C 24h)。用乙醇消毒后并撒于抗生素潮霉素篩選培 養基上，4°C春化2d，正常培養，一周后獲得轉化植株的Tl代幼苗。(5)將Tl代幼苗移到土中培養。(6) PCR鑒定其HYG基因的表達，樣品分別為轉基因和野生型的擬南芥基因組DNA。(6)鑒定后的植株⑶S顯色(方法同前所述)。通過與未轉基因的對照組相比，可看到轉基因陽性植株在37°C高溫處理Ih后⑶S 活性上升，但僅限于不到6d的小苗，6d后不進行處理，GUS活性也很高(圖6)。花中，37°C 熱激處理Ih后，萼片、花絲、柱頭等部位GUS活性增強。果莢兩端的GUS表達量在熱激后也 會上升。轉此基因的植株與野生型營養生長沒有區別，生長良好。序列表<210>1
<211>1910<212>DNA<213> 月季<220><221>熱激元件<222>(1804)·· (1817)<223><400>1
0095]ccaagattcactttagtgagccctattagatttaggctagaatatatatctttttaatta600096]tccgattcggcatttaatatttttaggctagttttacatttgttttaggattctttttat1200097]ttttaggttcttagtttccttttaaatttggatcctttaggattccttgttagattatga1800098]ttttaggtcttggatgcctatatatgcatcatcatgctttgtattagaatcagtttatca2400099]tatcaaattt3.3. 3.3.3.3.3. gagagttttttctcaagttctctggtggactctagattta3000100]tcgttttagagtatattgattgtaaacttaggttacttcagactttgtcaaattcaattt3600101]agttgctattttgtttgagcttgatacaataaagatatcggagaggtctgttttgtattt4200102]gatttgaaaaactcatgccatctcttgctctcactcttgcgaaccctcacaacgccgcca4800103]caggtttcaagcacgttgcgcacgatctcggtagcgcttctacctttcgcgatcacccaa5400104]aacgattgtgtatattgacctctcctttttgttggtttcctgatggtttcctttggcttt6000105]ctttaggctggagaggatggccatgaagagggcggctggagggtggccttcagtttcgat6600106]gggttggaactcagatggattggttgagaaggatggcgacgctatggattgtgagacttt7200107]tggccaggcagatgctgttggcagcatggggygcatatctgcctaggtttggtggcggtc7800108]tgcatcgcttaggtgtccacatcaagagcttgggcttcttggttgggctgtgtttggacc8400109]caaagtagatgagtgtccagataagaagatggattcttccaggtgtctaagggacttgga9000110]tttgggatccaggaggtttgctatatattctattcaatgtcatagttgttacttgtttgg9600111]gtgtgttgttcttaatttttggtaaagtgatgctctctatattctatgaagactctaatt10200112]ttagtttgaaattttgttgattgctctgctctttcttattgatataaataagaaaaataa10800113]ggacaaaatgttgcattattcgacattattatattaattgtgtatccaggtcattttttt11400114]ccaaacctttcacaacatgttttcggaccaaaaaataaagttaacatttttttttggata12000115]aatttcagtttagtaccccttgtgggtttgggggttatatcatgttagtccatgctcttt12600116]caatttgatcagtaacacccctgtgctttcaatttcaatcagccgtgcccaaatttactg13200117]ttccgtccaattttgaacgttaactttgactggattgacaaagtaaaatttagacgaaac13800118]agtaaaatttgggcacggctgattgaaattgaaagcacaggggtgttgttgatcaaattg14400119]aaagagcagacactgacatgatattaccccC3.3.3.CCCC3.3.ggtactaaattgaaatcaat15000120]CCttttttttttttgagaataaataaatgtcaacttatgtgagagtaaaatcccaagaaa15600121]agtatgagccaacgtttaattccgctccccatccctactctcatctgacttcaagagccc16200122]ataatgtaacctactttgggcccatatttttattctcaacattcctagacagtttcctga16800123]ccattcttccgttccattgtatgagcccacgattatggaacctactttcggccgactttc17400124]tcattctcaggagtcctggaaagttcgagagaacagaaaaacgttttcaagtccgagcat18000125]tctccagaagattcttgggtctccttataaatacgcatccaatcttcccgtccaatcacc1860
aaaccagtta agcaaatact caaacattct gatcgtgcaa tccattcaca1910
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
aggacaagaa cgacaagtgg20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
gtcatcttca atctcaacct20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
cgagagaagc agcggcaagt20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
cctcttcttt cttcagcccc20
權利要求
一種月季熱激蛋白啟動子，其特征在于，其核苷酸編碼序列如SEQ IDNO.1所示。
2.如權利要求1所述月季熱激蛋白啟動子的克隆方法，其特征在于，該方法依次包括 如下步驟(1)取月季嫩葉，抽提DNA;(2)選擇月季熱激蛋白ORF中無酶切位點的限制性內切酶，對(1)所得DNA充分酶切， 酶切產物經沉淀純化后環化自連；(3)根據月季熱激蛋白ORF的序列，采用反式PCR方法克隆得到權利要求1所述的月季 熱激蛋白啟動子。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的月季嫩葉是溫室中正常培養4周的月 季組培盆苗的嫩葉。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的月季熱激蛋白ORF中無酶切位點的 限制性內切酶是 Bgl II、Apa I、BamH I、Sal I、Sph I、Sca I、Eae I、Hpa I、Not I、Rsa I 中的一種或者幾種。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中利用反式PCR引物進行三輪PCR 擴增獲得權利要求1所述的月季熱激蛋白啟動子。
6.如權利要求2所述的方法，其特征在于，克隆此啟動子的PCR酶為LATaq，bufTer為 GC緩沖液。
7.如權利要求2所述的方法，其特征在于，克隆此啟動子的PCR程序為94°C預變性 4min ；98°C變性10s，68°C復性及延伸15min，30個循環；最后72°C延伸IOmin0
8.含有如權利要求1所述月季熱激蛋白啟動子的重組載體。
9.如權利要求1所述月季熱激蛋白啟動子的應用，其特征在于，將所述啟動子的重組 載體轉入植物中，以便在熱激條件下啟動下游基因的表達。
全文摘要
本發明屬于分子生物學、基因工程技術領域，涉及一種熱誘導型啟動子RcHSP17.8P核苷酸編碼序列的克隆，此啟動子重組表達載體的構建，以及轉入草本植物的雙子葉植物中啟動下游蛋白表達的方法。本發明利用分子生物學方法分析該片段控制下的報告基因GUS的表達模式，結果表明產生的轉基因擬南芥幼苗在37℃熱激處理下誘導下游基因GUS的表達，并且表達活性隨著發育時期而變化。本發明的月季啟動子RcHSP17.8P將可作為一種有效的溫度感應的生物傳感器系統的基礎。
文檔編號C12N15/11GK101993870SQ20091005663
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月18日 優先權日2009年8月18日
發明者張璇, 明鳳, 蔣昌華 申請人:復旦大學