一種高穩定性的重組羧肽酶b的生產及應用的制作方法

專利名稱：一種高穩定性的重組羧肽酶b的生產及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及一種高穩定性的重組羧肽酶B 的生產及應用。
背景技術：
羧肽酶B在胰腺中含量少，胰腺提取所得的羧肽酶B不能保證去除其它蛋白酶活 性，重組羧肽酶B的生產解決了這一問題，但是在重組羧肽酶B的生產過程中，特別是大腸 桿菌生產過程中，以包涵體的形式，需經進一步的變性復性可獲得活性的羧肽酶B，但其復 性率是影響其規模化生產的瓶頸。很多原核和真核生物的蛋白酶以酶原形式合成，折疊成熟后，前導序列被相應 的蛋白酶識別、切除并降解后，得到有活性的蛋白酶。前導序列作為分子內分子伴侶 (InterMolecular Chaperon, IMC)，其中一類主要參與多肽鏈的延伸和正確折疊，它介導的 蛋白酶折疊特點有IMC在體內與多肽鏈以共價鍵結合，具有高度特異性；在結構及編碼基 因上與它作用的蛋白質緊密相連；IMC可與經它作用后以折疊形式存在的蛋白質(酶)相 互作用，并是其競爭性抑制劑；IMC釋放其作用的“底物”不依賴于ATP水解供能，但依賴于 折疊完成的“底物”或胞內蛋白酶的酶解作用。有些情況下，沒有IMC的存在，蛋白質無法自發地完成折疊過程，這種依賴于前導 序列的蛋白質折疊現象最早是1987年Ikemura等在研究枯草桿菌蛋白酶時發現的。而且 在不同的IMC幫助下，一級結構完全一樣的蛋白質折疊形成的最終構象表現出明顯不同的 酶學特性。大量體內表達、體外重折疊研究結果表明，前導序列的IMC作用并不一定要求它 與其所幫助折疊的蛋白質共價連接在一起，亦即IMC也可以反式地輔助蛋白質完成正確的 折疊與成熟。

發明內容
本發明的目的在于提供一種高穩定性的重組羧肽酶B的生產及應用。在本發明的第一方面，提供一種生產重組羧肽酶B的方法，所述方法包括(1)重組表達N端帶有突變的前導序列的羧肽酶B，獲得包涵體形式的重組蛋白；(2)將步驟(1)獲得的包涵體形式的重組蛋白進行變性和復性，獲得可溶性重組 蛋白(具有正確構象的蛋白)；和(3)切除所述步驟(2)獲得的可溶性重組蛋白N端帶有突變的前導序列的羧肽酶 B的前導序列，獲得重組羧肽酶B (有酶活性)。在一個優選例中，所述的突變的前導序列對應于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列， 其中第19位突變為Asp ；或所述的突變的前導序列對應于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第34位突變 為Gln ；或
所述的突變的前導序列對應于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第55位突變 為Arg ；或所述的突變的前導序列對應于SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，其中第1_5位的 一個或多個氨基酸缺失(包括缺失1、2、3、4或5個氨基酸)。在另一優選例中，步驟(3)中，用胰蛋白酶處理所述N端帶有突變的前導序列的羧 肽酶B的前導序列，從而切除所述突變的前導序列。在另一優選例中，在處理時胰蛋白酶與所述N端帶有突變的前導序列的羧肽酶B 的質量比是1 (5-15)；優選1 10。在另一優選例中，步驟(1)中，采用大腸桿菌重組表達融合蛋白。在另一優選例中，步驟(2)中，采用8 士 2M的尿素進行變性。在另一優選例中，步驟(3)之后，還包括將獲得的重組羧肽酶B在4士2 °C ； 20士 10% (ν/ν)甘油中保存。優選地，將獲得的重組羧肽酶B在4士 1°C;20士5% (ν/ν)甘 油中保存。在本發明的另一方面，提供一種突變的前導序列，所述的突變的前導序列對應于 SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，其中第19位突變為Asp ；或所述的突變的前導序列對應于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第34位突變 為Gln ；或所述的突變的前導序列對應于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第55位突變 為 Arg ；所述的突變的前導序列對應于SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，其中第1_5位的 一個或多個氨基酸缺失(包括缺失1、2、3、4或5個氨基酸)。在本發明的另一方面，提供所述的突變的前導序列的用途，用于與羧肽酶B的N端 連接，促進羧肽酶B的重折疊。在本發明的另一方面，提供一種核酸，所述的核酸編碼所述的突變的前導序列。在本發明的另一方面，提供一種表達載體，所述的表達載體含有所述的核酸。在本發明的另一方面，提供一種遺傳工程化的細胞，所述的細胞含有所述的表達 載體；或其基因組中整合有所述的表達載體。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。


圖1、重組羧肽酶B在含有前導序列(pro(+))及不含前導序列(pro(-))的復性液 中的復性動力學比較。圖2、含有分子內分子伴侶的重組羧肽酶原B的復性過程。圖3、Trypsin酶解proCPB不同時間的Tricine-SDS-PAGE。其中，泳道1 8分 別是酶解20min ；40min ；Ih ；1. 5h ；2h ；2. 5h ；3h ；3. 5h后酶解產物的電泳結果。箭頭所示為 前導肽(pro)。圖4、DEAE_FF連續梯度洗脫電泳圖。泳道1 8分別是連續洗脫管號37 ；38 ；39 ； 40 ；41 ；42 ；43 ；44。
圖5、N-端延長的前導序列抑制羧肽酶的激活。其中，泳道1表示復性液，泳道2 表示復性液酶解后，泳道3表示上清，泳道4表示上清酶解后。圖6、突變后前導序列的編碼基因序列。
具體實施例方式為了解決現有技術中難以重組表達重組羧肽酶B或表達效率不高的技術缺陷，本 發明人經過深入的研究，出乎意料地找到一種生產高活性的重組羧肽酶B的方法。本發明 人采用一種分子內分子伴侶提高了羧肽酶B的體外折疊，該分子內分子伴侶來源于羧肽酶 B的前導序列的突變體或截短體。本發明的方法獲得的重組羧肽酶B穩定性高，可良好地抗 胰蛋白酶酶解。在此基礎上完成了本發明。如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構
成”、“基本上由......構成”、和“由......構成”；“主要由......構成”、“基本上
由......構成”和“由......構成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。羧肽酶B如本文所用，重組羧肽酶B表示通過重組體DNA方法和其他人工方法制備的重組 多肽，它具有與任何天然存在的羧肽酶B相同的或基本上相同的氨基酸序列。羧肽酶原B 是羧肽酶B的前體形式，受胰蛋白酶酶解可被激活成具有活性的羧肽酶原B。任何來源的重組羧肽酶B均可用于本發明。例如，一種鼠源的重組羧肽酶原B是 具有的蛋白序列與GenBank登錄號NP_036665. 1所示的序列基本上相同，其編碼序列如 GenBank登錄號P19223所示的序列基本上相同。其前導序列如SEQ ID NO :2所示。眾所周知，根據已公開的重組羧肽酶B序列，本領域技術人員可以通過PCR擴增等 方法制備重組羧肽酶B的編碼序列，然后將其插入表達載體，進而轉化常見的宿主細胞(如 大腸桿菌)，就可以表達重組羧肽酶B。例如，通過IPTG誘導使得大腸桿菌表達重組羧肽酶 B，然后回收該重組羧肽酶B。突變的前導序列本發明提供了有助于生產高活性的重組羧肽酶B的分子內伴侶，即基于重組羧肽 酶B的前導序列進行改造獲得的突變形式的前導序列或截短體。與采用非改造的前導序列 重組表達獲得的重組羧肽酶B相比，所述經改造的突變的前導序列的編碼分子與重組羧肽 酶B的編碼分子連接后重組表達獲得的重組羧肽酶B具有顯著高的酶活性和穩定性。所述的突變的前導序列為對應于SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，其中第19位 突變為Asp (即除了第19位上突變為Asp，該氨基酸序列其它位點的氨基酸序列與SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列相同)；或對應于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第34位突 變為Gln ；或對應于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第55位突變為Arg ；或對應于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第1-5位的一個或多個氨基酸缺失(包括缺失1、2、3、4 或5個氨基酸)。將突變引入蛋白序列中的方法是本領域人員所熟知的。作為本發明的更優選方式，所述的突變的前導序列為對應于SEQ ID NO :2所示 的氨基酸序列，其中第19位突變為Asp ；或對應于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第 1-5位的5個氨基酸缺失。本發明還提供了編碼所述的突變的前導序列的分離的核酸，也可以是其互補鏈。編碼本發明突變的前導序列的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR擴增的方法獲得。通常可將所述的突變的前導序列的編碼分子連接于成熟的羧肽酶B編碼序列的 5’端；或者，可直接獲得帶有前導序列的羧肽酶B的編碼分子，然后在對應于指定的氨基酸 突變位點的堿基位置引入突變。從而，獲得帶有突變的前導序列的羧肽酶B的編碼序列。在獲得了編碼帶有突變的前導序列的羧肽酶B的DNA序列之后，將其連入合適的 表達載體，再轉入合適的宿主細胞。最后通過培養轉化后的宿主細胞，通過分離純化得到帶 有突變的前導序列的羧肽酶B。因此，本發明還提供了包含編碼所述帶有突變的前導序列的羧肽酶B的核酸分子 的載體。所述的載體還可包含與所述核酸分子的序列操作性相連的表達調控序列，以便于 所述帶有突變的前導序列的羧肽酶B的表達。“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一 種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如 果啟動子控制序列的轉錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。在本發明中，任何合適的載體都可以使用，比如一些用于細菌、真菌、酵母和哺乳 動物細胞的克隆和表達的載體，如Pouwels等，克隆載體實驗室手冊(Elsevier最新版) 中所描述的。可選用本領域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將 編碼所述帶有突變的前導序列的羧肽酶B的DNA序列可操作地連于表達調控序列，形成蛋 白表達載體。在本發明的一種實施方式中，所述的載體為原核載體。此外，含有編碼所述帶有突變的前導序列的羧肽酶B的核酸序列的重組細胞也包 括在本發明中。在本發明中，所述的“重組細胞”通常是原核細胞。常用的原核細胞包括 大腸桿菌、枯草桿菌等；優選的可為大腸桿菌細胞(E. coli)，如大腸桿菌HMS174(DE3)、或 BL21(DE3)。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原 核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的 方法進行。獲得的轉化子可以用常規方法培養，以表達所述帶有突變的前導序列的羧肽酶B。 根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長 的條件下進行培養。生產重組羧肽酶B的方法本發明提供了生產重組羧肽酶B的方法，所述方法包括(1)重組表達N端帶有突 變的前導序列的羧肽酶B，獲得包涵體形式的重組蛋白；(2)將步驟(1)獲得的包涵體形式 的重組蛋白進行變性和復性，獲得可溶性重組蛋白(復性后的蛋白)；和(3)切除所述步驟 (2)獲得的可溶性重組蛋白N端帶有突變的前導序列的羧肽酶B的前導序列，獲得重組活性 羧肽酶B。本發明的方法的特點是先重組表達獲得帶有突變的前導序列的羧肽酶B，經變 復性后將位于N端的前導序列切除，得到高活性的重組羧肽酶B。切除帶有前導序列的羧肽酶B的前導序列、以獲得羧肽酶B的方法是本領域技術 人員熟知的，通常采用一些適合的蛋白內切酶。優選地，采用胰蛋白酶處理所述的融合蛋白，從而切除N端的前導序列。利用胰蛋白酶處理來切除所述的前導序列，其能夠識別Lys 和Arg，在它們的羧基端切開。作為本發明的優選方式，在處理時胰蛋白酶與所述N端帶有突變的前導序列的羧 肽酶B的質量比是1 (5-20)；優選地是1 (5-15)；更優選1 10。作為本發明的優選方式，采用大腸桿菌重組表達所述N端帶有突變的前導序列的 羧肽酶B，最優選的是大腸桿菌BL21 (DE3)。對于表達重組羧肽酶B的大腸桿菌，通過本領域人員常用的破細胞手段(如珠磨 法破碎、液氮研磨破碎、壓力杯法破碎、超聲破碎等)，可以獲得包涵體形式的重組羧肽酶 B。作為本發明的優選方式，采用超聲破碎細胞可以獲得良好的細胞破碎效果。獲得包涵體形式的重組羧肽酶B后，可進一步進行變性和復性，以獲得可溶性的 重組羧肽酶B。對于包涵體的變性和復性的方法沒有特別的限制。優選地，采用8士2M(優 選8M)尿素而不是6M鹽酸胍進行變性。復性優選采用含有IOOmM Gly-NaOH, pH 9.5，GSH ImM,0. ImM ZnCl2 的復性液。獲得的復性的重組羧肽酶B可進一步進行純化，或在激活后進一步進行純化。一 種優選的純化方法為陰離子交換層析法；優選的陰離子樹脂包括DEAE陰離子交換樹脂(如 DEAE-FF陰離子交換樹脂)；優選的純化方法包括連續NaCl梯度洗脫；優選的NaCl洗脫的 濃度范圍為0-0. 5M。為了提高重組羧肽酶B的穩定性，本發明人還研究了其經濟實用的保存方法，結 果發現，將獲得的重組羧肽酶B在4士2°C;20士 10% (體積比)甘油中保存是較為優選的， 其在保存120天后仍然能夠保留100%的酶活性。更優選地，在4士 1°C;20士5% (體積比) 甘油中保存。本發明的主要優點在于(1)本發明人找到了對于重組羧肽酶B非常合適的分子內分子伴侶，有效地提高 了重組羧肽酶B的復性率以及酶活性。(2)本發明的方法獲得的重組羧肽酶B穩定性高，抗胰蛋白酶酶解，液體狀態4°C 放置，1年以上沒有酶活損失。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1、羧肽酶B的重組表達1、帶有前導序列的羧肽酶B (羧肽酶原B)的重組表達設計以下引物正向5，GCGCCA TGG CAT GCT TCC GAG GAG CAC TTT GATGGC-3，(SEQ ID NO 3)，含Nco I限制性酶切位點；
反向5，-CGCAAG CTT TCA CTA ATA TAG ATG TTC TCG GAC ATAATT-3，(SEQ ID NO :4)，含Hind III限制性酶切位點及終止密碼子。以胰腺cDNA文庫(購自Invitrogen)為模板，用前述引物進行PCR擴增獲得帶有 前導序列的羧肽酶B的編碼序列。前述獲得的序列用Nco Ι/HindIII酶切后插入到pET表達載體(購自 Invitrogen)的相應位點中，測序鑒定獲得正確插入的重組表達載體。將該重組表達載體常 規方法轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得轉化子。挑取轉化平板上的單克隆菌落，接種至30mL LB培養液中(含100 μ g/mLAmp)， 置于37°C搖床過夜培養(10 12h)后，以2%接種量轉入二級瓶中，繼續培養。菌密度 至0D600 0. 5 0. 6時，于37°C和12°C下分別加入終濃度0. 5mmol/LIPTG誘導4小時， IOOOOrpm離心收集菌體，棄上清，菌體超聲破碎，離心后獲得包涵體形式的帶有前導序列的 重組羧肽酶B。2、帶有前導序列的羧肽酶B(羧肽酶原B)的包涵體的變性、復性，及激活純化獲得 重組活性羧肽酶B將上述獲得的包涵體用8M尿素按照20mg/ml進行溶解，離心，上清滴加到復性液 (IOOmM Gly-NaOH, pH 9. 5，GSH ImM, 0. ImM ZnCl2)中，至終蛋白濃度為 200μ g/ml，放置復 性24h。調pH8.0，按照1 10(w/w)的比例加入胰蛋白酶，37°C激活2h，測活。測活方法如下以馬尿酰-L-精氨酸(Sigma)為底物，或根據Sigma規定的測定羧 肽酶B的方法。活力單位定義為在0. OOlM的底物濃度下每分鐘的底物水解百分數，測活緩 沖液為0. 025M Tris-HCl，ρΗ7· 65，含 0. IM NaCl。用2Χ 15cm離子交換層析柱，離子交換柱事先用20mM Tris-HCl，pH 8. 0的緩沖液 平衡，然后激活后的復性液上樣，用相同的緩沖液平衡至基線平穩后，用含0 0. 5M NaCl 梯度洗脫，分部收集，測定每管的0D280和酶活，把有酶活的收集液合并，測總酶活和總蛋 白含量。合并酶活高的收集管，即得純化的活性重組羧肽酶B (CPB)。純化結果見圖4。此外，采用相同的方法，但是在復性后不進行胰蛋白酶酶解激活，純化后可得帶有 前導序列的重組羧肽酶B (羧肽酶原B，proCPB)。3、前導序列的制備對不同酶解時間的羧肽酶原B樣品進行Tricine-SDS-PAGE，由圖3可以很清楚地 看到酶解時間為20min時，前導肽(分子量為IOkD)沒有完全酶解；而40min時前導肽濃度 與20min相比，濃度有所降低，此時酶解時間稍微過長，部分前導肽(pro)被消化；繼續延 長酶解時間，在3. 5h時，前導肽幾乎已經完全被酶解消化掉。所以，當胰蛋白酶和羧肽酶原 B (proCPB)質量比為1 140，37°C酶解時，選取30min為最佳酶解時間。為了制備大量的前導肽，本發明人選取最佳酶解比例和時間，對羧肽酶原B復性 液酶解，然后進行陰離子交換層析，利用連續濃度梯度洗脫，獲得前導肽。測定蛋白濃度為 0. lmg/ml04、N端添加6個組氨酸的帶有前導序列的羧肽酶原B的重組表達重組表達方法同前述“1”，不同點在于，通過引物設計在對應帶有前導序列的羧肽 酶原B的N端的編碼序列之前加上編碼6個組氨酸的一段編碼序列，獲得N端添加6個組 氨酸的帶有前導序列的羧肽酶原B的編碼序列。
N端添加6個組氨酸的帶有前導序列的羧肽酶原B的重組表達同前述“1”。5、N-端前導序列突變的羧肽酶原B突變體的重組表達重組表達方法同前述“1”，不同點在于，羧肽酶原B的N-端前導序列突變為如下 序列按照實施例1中的序列進行突變，選擇的位點為第19位由甘氨酸(G)突變為谷氨 酸(D)，該突變后前導序列的編碼基因(SEQ ID NO 1)見圖6 ；第2位由丙氨酸㈧突變為 組氨酸(H)；第34位由谷氨酸(E)突變為谷胺酰胺(Q)；第49位由亮氨酸(L)突變為組氨 酸(H)；第55位由組氨酸(H)突變為精氨酸(R)。所述突變通過設計突變引物以及PCR擴 增來實現。N-端前導序列突變的羧肽酶原B突變體的重組表達同前述“1”。實施例2、前導序列作為分子間分子伴侶對羧肽酶B折疊的作用lmg/ml的純化后所得重組羧肽酶B，在8M尿素中變性2h后，直接10倍稀釋到復 性緩沖液(IOOmM Gly-NaOH, pH 9.5，GSH ImM,0. ImM ZnCl2)中，此時復性緩沖液中的蛋白 終濃度為0. lmg/ml。從稀釋復性開始計時，每間隔一定時間取樣0. Iml測活。100%酶活定 義為原酶液(lmg/ml)直接在pH9. 5,0. IMGly-NaOH稀釋10倍的活力。活性測定以馬尿酰-L-精氨酸為底物，活力單位定義為在0. OOlM的底物濃度下每 分鐘的底物水解百分數，測活緩沖液為0. 025M Tris-HCl，ρΗ7· 65，含0. IM NaCl。按照摩爾比CPB pro = 1 1，將前導序列(pro)加入到復性液中，之后將變性 CPB滴加到復性液中，其余步驟同上述。圖1為重組羧肽酶B在含有及不含有前導序列的復性液中的復性動力學。重組羧 肽酶B在8M尿素中變性2h后滴加到復性液中開始復性。0時的活力正好與圖中CPB在8M 尿素中變性2h時的活力相當。在整個復性過程中，羧肽酶B在加與不加前導序列的復性液 中，活力基本沒有明顯區別；由此可見，復性液中加入小分子前導序列對于重組羧肽酶B來 說并沒有促進重折疊，也就是說，前導序列不能作為分子外伴侶對羧肽酶B的復性起作用。 為了進一步確證這一結果，本發明人把活性CPB在8M尿素中變性24h，使活力完全喪失，然 后重復以上復性過程，經過24h復性后測定酶活，依然未檢測到活性。這就進一步說明，對 于CPB來說，加入分子間分子伴侶對其活力恢復沒有幫助，同時也說明了，當CPB完全變性 后，本身不能自發復性。實施例3、前導序列作為CPB的分子內分子伴侶對羧肽酶B的復性作用0. 5mg/ml的復性純化后的酶原proCPB(即帶有前導序列的重組羧肽酶B，復性后 未經胰蛋白酶酶解激活，純化后所得)在8M尿素中變性24h后，直接5倍稀釋到復性緩沖 液中，室溫復性，此時終蛋白濃度為0. lmg/ml。從稀釋復性開始計時，每間隔一段時間取 lml，立刻加入胰蛋白酶酶解激活，其中羧肽酶原B 胰蛋白酶的質量比為10 1，37°C保溫 40min后，測定CPB活性。100%酶活定義為原酶液(lmg/ml)直接在稀釋5倍后，相同方法 酶解激活后測定的活力。包涵體形式的酶原(即帶有前導序列的重組羧肽酶B)在8M尿素中變性24h后，其 活性的天然結構完全喪失。經過復性，活力在7h內即可恢復，之后稍微下降，并趨于穩定， 最終活力恢復了約25%，見圖2。由此可見，對于CPB來說，分子內前導序列的存在可幫助 CPB重折疊，使其恢復活力，而前導序列不能作為分子間分子伴侶起作用。實施例4、N-端延長的前導序列抑制羧肽酶的激活
N端添加6個組氨酸的帶有前導序列的羧肽酶原B的激活測定方法同前述實施例 3中對帶有前導序列的重組羧肽酶B的激活測定。結果發現，羧肽酶原B前導序列N端加6個組氨酸不能被激活。見圖5。復性液在43KDa處有條帶，復性液經胰蛋白酶酶解后在35KDa處有條帶， 上清和上清酶解后均在43KDa處有條帶。實施例5、N-端的前導序列突變體增加羧肽酶B的激活胰蛋白酶的激活方法如下測定復性液中蛋白含量，根據蛋白含量按照 10 l(w w)的比例加入胰蛋白酶，37°C酶解2小時測活。酶活性的測定同前述實施例1中。結果見表1。表 權利要求
一種生產重組羧肽酶B的方法，其特征在于，所述方法包括(1)重組表達N端帶有突變的前導序列的羧肽酶B，獲得包涵體形式的重組蛋白；(2)將步驟(1)獲得的包涵體形式的重組蛋白進行變性和復性，獲得可溶性重組蛋白；和(3)切除所述步驟(2)獲得的可溶性重組蛋白N端帶有突變的前導序列的羧肽酶B的前導序列，獲得重組羧肽酶B。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的突變的前導序列對應于SEQID NO 2所示的氨基酸序列，其中第19位突變為Asp ；或所述的突變的前導序列對應于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第34位突變為 Gln ；或所述的突變的前導序列對應于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第55位突變為 Arg ；或所述的突變的前導序列對應于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第1-5位的一個 或多個氨基酸缺失。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，用胰蛋白酶處理所述N端帶有 突變的前導序列的羧肽酶B的前導序列，從而切除所述突變的前導序列。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，在處理時胰蛋白酶與所述N端帶有突變的前 導序列的羧肽酶B的質量比是1 (5-15)。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，采用大腸桿菌重組表達融合蛋白。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，采用8士2M的尿素進行變性。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)之后，還包括將獲得的重組羧肽 酶B在4士2°C ；20士 10% (ν/ν)甘油中保存。
8.一種突變的前導序列，其特征在于，所述的突變的前導序列對應于SEQID Ν0:2所示 的氨基酸序列，其中第19位突變為Asp ；或所述的突變的前導序列對應于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第34位突變為 Gln ；或所述的突變的前導序列對應于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第55位突變為Arg ；所述的突變的前導序列對應于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其中第1-5位的一個 或多個氨基酸缺失。
9.權利要求8所述的突變的前導序列的用途，其特征在于，用于與羧肽酶B的N端連 接，促進羧肽酶B的重折疊。
10.一種核酸，其特征在于，所述的核酸編碼權利要求8所述的突變的前導序列。
全文摘要
本發明涉及一種高穩定性的重組羧肽酶B的生產及應用。公開了一種生產重組羧肽酶B的方法，所述方法包括(1)重組表達N端帶有突變的前導序列的羧肽酶B，獲得包涵體形式的重組蛋白；(2)將包涵體形式的重組蛋白進行變性和復性，獲得可溶性重組蛋白；和(3)切除所述可溶性重組蛋白N端帶有前導序列的羧肽酶B的前導序列，獲得重組羧肽酶B。本發明采用一種分子內分子伴侶提高了羧肽酶B的體外折疊，獲得的重組羧肽酶B穩定性高，可良好地抗胰蛋白酶酶解。
文檔編號C12N15/12GK101967467SQ20091005549
公開日2011年2月9日 申請日期2009年7月28日 優先權日2009年7月28日
發明者馮矗, 趙致 申請人:上海雅心生物技術有限公司