用于妊娠高血壓綜合癥檢測(cè)的hsa-mir-210試劑盒及檢測(cè)方法

專利名稱：用于妊娠高血壓綜合癥檢測(cè)的hsa-mir-210試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，是一種通過血漿或血清中 hsa-mir-210的含量變化，來檢測(cè)妊娠高血壓綜合癥發(fā)生發(fā)展的試劑 盒，及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
妊娠高血壓綜合癥(妊高癥)是一個(gè)由于多系統(tǒng)紊亂而導(dǎo)致的妊 娠期特有疾病，多發(fā)生于妊娠20周之后。臨床表現(xiàn)為高血壓、蛋白 尿、水腫，嚴(yán)重者有頭痛、頭暈、視物模糊等自覺癥狀，若沒有及時(shí) 治療，可能會(huì)引起全身性痙攣甚至昏迷，也會(huì)造成腎臟、肝臟和大腦 的機(jī)能紊亂及凝血紊亂，是目前孕、產(chǎn)婦和胎、嬰兒死亡的主要因素 之一，其中子癇迄今仍是孕產(chǎn)婦死亡的首要因素。
妊高癥目前的檢測(cè)方法主要依靠臨床上已出現(xiàn)的癥狀同時(shí)結(jié)合 一些生化指標(biāo)進(jìn)行，而實(shí)際上妊高癥病因早在婦女懷孕初期即存在， 因此臨床上缺少通用的早期檢測(cè)標(biāo)志物用來早期檢測(cè)和干預(yù)該病。
MicroRNAs (miRNAs)是一種大小約21-23個(gè)堿基的單鏈小分子 RNA，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過 Dicer酶加工后生成，通過與靶基因的非編碼區(qū)結(jié)合抑制翻譯來調(diào)控 基因的表達(dá)。miRNAs參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，包括早期 發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡、脂肪代謝和細(xì)胞分化，因此 miRNAs可能有非常廣泛多樣的生物功能。同時(shí)，在不同組織、不同 發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNAs表達(dá)模式具有 分化的位相性和時(shí)序性，提示miRNAs有可能作為參與調(diào)控基因表達(dá) 的分子，因此具有重要意義。有研究證實(shí)，miRNA在血漿中非常穩(wěn) 定，它們通過一些小分子微顆粒被有效保護(hù)以免接觸RNases，在變 化環(huán)境的條件下仍能保持穩(wěn)定。目前有研究表示，胎盤中存在著大量 的miRNA，這提示著它們?cè)谔ケP中的表達(dá)方式很可能對(duì)胎盤-胎兒的
3生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的作用。
has-mir-210 (Mature sequence MIMAT0000267)是一種在人的胎 盤中特異性表達(dá)的microRNA，同時(shí)在缺氧的情況下，其含量急劇升 高(Fos"a"ara尸，D'^4/e^a"(ira K Dz' K Me/c/n'o朋a尺i 簡(jiǎn)朋/ 5*'
ewdc^/ze/Za/ ce〃 msporae to /^coc/a朋(i /w緣/fe //ze rece/ tor zyms7'we
20朋M.)。研究顯示，妊高癥發(fā)生的要素之一正是由于胎 盤缺氧，胎兒與母體的物質(zhì)交換發(fā)生障礙，從而導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡 明顯增加，引發(fā)下游一系列的調(diào)控機(jī)制改變(F勵(lì)er57. 777e;^cewto/
s，/ to臘preec/amp由.7 e/ ra(i所o/五wt/ocn.wo/. 2(9045;2:53.)。 目前并沒有任何關(guān)于將has-mir-210作為檢測(cè)妊高癥發(fā)生發(fā)展標(biāo) 志物的相關(guān)報(bào)道。鑒于研究者在人體外周血中檢測(cè)到microRNA并證 實(shí)它能夠保持穩(wěn)定，

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于妊娠高血壓綜合癥檢測(cè)的 hsa-mir-210試劑盒，及其檢測(cè)方法。
本發(fā)明擬通過檢測(cè)在健康孕婦與妊高癥孕婦外周血中 has-mir-210的表達(dá)含量差異，來檢測(cè)妊高癥及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展， 以期提早干預(yù)，盡早緩解患者及胎兒可能存在的危險(xiǎn)。
本發(fā)明的檢測(cè)妊娠高血壓綜合癥發(fā)生發(fā)展的hsa-mir-210檢測(cè)試 劑盒，是通過檢測(cè)血漿或血清中的hsa-mir-210含量的變化，從而能 夠更加有效的對(duì)妊娠高血壓綜合癥患者進(jìn)行早期檢測(cè)，以及早發(fā)現(xiàn)妊 高癥的高危對(duì)象，及時(shí)進(jìn)行有效干預(yù)，減少妊高癥及其相關(guān)并發(fā)癥的 發(fā)生。
本發(fā)明通過對(duì)健康人群與妊高癥患者血漿中hsa-mir-210的含量 比較；以及對(duì)妊娠期高血壓、輕度先兆子癇、重度先兆子癇三種不同 病情的妊高癥患者血漿中hsa-mir-210的含量比較，發(fā)現(xiàn)妊娠期高 血壓患者血漿中hsa-mir-210含量高于健康人群，約是健康人群的2倍；輕度先兆子癇患者血槳中hsa-mir-210含量明顯高于健 康人群，約是健康人群的5倍左右，病情發(fā)展到重度時(shí)，血漿當(dāng)中 hsa-mir-122的含量最高，約是健康人群的7倍左右。這個(gè)結(jié)果顯示了 隨著妊高癥病情發(fā)展，hsa-mir-210的含量從低變高的變化過程，這一 趨勢(shì)可作為妊娠高血壓綜合癥的早期檢測(cè)手段。
本發(fā)明提供一種早期預(yù)測(cè)妊娠高血壓綜合癥的hsa-mir-210檢測(cè) 試劑盒，該試劑盒由反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、引物系統(tǒng)和擴(kuò)增系統(tǒng)組成，其中的 引物系統(tǒng)由特異性的hsa-mir-210反轉(zhuǎn)錄引物及Real-time PCR的上、 下游引物組成。 hsa-mir-210反轉(zhuǎn)錄引物為
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC TCAGCCGCT (SEQ ID NO: 1);
Real-time PCR上游引物為ACGATGCTGTGCGTGTGAC (SEQ ID NO:2);
Real-time PCR下游引物為GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQ ID NO:3)。
本發(fā)明試劑盒的引物是根據(jù)己知的生物信息學(xué)査得hsa-mir-210 的成熟體序歹U而設(shè)計(jì)的(詳見http:〃microrna.Sanger.ac.uk/sequences/)， 包括其特異性的反轉(zhuǎn)錄引物、Real-time PCR的上下游引物均通過 Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)。
hsa-mir-210的成熟體序列CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA (SEQ ID NO:4)
上述試劑盒的反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄體系緩沖液和R N A酶抑制劑組成，擴(kuò)增系統(tǒng)由SYBRPremixExTaqTM試劑組成。 本發(fā)明的試劑盒，具體組成如下
A) hsa-mir-210反轉(zhuǎn)錄引物(SEQIDNO:l)， 1管，濃度:IO (iM ， 100^1/ 管；
B) Real-time PCR上游引物(SEQ ID NO:2 ) ， 1管,濃度:10(iM， 100^1/ Real-time PCR下游引物(SEQ ID NO:2)， 1管,濃度:10)iM， 100(il/
管；C) Trizol reagent (總RNA提取試劑)，1管，200(^1/管
D) 氯仿 1管，500)!l/管；
E) 無水乙醇 1管，7ml/管；
F) DEPCH20 (經(jīng)焦炭酸乙二酯處理的純水)l管，1000(!l/管
G) ddH20 (雙蒸水)l管，2000^1/管。 使用本發(fā)明試劑盒早期檢測(cè)妊娠高血壓綜合癥，首先，將若干已
知的健康人、妊高癥患者編組，用本發(fā)明試劑盒分別檢測(cè)健康人組、 妊高癥患者組血清中hsa-mir-210含量，以此作為對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)。 再用相同的方法檢測(cè)未知患者血漿中hsa-mir-210含量，對(duì)照上述標(biāo) 準(zhǔn)數(shù)據(jù)，即可初步確定該患者是否為健康人，若非健康人群，則了解 其患病程度如何，以便進(jìn)一步確診治療。
本發(fā)明還提供上述妊高癥的hsa-mir-210檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法， 如下
按常規(guī)抽血取血清或血漿，用總RNA提取試劑處理血清或血漿， 加氯仿離心后取上層水相，并富集血清或血漿中的小RNA;由反轉(zhuǎn) 錄系統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄hsa-mir-210成cDNA;用擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行Real-time PCR 擴(kuò)增，測(cè)定hsa-mir-210含量。


圖1:定量RT-PCR驗(yàn)證健康孕婦與妊高癥孕婦血漿中has-mir-210的
差異表達(dá)柱狀圖2:定量RT-PCR驗(yàn)證不同分期的妊高癥孕婦間血漿中has-mir-210
的差異表達(dá)柱狀圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的實(shí)施 不僅限于此。
實(shí)施例l:制備本發(fā)明的試劑盒(供一人用)
本發(fā)明的試劑盒組成如下
1.反轉(zhuǎn)錄引物l管，100^il/管濃度:10iiM反轉(zhuǎn)錄引物為TCAGCCGCT
2. Real-time PCR的上、下游引物各l管 ，100|11/管濃度:10pM; 上游引物為ACGATGCTGTGCGTGTGAC 下游弓I物為GTGCAGGGTCCGAGGT
本發(fā)明根據(jù)已知的生物信息學(xué)査得hsa-mir-210的成熟體序列 CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA ，其特異性的反轉(zhuǎn)錄引物、 Real-time PCR的上下游引物均通過Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，由 美國(guó)invitrogen公司負(fù)責(zé)引物合成。 設(shè)計(jì)的引物序列如下
(1) 反轉(zhuǎn)錄引物
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACG ACTCAGCCGCT (SEQIDNO:l)
(2) Real-time PCR的上下游引物
上游引物ACGATGCTGTGCGTGTGAC (SEQIDNO:2) 下游弓l物GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQIDNO:3)
制備包括下列組成成分的試劑盒總RNA提取試劑、氯仿、無 水乙醇、特異性hsa-mir-210反轉(zhuǎn)錄引物(100)al/管濃度:IO jiM)、 特異性的hsa-mir-210上游引物(100)al/管濃度:IO pM)、下游引物 (100^1/管濃度:IO pM)、 DEPC H20 (1000(xl/管)、dd H20 (2000(^1/ 管)
DEPC H20的配置用購(gòu)買的DEPC (焦碳酸二乙酯)，純度〉9 9。/。，密度為1. 12g/ml，配置DEPC H20。 100ml MUiQ純水中加0. lmlDEPC，放在100ml干烤過的容量瓶中靜置4小時(shí)后高壓滅菌， 制成千分之一濃度的DEPC H20，經(jīng)檢測(cè)不含RNase、 DNase和p roteinase。用來溶解合成的反轉(zhuǎn)錄引物，并作為反轉(zhuǎn)錄時(shí)的稀釋 用水。
3. Trizol reagent
4. 氯仿
5. 無水乙醇
6. DEPC H20
7. dd H20
l管 1管 l管 l管 1管
2000nl滑
500^1/管
7ml/管
1000(al/管 2000fil/管。
7ddH20的配置MiliQ純水經(jīng)高壓滅菌后，配置成Real-time PCR用的dd H20。
特異性hsa-mir-210反轉(zhuǎn)錄引物通過Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè) 計(jì)，由美國(guó)invitrogen公司負(fù)責(zé)引物合成，純度為PAGE級(jí)，合成后 的引物用DEPC HbO溶解，終濃度為lO(iM。
特異性的hsa-mir-210上下游引物通過Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件 設(shè)計(jì)，由美國(guó)invitrogen公司負(fù)責(zé)引物合成，純度為PAGE級(jí)，合成 后的引物用dd H20溶解，終濃度為10pM。 實(shí)施例2:本發(fā)明的試劑盒的檢測(cè)
一、 釆集血漿樣本及樣本準(zhǔn)備
由于血漿具有取材方便，無創(chuàng)傷性，并可連續(xù)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，因 此從血漿中檢測(cè)妊娠高血壓綜合癥的生物標(biāo)志物可以將檢測(cè)妊高癥 技術(shù)提高到一個(gè)新的水平，從而達(dá)到早預(yù)防、早治療的目的。
血漿樣本分別在上海長(zhǎng)海醫(yī)院婦產(chǎn)科和安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬 醫(yī)院婦產(chǎn)科采集，并分為以下四組(1)妊娠高血壓孕婦(n=10); (2)輕度先兆子癇孕婦(n=10) ; (3)重度先兆子癇孕婦(n二10); (4)健康孕婦作為對(duì)照組(n=10)。所有患者與健康孕婦的孕周差 異不超過2周，臨床診斷均符合國(guó)際上對(duì)于妊高癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)。
樣品的收集收集約4ml病人的外周血加入含50mmol EDTA抗 凝劑的試管中，離心處理。
二、 采集血漿樣本的處理及提取其中的小RNA:
(1) 血漿樣本的處理 外周血樣品采取兩步離心法，在4。C的條件下，首先以
1600g/10min離心，將上清液加入新的離心管中，再以16000g/10min 離心，取上清液并以1:0.8的比例加入Trizol reagent (即0.8ml血漿中 力口入1 ml Trizol reagent)。
(2) microRNA的提取
將已添加Trizol reagent的樣本混勻，放置冰上15min后，在4°C 的條件下以1000g/10min離心，取上清，添加入1.5ml的EP管中， 并以l: 0.25的比例加入氯仿(即lml上清中加入400ul氯仿)，搖晃混勻，放置冰上10min左右，在4。C的條件下以12000g /15min離 心，取上層水相。之后的步驟參照Applied Biosystems公司購(gòu)買的 m/r&朋miRNAIsolation Kit說明書中提取miRNA的步驟進(jìn)行。使用 Eppendorf紫外分光光度儀測(cè)定RNA的A260值和A260/A280的比值 (1.8-2.2)，以評(píng)估其濃度和質(zhì)量。符合定量檢測(cè)要求的樣本進(jìn)行下 一步反應(yīng)。
三、miRNA的實(shí)時(shí)定量
1. 反轉(zhuǎn)錄成hsa-mir-210的cDNA
取富集液50ng為模板，以設(shè)計(jì)的特異性hsa-mir-210反轉(zhuǎn)錄引物 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按照5xPrimeScriptTM Buffer (for Real Time) 4 pi 、 PrimeScriptTMRT Enzyme Mix 0.5卩1 ( PrimeScriptTM RT reagent Kit) (TaKaRa公司)、hsa-mir-122反轉(zhuǎn)錄引物0.5卩1 、富集的小RNA50ng、 DEPC H20 (補(bǔ)充H2O使總體積達(dá)到20vi1)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以上步驟 所用的tip頭、EP管均經(jīng)過DEPC水處理后高壓滅菌。
2. Real-time PCR定量miRNA
采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM試劑和美國(guó)Applied Biosystems公司的Step Plus One實(shí)時(shí)定量PCR儀，按照下述體系進(jìn) 行PCR反應(yīng)
Premix Ex Taq1M ( 2 X ) 上游引物(10 pM) 下游引物(IOjiM) ROX Reference Dye (50X)
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物
雙蒸水
總體系
10 ^
0.4 pl(終濃度0.2 pM) 0.4 pl(終濃度0.2 pM) 0.4 ^
<formula>formula see original document page 9</formula>
經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確立了 hsa-mir-210引物的合適退火溫度，最終確定 以下條件
<formula>formula see original document page 9</formula>本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物倍比稀釋法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，每20pl
體系分別添加標(biāo)準(zhǔn)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2， 1, 0.5, 0.25, 0.125^，每種濃度設(shè)立3 個(gè)平行復(fù)管。
按照上述Real-time PCR條件，對(duì)前期制備的各樣本的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物進(jìn)行檢測(cè)。每批次PCR均設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)曲線作為批次間參照，并依據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)立CT值閾值。每樣本均做3個(gè)平行復(fù)管，取其平均值分 析，每個(gè)PCR測(cè)定中都包括陰性(水)對(duì)照。為防止污染，所有反 應(yīng)均在專區(qū)的清潔實(shí)驗(yàn)臺(tái)進(jìn)行，模板添加和引物添加不在同區(qū)操作。 為防止引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，所有反應(yīng)均在冰上操作。
獲得的各樣本hsa-mir-210表達(dá)量均由標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換為相對(duì)定量 值，目標(biāo)基因表達(dá)量/持家基因U 6表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)歸一化處理。最 終獲得比值進(jìn)行比較和統(tǒng)計(jì)分析。通過2—^"法計(jì)算hsa-mir-210在妊 娠高血壓綜合癥患者血漿當(dāng)中的相對(duì)表達(dá)量，妊高癥患者血漿中 hsa-mir-210的表達(dá)平均水平均為健康人表達(dá)水平的倍數(shù)，健康人外周 血中的hsa-mir-210量視為1 。
實(shí)施例3:健康孕婦與妊高癥孕婦相比血漿中mir-210含量的比較
將采集的所有妊高癥孕婦血漿中has-mir-210與健康孕婦血漿中 的has-mir-210作比較，采用t檢驗(yàn)，結(jié)果PO.05,認(rèn)為妊高癥孕婦血 漿中has-mir-210的平均含量高于健康孕婦。(見圖1) 實(shí)施例4:三種不同病情的妊高癥孕婦血漿中mir-210的含量比較 我們選擇了 3類不同病情發(fā)展情況的妊高癥孕婦妊娠高血壓孕
婦、輕度先兆子癇孕婦、重度先兆子癇孕婦。分別對(duì)這3種類型病人 血漿中的hsa-mir-210進(jìn)行檢測(cè)，與健康人群血漿中hsa-mir-210比較 后發(fā)現(xiàn)，妊高癥孕婦血槳中hsa-mir-210含量高于健康人群，約是健 康人群的3倍左右。病情發(fā)展到輕度先兆子癇時(shí)，血漿當(dāng)中 hsa-mir-210的含量隨之升高，約是健康人群的5倍左右(P<0.05)。 當(dāng)發(fā)展成為重度后，hsa-mir-210含量最高，但平均含量約是健康人 群的7倍左右(P0.05)(見圖2)。SEQUENCE LISTING
<110>中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
<120>用于妊娠高血壓綜合癥檢測(cè)的hsa-mir-210試劑盒及檢測(cè)方法 〈130〉說明書，權(quán)利要求書
〈160> 4
〈170> Patentln version 3.1
<210> 1
〈211〉 53
〈212> 腿
<213>人工序列
〈400〉 1
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactcagcc get 53
<210> 2 <211> 19 〈212> 腿 〈213〉人工序列 <400> 2
aegatgetgt gcgtgtgac 19
<210> 3 〈211〉 16 <212> DNA 〈213>人工序列 〈400〉 3
gtgcagggtc cgaggt 16
<210〉 4 〈211> 22 <212> ■ <213>人工序列 〈400〉 4
eugugegugu gaeageggcu ga 22
1權(quán)利要求
1、一種用于妊娠高血壓綜合癥檢測(cè)的hsa-mir-210試劑盒，其特征在于該試劑盒包括hsa-mir-210反轉(zhuǎn)錄引物，序列如SEQ ID NO1所示；Real-time PCR上游引物，序列如SEQ ID NO2所示；Real-time PCR下游引物，序列如SEQ ID NO3所示。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于妊娠高血壓綜合癥檢測(cè)的 hsa-mir-210試劑盒，其特征在于該試劑盒主要由以下試劑組成A) hsa-mir-210反轉(zhuǎn)錄引物，序列如SEQIDNO:l所示，1管，濃度:IO， 10(Vl/管；B) Real-timePCR上游引物，序列如SEQIDNO:2所示，1管，濃度:IO^M， 100|11/管；Real-time PCR下游引物，序列如SEQIDNO:3所示，1管，濃度:IO ^M， 100nl/管；C) Trizol reagent, 1管，200(Hil/管；D) 氯仿，1管，500pl/管；E) 無水乙醇，1管，7ml/管；F) DEPCH20 ，l管，1000|11/管；G) ddH20 ， 1管，2000jil/管。
3、 一種如權(quán)利要求1所述的用于妊娠高血壓綜合癥檢測(cè)的 hsa-mir-210試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于該檢測(cè)方法包括以下步 聚按常規(guī)抽血取血清或血漿，用總RNA提取試劑處理血清或血漿， 加氯仿離心后取上層水相，并富集血清或血漿中的小RNA;由反轉(zhuǎn) 錄系統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄hsa-mir-210成cDNA;用擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行Real-time PCR 擴(kuò)增，測(cè)定hsa-mir-210含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。妊娠高血壓綜合癥是目前孕、產(chǎn)婦和胎、嬰兒死亡的主要因素之一，目前的檢測(cè)方法主要依靠臨床上已出現(xiàn)的癥狀同時(shí)結(jié)合一些生化指標(biāo)進(jìn)行，而實(shí)際上妊高癥病因早在婦女懷孕初期即存在，臨床上缺少早期檢測(cè)標(biāo)志物用來早期檢測(cè)和干預(yù)該病。本發(fā)明的目的在于提供一種用于妊娠高血壓綜合癥檢測(cè)的hsa-mir-210試劑盒，及其檢測(cè)方法。本發(fā)明是通過檢測(cè)血漿或血清中的hsa-mir-210含量的變化，從而能夠更加有效的對(duì)妊娠高血壓綜合癥患者進(jìn)行早期檢測(cè)，以及早發(fā)現(xiàn)妊高癥的高危對(duì)象，及時(shí)進(jìn)行有效干預(yù)，減少妊高癥及其相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101643785SQ20091005335
公開日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月18日
發(fā)明者孫樹漢, 毅 張, 費(fèi)明鈺, 音 賈 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)