專利名稱：一種tgfbi基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用的制作方法
一種TGFBI基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應
用
技術領域：
本發明涉及一種試劑盒，具體地說關于一種TGFBI基因的原位雜交檢測試劑盒及 其檢測方法和應用
背景技術：
腫瘤是指機體在各種致瘤因素作用下，局部組織的細胞異常增生而形成的局部腫 塊。癌癥病變的基本單位是癌細胞。人體細胞老化死亡后會有新生細胞取代它，以維持機 體功能，人體絕大部分細胞都可以增生，但這種增生是有限度的，而癌細胞的增生則是無止 境的，這使患者體內的營養物質被大量消耗。同時，癌細胞還能釋放出多種毒素，使人體產 生一系列癥狀，晚期時它轉移到全身各處生長繁殖，最后導致人體消瘦、無力、貧血、食欲不 振、發熱及臟器功能受損等，器官功能衰竭而死亡。癌癥也叫惡性腫瘤，相對的有良性腫瘤。 腫瘤是指機體在各種致瘤因素作用下，局部組織的細胞異常增生而形成的局部腫塊。良性 腫瘤容易清除干凈，一般不轉移、不復發，對器官、組織只有擠壓和阻塞作用。但惡性腫瘤還 可以破壞組織、器官的結構和功能，引起壞死出血合并感染，患者最終可能由于器官功能衰 竭而死亡。TGFBI基因具有抗腫瘤功能，它的表達降低會導致癌細胞增長，血管(腫瘤)生 成以及促進癌細胞轉移。TGFBI基因表達的TGFBI蛋白是一種由轉化生長因子β誘導的 分泌蛋白，在生物通早期的報道中發現該蛋白與癌癥有關聯，很可能成為癌癥的一種生物 學標記物。體外實驗研究發現如果細胞缺失TGFBI會導致細胞過度增殖，促進腫瘤血管 生成，促成癌癥發生。因此說，TGFBI蛋白具有抗腫瘤的功能，但是，TGFBI蛋白如何在活 體內發揮作用，其作用的分子機制如何一直鮮為人知。美國哥倫比亞大學放射學研究所、 Herbert Irving綜合癌癥研究中心臨床腫瘤系、洛克菲勒大學分子生物學實驗室、中國醫 學科學院基礎醫學研究所生物化學與分子生物學系等處的研究人員在最新一期的《癌癥 研究》(Cancer Research)上發表關于TGFBI與癌癥發生的相關文章。TGFBI基因表達的 TGFBI蛋白是一種由轉化生長因子β誘導的分泌蛋白，在早期的報道中發現該蛋白與癌癥 有關聯，很可能成為癌癥的一種生物學標記物。體外實驗研究發現如果細胞缺失TGFBI會 導致細胞過度增殖，促進腫瘤血管生成，促成癌癥發生。因此說，TGFBI蛋白具有抗腫瘤的功 能，但是，TGFBI蛋白如何在活體內發揮作用，其作用的分子機制如何一直鮮為人知。為了深 入了解TGFBI蛋白的作用機制，研究小組開展了下面的研究工作。以小鼠為模型，將小鼠的 TGFBI基因剔除掉，小鼠成為不表達TGFBI的缺陷型小鼠，結果表明，缺陷型小鼠更易罹患 癌癥，在7，12-二甲苯恩的作用下更易自發形成皮膚癌。研究者還發現，缺陷型的小鼠胚胎 成纖維細胞更易發生染色體畸變，細胞增殖活性增強，細胞復制過程中過早進入S期(這些 都有可能增強癌變的幾率)。缺失TGFBI可能導致轉錄因子CREB激活，上調cyclin Dl蛋 白的表達。研究者發現，如果用遺傳技術在小鼠的胚胎成纖維細胞中再導入TGFBI，可有效 地逆轉癌變的過程。研究小組的實驗結果首次證實TGFBI在活體內具有腫瘤抑制的活性。研究也證實癌癥患者血緣中TGFBI基因表達低，TGFBI基因可作為臨床癌癥的觀測指標。隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，癌癥基因組學等研究的深入展開，至 今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或癌細胞形成(單克隆 時)就能做到早期預測診斷。本發明采用核酸原為雜交技術檢測TGFBI基因的表達量來診 斷臨床各類癌癥，有非常重要臨床價值。原位雜交技術(in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術結合起 來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使含 有特異序列、經過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈 即靶核酸發生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細 胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。
發明內容本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種TGFBI基因的原位雜交檢測試 劑盒的用途。本發明的再一的目的是，提供一種TGFBI基因的原位雜交檢測試劑盒。本發明的另一的目的是，提供一種TGFBI基因的原位雜交檢測方法。為實現上述目的，本發明采取的技術方案是一種TGFBI基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測癌癥疾病藥物中的應用，所述 的試劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。TGFBI基因序 列號NM-000358，2805bp CDS :162_2213bp，在染色體 5q31 〃 位點上。 所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P中的一種。所述的非放射性標記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素 中的一種。所述的非放射性標記物優選自地高辛。所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是一種TGFBI基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其中所述的雜交 探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。為實現上述第三個目的，本發明采取的技術方案是一種TGFBI基因的原位雜交檢測方法，該方法包括以下步驟a、將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復合體；b、檢測a步驟得到的雜交復合體。本發明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業內人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結果報告，其中雜交的具體步驟包括儀器操作1).將待測標本放入反應槽中；
2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3).儀器自動棄去液體，自動后固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C )；
5).儀器自動棄去液體，自動清洗；
6).儀器自動棄去液體，自動雜交(420C )；
7).儀器自動棄去液體，自動清洗；
8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(室溫)
9).儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；
10).取出封片鏡檢。本發明優點在于1、本發明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。2、本發明的檢測方法操作方便、簡單，能在區級以上醫院普遍使用和推廣。3、本發明的臨床意義是更早期跟蹤檢測癌癥發生動態過程，以及用于癌癥預防醫 學的檢測和篩選工具。本發明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測癌胚蛋白標志物，以及影像 醫學檢查有顯著不同。本發明可以在基因水平上檢測TGFBI異常表達，在影像醫學檢查及 其它檢查未發現占位性癌癥病灶之前，癌癥生化指標未產生異常之前，亦未形成腫塊之前， 能及早做到以上基因表達異常的信息采集，給臨床癌癥病患一個真正的預后早期診斷。這 樣才有可能實施癌癥的早期診斷、早期預防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治癌癥惡 疾。
圖1是本發明實施例中癌癥病人TGFBI基因表達圖片。圖2是正常人TGFBI基因表達圖片。
具體實施方式下面結合附圖對本發明具體實施方式
作詳細說明。實施例1一種TGFBI基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物、增效劑，其中，所 述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。雜交探針用地高辛標記。試劑盒中的其它液體和
標本組成如下
消化液100 μ 1/管1管"^ 無色透明液體
保護液100 μ 1/管1管"^ 無色透明液體
預雜交液1300 μ 1/ 管2管"^ 無色透明液體
正義雜交液10μ 1/管1管"^ 無色透明液體
反義雜交液10μ 1/管1管"^ 無色透明液體
封閉液1000 μ 1/ 管1管"^ 無色透明液體
堿性磷酸酶抗體Ιμ /管1管"^ 無色透明液體
顯色劑A175 μ 1/ 管1管/:盒 黃色液體
顯色劑B320 μ 1/ 管1管/:盒 無色透明液體緩沖液I IOx90ml/瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體緩沖液II IOx80ml/瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體緩沖液III IOx20m/瓶3瓶/盒 淺I營色或無色透明液體緩沖液IV IOx90ml/ 瓶1瓶/盒 淺I營色或無色透明液體固定液90ml/ 瓶1瓶/:盒 無色透明液體陽性對照標本6片/盒
上述試劑成分說明(所有試劑購自SIGMA)
1、消化液:20mg/ml蛋白酶 K，IOOmg 蛋白酶 K，加 DEPC-H2O 5ml ；
2、保護液0.2g的glycine加入Iml的IX緩沖液I ；
3、預雜交液1X緩沖液II7. 5ml 50XD 3ml
10mg/ml yest t-RNA 750ul llmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul 0.04M EDTA 3ml 50% formamide 15ml
4、封閉液0.03g的bloking(購買自羅氏公司)加入ImlIX緩沖液III ；
5、IOx緩沖液 I (PH7. 1-7. 4) NaCl 80g
Na2HPO4. 12H20 360g KCl 2g KH2PO4 2g
加三蒸水至11，并高壓滅菌；
6、IOx緩沖液 II (PH7. 0) NaCl 175.3g 檸檬酸鈉88. 2g HCl幾滴
加三蒸水至11，并高壓滅菌；
7、緩沖液III (PH7. 9) Tris 121.Ig NaCl 87. 66g HCl 60ml 左右 加三蒸水至11，并高壓滅菌；
8、緩沖液IV:
IM Tris-HCl (PH9. 5) =Tirs 121. Ig 加 HCl 3ml 左右，加水 900ml，調 PH 至 9. 5，加 11，并高壓滅菌；
IM NaCl =NaCl 58. 44加水至11，并高壓滅菌； 0. 5M MgCl2 101. 65g MgCl2. 6H20 加水至 11，并高壓滅菌;
9、固定液多聚甲醛40g加IX緩沖液I至11，稍加熱(約50-60度)攪拌至溶
10、顯色劑 A =NBT Ig 加 70% DMFl 1. 44ml ；11、顯色劑 B =BCIP Ig 加 100% DMF30ml。本發明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。實施例2一種TGFBI基因原位雜交檢測方法及其試劑盒應用一、標本處理1、用IOml的離心管，裝4. 5ml淋巴細胞分離液，再將3ml抗凝血緩慢加入含有淋 巴細胞分離液(血淋巴細胞分離液=1 1.5)的離心管中，2000r/min離心IOmin ；2、吸取中間層白細胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的IX緩沖液I，混 勻，1500g/min 離心 IOmin ；3、棄上清.沉淀加入約兩倍的1 X緩沖液I，混勻，1500g/min離心IOmin ；4、棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有條件的醫院可以用制片機制片。)3ml血，可以做4張片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用IX緩沖液I洗5min。每缸 可以放16片；6、標本可保存在-20°c，或繼續做實驗。二、將試劑盒中試劑配制成使用濃度1、將IOX緩沖液I用三蒸水按1 10稀釋成IX緩沖液I ；2、將20X緩沖液II用三蒸水按1 10稀釋成2X緩沖液II ；按1 100稀釋成0. 2X緩沖液II ；按1 200稀釋成0. 1 X緩沖液II ；3、將IOX緩沖液III用三蒸水按1 10稀釋成1 X緩沖液III ；4、10X緩沖液IV用三蒸水按1 10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、實驗步驟1、取每位待檢者標本兩張，(另外兩張留作復查用)及陽性對照標本兩張(每次 實驗做一對陽性對照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液IOOul加IX緩沖液199.9ml，即為使用濃 度)20ml。37°C水浴預熱10分鐘。放進16張玻片，37°C處理12min，再用1 X緩沖液I洗 5min ；3、用0. 2%的保護液(保護液Iml加IX緩沖液I99ml即為使用濃度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上過程都在玻璃缸進行。玻片自然干燥；4、將玻片放入保濕盒內，加預雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在 42°C恒溫水浴箱中3h以上；5、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、將玻片放入保濕盒內，每位病人標本兩張，一張加正義雜交液20ul/片，另一張 加反義雜交液20ul/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min
在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min ；8、用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；9、將玻片放入保濕盒內，加0.5% 1封閉液(Iml封閉液加5mllX緩沖液 III) 1OOul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min ；10、取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；11、將玻片放入保濕盒內，加堿性磷酸酶抗體(加入1. SmllX緩沖液III) 1OOul/ 片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min ；12、取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min;13、1X緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加到 30ml IX緩沖液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。四、結果判斷在光鏡下計數100-300個細胞，計算染上紫色細胞的百分比。陽性對照標本加反義雜交液的應該80%以上染上紫色。所有加正義雜交液的陰性內對照應無色。地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優點，還克 服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探 針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察 mRNA的存在和定位，根據染色的細胞數，判斷目的基因的表達量。本發明方法是目前常用的核酸原位雜交技術，該方法通過檢測底物細胞中的 TGFBI基因表達量，用來確定癌癥的預后。臨床研究表明，TGFBI基因在癌癥中低表達，因為 TGFBI基因在正常人高表達，TGFBI基因的低表達說明癌癥，TGFBI基因的表達程度與癌癥 的預后有關，屬負相關，表達愈低預后愈差。從而獲得癌癥的診斷信息。如上所述，當檢測 TGFBI基因表達時，可預測受試者為癌癥情況。本發明實施例采樣為肝癌病人5名，正常對照組5名。抽所有待檢人的外周血 3-5毫升(分離白細胞)做原位雜交。結果表示，所有癌癥轉移病人TGFBI基因不表達，細 胞無染色；正常對照組TGFBI基因有過度表達，細胞染色。具體結果請見圖1，圖2。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為 本發明的保護范圍。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技術(上海)有限公司<120> 一種TGFBI基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用<130>/<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>28050142]<212>DNA0143]〈213〉智人(Homo sapiens)0144]<400>10145]ctccttgcacgggccggcccagcttccccg0146]cttacttaacctggcccgggcggcggaggc0147]ccgtcggtcgctagctcgctCggtgCgCgt0148]tgctggctctcgccctggctctggccctgg0149]agtcgccctaccagctggtgctgcagcaca0150]acgtgtgtgctgtgcagaaggttattggca0151]agtggtaccaaaggaaaatctgtggcaaat0152]gatatgaaaaggtccctggggagaagggct0153]acgagaccctgggagtcgttggatccacca0154]agctgaggcctgagatggaggggcccggca0155]cctgggcctccttgccagctgaagtgctgg0156]tgctcaatgccctccgctaccatatggtgg0157]acggcatgaccctcacctctatgtaccaga0158]atgggattgtaactgtgaactgtgcccggc0159]gggtggtgcacctcatcgataaggtcatct0160]ttgagatcgaggacacctttgagacccttc0161]cgatgcttgaaggtaacggccagtacacgc0162]agatccctagtgagactttgaaccgtatcc0163]tgaacaaccacatcttgaagtcagctatgt0164]tagagaccctggagggcacgacactggagg0165]acgggaaggcgatcatctccaataaagaca0166]ttgatgagctactcatcccagactcagcca0167]atgtgtccacagccattgaccttttcagac0168]gtgagcggttgaccctcctggctcccctga0169]ttgatgcccatacaaggaatttgcttcgga0170]agtatctgtaccatggacagaccctggaaa0171]tttatcgtaatagcctctgcattgagaaca0172]ggtacgggaccctgttcacgatggaccggg0173]atgtcctgaagggagacaatcgctttagca0174]tgacggagaccctcaaccgggaaggagtct0175]tccgagccctgccaccaagagaacggagca0176]acatcctgaaataccacattggtgatgaaa0177]tgcggctaaagtctctccaaggtgacaagc0178]gtgtcaacaaggagcctgttgccgagcctg0179]tcatcaccaatgttctgcagcctccagcca0180]cagactctgcgcttgagatcttcaaacaag
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gacagagccatggtgtgtttgtaataataaaaccaaagaa acata280權利要求
一種TGFBI基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測癌癥疾病藥物中的應用，所述的試劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述的雜交探針序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述的標記物選自放射性核素或非 放射性標記物。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P 中的一種。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述的非放射性標記物選自生物素、地高 辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述的非放射性標記物優選自地高辛。
7.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述的試劑盒還包括增效劑，所述的 增效劑是堿性磷酸酶抗體。
8.—種TGFBI基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其特征在于，所述 的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。
9.一種TGFBI基因的原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a、將權利要求8所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復合體；b、檢測a步驟得到的雜交復合體。
10.根據權利要求9所述的檢測方法，其特征在于a步驟中形成雜交復合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時間為16-24小時，所述的底物選用血液細胞標本或 組織細胞標本。
全文摘要
本發明涉及一種TGFBI基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。本發明還提供了一種TGFBI基因原位雜交檢測方法。另外，本發明還提供了試劑盒在制備檢測癌癥疾病藥物中的應用。本發明優點在于本發明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。本發明的檢測方法操作方便、簡單，能在區級以上醫院普遍使用和推廣。
文檔編號C12Q1/68GK101993948SQ200910056208
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月10日 優先權日2009年8月10日 公開號200910056208.發明者張云福, 裘建英 申請人:芮屈生物技術(上海)有限公司