專利名稱：昆蟲桿狀病毒表達系統及用其表達e2蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種重組的昆蟲桿狀病毒表達盒，含有它的 病毒，以及使用該病毒表達重組丙肝病毒蛋白E2的方法。
背景技術：
丙型肝炎病毒(HCV)為具包膜的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒家族。HCV是已 知唯一能造成慢性感染的RNA病毒(除逆轉錄病毒外)，據估計，目前全球約1.7億HCV 感染者中，60 % -80 %為慢性攜帶者，而持續性感染最終發展為肝硬化/肝癌的機率高達 3.5% -20%。如此高比例的慢性感染率意味著在可能的病毒免疫逃逸機制下，機體往往無 法激發或維持有效的抗病毒免疫反應。越來越多的證據表明，使細胞免疫在其中發揮主要 作用，即在感染早期建立針對多個HCV抗原表位、多特異性的CD8CTL和CD4Th細胞的強細 胞免疫屏障，對于急性感染的控制與病毒清除至關重要。HCV基因組長約9. 6kb，編碼一個長約3000個氨基酸殘基的多聚蛋白前體，在宿主 信號肽酶和病毒自身編碼蛋白酶的作用下生成4種結構蛋白(C、El、E2、p7)和6種非結構 蛋白(NS2-NS5B)，其中E1、E2為包膜糖蛋白，是中和抗體的主要靶抗原。El和E2都屬于I 型整合膜蛋白，包括一個較大的N端膜外區和一個C端疏水性跨膜結構域。在其各自N端上 游信號肽的引導下，定位于內質網膜上完成高度的N-糖基化，并被宿主信號肽酶切割后， 非共價結合形成成熟的異源二聚體滯留于內質網上，在病毒萌出時與膜結構一同包裹在病 毒表面。E1/E2的這種天然構象與修飾在病毒與細胞受體結合、細胞膜融合及進入細胞等病 毒感染過程中起著至關重要的作用目前對HCV受體及其與HCV包膜蛋白的相互作用仍所知有限。已知可能的受體 分子包括四跨膜蛋白家族成員⑶81，B族I型清道夫受體(SR-BI)，低密度脂蛋白受體(LD L. R)以及甘露糖結合凝集素L-SIGN和DC-SIGN，而E2蛋白則是與他們直接相互作用的亞 單位。其中，體外和體內實驗也已證實CD81和SR-BI在HCV侵入過程中發揮著直接作用， E2蛋白上和他們相互作用的位點信息也被逐漸確認。對HCV受體和病毒侵入機制的進一步 研究對于HCV疫苗和特異性藥物的研制具有重要意義。鑒于E2蛋白與受體結合的機理，通過大量表達接近天然構型的E2蛋白，免疫篩選 得到針對E2蛋白受體結合表位的中和抗體，注入體內，即可阻斷E2蛋白與細胞受體的結合 路徑，從而起到治療丙肝的目的。通常制備抗原所采用的系統是原核表達系統，原核表達系統具備高通量表達、易 于擴大再生產、低成本、菌體繁殖迅速、無轉錄后修飾和表達蛋白可被標記等優點，然而原 核系統表達出的蛋白往往缺乏較好的空間構型和基本的糖基化修飾，與天然蛋白相差甚 遠，這導致在某些情況下用原核系統表達的蛋白免疫動物所制備的單抗識別天然表位能力 低，對篩選中和性抗體不利，而不能用來開發治療性抗體。同時，由于病毒蛋白的特殊性，采 用大腸桿菌(如BL21)原核系統表達，E2在表達過程中會在很大程度上被降解。因此，開發針對E2蛋白的丙肝治療性抗體，迫切需要一種可以大量穩定表達接近天然E2的方法。Bac to Bac系統是最新發展的昆蟲細胞一桿狀病毒表達系統之一，是利用轉移載 體PFastBac轉化含有桿狀病毒穿梭載體Bacmid的大腸桿菌DHlOBac，外源基因通過位點特 異性轉座作用整合到Bacmid中。Bacmid含有完整的昆蟲多角體桿狀病毒AcMNPV基因組， 既能在大腸桿菌中低拷貝復制和穩定分離，又可以直接轉染昆蟲細胞，得到病毒粒子，經過 篩選重組Bacmid，直接轉染昆蟲細胞，得到純的重組病毒，同時高效表達外源基因。該昆蟲 系統具有同大多數高等真核生物相似的翻譯后修飾、加工以及轉移外源蛋白的能力，同時 表達的蛋白水平高達1 500mg/L，高于哺乳動物細胞表達量。然而，仍然需要能夠在生產過程中便于分離純化的重組蛋白質，和能夠大規模生 產的培養方法。
發明內容
因此，本發明的目的是提供一種能夠成功表達HCV E2蛋白的重組病毒，并用其大 規模生產重組蛋白的方法。在本發明的一個方面，提供了一種重組桿狀病毒，其保藏在中國典型培養物保藏 中心，保藏號為 CGMCC No. CTCC-V200909。在該方面的一個實施例中，該病毒含有重組表達盒，所述重組桿狀表達盒含有病 毒多角體蛋白啟動子P10、GP67信號肽序列、E2蛋白編碼序列、凝血酶酶切位點接頭、人源 IgG-Fc 編碼序列、和 Sv40PolyA。在該方面的一個優選例中，GP67信號肽位于多角體蛋白和E2蛋白編碼序列之間。 在該方面的另一個優選例中，凝血酶酶切位點接頭和人源IgG-Fc編碼序列依次連接在所 述E2蛋白編碼序列下游。在該方面的一個優選例中，E2蛋白編碼序列編碼SEQ ID NO :2的E2蛋白。E2蛋 白也可以是其重組形式，或與其具有至少70%以上，優選80%以上，優選90%，優選95%以 上的相同性的重組E2功能性蛋白。也可以是其任何具有E2功能的片段。在本發明的另一個方面，提供了一種生產重組E2蛋白的方法，包括以下步驟用上述重組桿狀病毒感染昆蟲細胞，分離純化產生的重組E2蛋白。在該方面的一個優選例中，昆蟲細胞通過重復懸浮培養除去抱團細胞。在該方面的另一個優選例中，昆蟲細胞是highfive昆蟲細胞。也可使用任何與桿 狀病毒相容的其它昆蟲細胞，或甚至原核或其它種類的真核細胞。在本發明的另一個方面，提供了一種重組E2蛋白，為E2-凝血酶酶切位點接 頭-人源IgG-Fc融合蛋白。在該方面的一個優選例中，在所述蛋白的凝血酶酶切位點接頭和人源IgG-Fc片 段之間有XhoI酶切位點。在另一個優選例中，人源IgG-Fc片段的氨基酸序列為SEQ ID NO 7。
圖IA顯示了本發明的穿梭載體pFastBacHTb的構建圖譜。圖IB顯示了本發明的E2蛋白的氨基酸序列、其兩端的信號肽編號序列，多克隆位點的序列，凝血酶酶切位點或蛋白純化標簽(Fe)的編碼序列。圖2顯示了本發明使用昆蟲系統表達E2蛋白的流程圖。圖3顯示了 pFastBacHTb-signal-Fc載體酶切后回收圖(BamHl&Xhol雙酶切)。圖4顯示了 E2-凝血酶酶切位點接頭融合基因PCR跑膠切割后的結果。圖5顯示了 E2-thrombin基因構建入pFastBacHTb載體后菌液驗證圖示。圖6顯示了 pFastBac_E2質粒雙酶切(BamHl&Xhol)后圖示。圖7為中抽所得重組后E2黏粒，以M13通用引物PCR所得結果。圖8為中抽所得重組后E2黏粒，50V，150min,跑0. 8%膠后所得結果。圖9顯示了昆蟲細胞Highfive感染前后狀態的比較圖示。圖10顯示了病毒感染貼壁細胞48h后，裂解胞漿，western-blot方法，檢測Fc標 簽的結果。圖11顯示了 ProteinG柱純化后，所得E2蛋白樣品。圖12顯示了 HCV病毒模型，昆蟲系統所制備E2蛋白與HCV天然蛋白競爭實驗。
具體實施例方式為了獲得成功大規模生產E2蛋白的方法，本發明人發現，將E2蛋白與人IgGFc融 合，使該蛋白能夠被穩定表達，分泌到細胞周圍或細胞內，能夠通過簡便的分離純化步驟就 可以方便收集。人IgG Fc片段來源于pWS3質粒的Fc片段，在本發明中利用了其穩定表達病毒蛋 白的特性。本發明所使用的E2蛋白來自昆蟲細胞桿狀病毒重組表達。重組病毒的制備可以通過本領域的各種已知的途徑制備。本發明優選了 Bacto Bac系統，利用可在大腸桿菌和昆蟲細胞之間穿梭的載體Bacmid，將E2蛋白的序列轉化桿 狀病毒，從而能夠在昆蟲細胞中高度表達E2蛋白。根據本發明，可采用本領域技能中的常規分子生物學，微生物學，和DNA重組技 術。這些技術在文獻中有充分說明，如參見Maniatis & Sambrook，Fritsch，“ Molecular Cloning :A Laboratory Manual(1982) ； " DNA Cloning APractical Approach, " 卷 I 和 II(D. N. Glover ed. 1985) ； “ OligonucleotideSynthesis “ (Μ. J.Gait ed. 1984) ； " Nucleic Acid Hybridization " [B. D. Hames &S. J. Higgins eds. (1985)] ； " Transcription and Translation " [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984)] ；〃 Animal Cell Culture" [R. I. Freshney,ed. (1986)] ；〃 Immobilized Cells And Enzymes " [IRL Press, (1986)] ；B. Perbal, “ APractical Guide To Molecular Cloning" (1984)。因此，如果出現于本文下列術語的定義如下。“DNA分子”指脫氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、或胞嘧啶)的聚合形 式，以其單鏈形式或雙鏈螺旋形式。這一術語只指分子的一級和二級結構，不限制它的任何 具體三級形式。所以，本術語包括特別是在線型DNA分子(如，限制片段)，病毒，質粒和染 色體中發現的雙鏈DNA。這里討論的結構，按常例給出的只是DNA非轉錄鏈的5 ‘到3’方 向的序列(即，具有與mRNA同源序列的鏈)。"RNA分子”指核糖核苷酸(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、或尿嘧啶)的聚合形式，以其單鏈形式或雙鏈螺旋形式。這一術語只指分子的一級和二級結構，不限制它的任何具體 三級形式。所以，本術語包括特別是在線型RNA分子(如，限制片段)，病毒中發現的單鏈 RNA。在本文中給出的序列統統都翻譯成基因組正鏈DNA形式。但應理解，在HCV的基因組 中其為正鏈RNA形式，要通過轉錄成mRNA然后才能翻譯和表達。“載體”指一種復制子，如質粒，嗜菌體或粘粒，它們可以結合另一 DNA片段，從而產 生所結合片段的復制。“復制子”是一種基因元件(如，質粒，染色體，病毒)，其功能為體內 DNA復制的自主單元，如能在其自身控制下復制。“復制起點”指參與DNA合成的DNA序列。 “表達控制序列”是控制和調節轉錄和翻譯另一 DNA序列的DNA序列。編碼序列是細胞中當 RNA聚合酶將編碼序列轉錄為mRNA時，與轉錄和翻譯控制序列操作性連接并在它們的控制 下，被翻譯成編碼序列所編碼的蛋白。通常，采用含有啟動子序列的表達載體來促進與宿主連接的插入的DNA片段有效 轉錄和翻譯。表達載體通常包括復制起點，啟動子，終止子，以及有能力在轉化細胞中提供 表型選擇的特殊基因。被轉化的宿主可以按本領域已知的方法發酵和培養，以達到最佳細 胞生長。DNA “編碼序列”是當置于適當的調節序列控制下，能體內轉錄和翻譯為多肽的雙 鏈DNA序列。編碼序列的邊界在5 ‘(氨基)端為起始密碼子，在3’(羧基)端為翻譯終止 子。一個編碼序列可以包括，但不限制于，原核序列，真核mRNA的cDNA，真核(如，哺乳動 物)DNA的基因組DNA序列和合成的DNA序列。聚腺苷酸化信號和轉錄終止子序列通常位 于編碼序列的3 ‘端。“cDNA”指的是拷貝-DNA或互補-DNA，它是mRNA轉錄物的反轉錄反 應產物。轉錄和翻譯的控制序列是DNA的調節序列，如啟動子，增強子，聚腺苷酸化信號， 終止子等，它們提供編碼序列在宿主細胞中的表達。“順式元件”是一種核苷酸序列，也被 稱為“共有序列”或“基序”，它可與那些能上調和下調特定基因位點表達的蛋白相互作用。 “信號序列”也可以包括在編碼序列中。這個序列編碼位于多肽N-端的一種信號肽，其與宿 主細胞聯系并且將該多肽引向合適的細胞內位置。已發現信號序列可與許多原核和真核生 物的天然蛋白相結合。“啟動子序列”是一種DNA調節區域，能在細胞內結合RNA聚合酶和引發下游(3’ 向)編碼序列的轉錄。本發明定義，啟動子序列其3’端為轉錄的起始位點并向上游(5 ‘) 方向延伸包括最小數量的引發可檢測水平(高于背景)的轉錄所必需的堿基和元件。在啟 動子序列中，可找到轉錄起始位點和負責與RNA聚合酶結合的蛋白結合區域(共有序列)。 真核啟動子經常，但并非總是，含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核啟動子除了 -10和-35共 有序列外，還含有SD(Shine-Dalgarno)序列。術語“寡核苷酸”指的是一種由兩個或更多(最好三個以上)脫氧核糖核苷酸組成 的分子。它的確切大小由很多因素決定，取決于該寡核苷酸的最終功能和用處。本文用的 術語“引物”指一種寡核苷酸，不論是以限制性酶消化的純化天然寡核苷酸，還是合成產生 的寡核苷酸，當其被置于引物延伸產物的合成條件下，如存在核苷酸和誘導劑如DNA多聚 酶和適當的溫度及PH時，可以作為引發合成的點，而所誘導的引物延伸產物與核苷酸鏈是 互補的。引物可以是單鏈的也可以是雙鏈的，但必須足夠長使能在誘導劑存在時引發所需 延伸產物的合成。引物的確切長度取決于許多因素，包括溫度、引物來源和所用的方法。例如，診斷應用，取決于靶序列的復雜性，寡聚核苷酸引物通常包含15-25或更多的核苷酸， 雖然它也可以包含更少的核苷酸。本文所選引物須與特定的靶DNA序列的不同鏈基本互補。這意味，引物必須與它 們各自的鏈充分的互補性雜交。因此，引物序列無需反映模板的確切序列。例如，一段非互 補核苷酸片段可附著于引物的5’端，而引物序列的其余部分與此鏈互補。另外，只要引物 序列和與之雜交的序列足夠互補時，非互補堿基或更長的序列可散布在引物中，這樣形成 了延伸產物合成的模板。本文所用的術語“限制性內切酶”和“限制性酶”指能在一特定核苷酸序列上或附 近切割雙鏈DNA的酶。"DNA重組技術”指合并兩個異源DNA分子的技術，通常這是體外連接不同生物體 DNA的結果。重組DNA分子通常用基因工程實驗生成。同義的術語包括“基因拼接”，“分子 克隆”和“基因工程”。這些操作的產物是“重組體”或“重組分子”。當這種DNA被引入到細胞內時，細胞就被外來或異源DNA “轉化”或“轉染”了。轉 化DNA可能或沒有被整合(共價連接)到細胞的基因組中。例如在原核生物，酵母和哺乳 動物細胞中，轉化DNA可能被維持在游離型元件如載體或質粒上。對于真核細胞來說，穩定 轉化的細胞是轉化的DNA已整合到染色體中的細胞，這樣通過染色體的復制將遺傳給子代 細胞。這種穩定性的證據是該真核細胞能夠建立由含轉化DNA的子代細胞群組成的細胞系 和克隆。“克隆”是由一個細胞或有絲分裂祖先衍生的一群細胞。“細胞系”是能在體外穩定 生長許多代的一個原代細胞的克隆。一種生物，如植物或動物，用外源DNA轉化后稱為“轉 基因的”生物。本文用的術語“宿主”不僅包括原核生物，也包括真核生物如酵母、植物和動物 細胞。原核宿主可以包括大腸桿菌(E. coli)、鼠傷寒沙門氏菌(S. tymphimurium)、靈桿 菌(Serratia marcesens)、和枯草桿菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括酵母如巴 斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)、哺乳動物細胞和昆蟲細胞，以及植物細胞如擬南芥 (Arabidopsis thaliana)禾口煙草(Tobaccum nicotiana)。當確定長度的兩個DNA序列中的核苷酸有至少75% (較好的是80 %，最好的是 90%或95%)是配對的，則這兩個DNA序列是“基本同源”的。序列的基本同源可通過用 序列數據庫的標準軟件或Southern雜交實驗，例如在為特殊系統所確定的嚴謹條件下，進 行序列比較來鑒定。明確適合的雜交條件在本領域技術人員的能力之內見如Maniatis er al.，同上；DNA Cloning, Vols. I & II，同上；NucleicAcid Hybridization,同上。DNA結構中的“異源”區域是在較大的DNA分子中天然不能與該較大DNA分子締合 的一段區域。因此，當該異源區域編碼一哺乳動物基因時，該基因往往側接了在來源生物基 因組中不會側接的哺乳動物基因組的DNA。另一例子為，該編碼序列其自身在自然中是沒有 的(如，cDNA中的基因組編碼序列包括內含子，或合成序列中包含了與自然基因不同的密 碼子)。等位(基因)變異或天然發生的突變并不產生本文所說DNA的異源區域。另外，本發明還包括E2蛋白或E2基因的一部分或片段。本文的“片段”或“部分” 指一個基因或一個多肽，長度上通常至少10個殘基，較好的是至少20個殘基，最好的是至 少30個殘基(如50個)，但必須少于全部完整的序列。這些基因片段可用本領域技術人 員所知的方法制得，例如通過天然存在的E2基因或重組E2基因或E2蛋白基因的限制性消化，通過用編碼E2確定片段的載體的DNA重組技術，或通過化學合成來制得。按照本領域普通技術人員所公知的常規Northern雜交技術，可采用標準Nothern 印跡試驗來確定細胞或組織中的mRNA的相對量。另外，按照本領域普通技術人員所公知的 常規Southern雜交技術，可采用標準Southern印跡試驗來確認興趣基因的存在和拷貝量。 Northern印跡和Southern印跡都用到了雜交探針，即放射性標記的cDNA，或至少20 (較好 的是至少30，更好的是至少50，最好的是至少100)個連續核苷酸長度的寡核苷酸。DNA雜 交的探針可以用本領域普通技術人員所公知的許多不同方法中的一種來標記。這些研究中最常用的標記物是放射性元素、酶、暴露在紫外光下能發熒光的化學 劑，等。已知有許多的熒光材料可用于標記。它們包括，如，熒光素、羅丹明、金胺、得克薩斯 紅(Texas Red)、AMCA藍和熒光黃。一種特殊的探測物質為山羊中制得的通過異硫氰酸鹽 與熒光素交聯的抗-兔抗體。蛋白質可用放射性元素或酶標記。放射性標記可用目前能得 到的計數方法檢測。較佳同位素可選自 3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57C0、58C0、59Fe、9°Y、125I、mI 和 186Re。酶標記也同樣有用，可用比色、分光光度計、熒光分光光度計、電流計或氣體計量 技術來測定。通過與橋連分子(如碳二亞胺、二異氰酸鹽、戊二醛等)反應使酶與所選擇的 粒子交聯。許多可用于這種方法的酶已經知道并采用了。較佳的是過氧化物酶、葡糖醛 酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡糖氧化酶和過氧化酶及堿性磷酸酶。美 國專利Ν0. 3，654，090、3，850，752和4，016，043里還公開了其它的標記物質和方法。術語“免疫活性”或“免疫原性”指由天然、重組或合成的肽誘導哺乳動物體內的 特異性體液和/或細胞免疫應答的能力。本文所用的術語“抗原性氨基酸序列”、“抗原性多 肽”或“抗原性肽”指可引發哺乳動物免疫應答的氨基酸序列，無論是單獨或與輔助分子結 合(如I或II類主要組織相容性抗原分子)。本文所用的術語“免疫應答”包括細胞性和/或體液性免疫應答，它們足以抑制或 防止感染；或防止或抑制由微生物(尤其是病原性微生物)導致的疾病的發作；和/或抑 制、減少或防止腫瘤細胞的增生；和/或降低腫瘤細胞的數量或腫瘤的質量；和/或降低腫 瘤性形成的可能性。術語“抗原”和“表位”是本領域熟知的，指可由免疫系統的一種成分(如抗體或T 細胞抗原受體)特異性識別的大分子的一部分。表位可由溶液中的抗體識別，如與其它分 子相對游離。當表位與I或II類主要組織相容性復合物分子結合時，就可由T-細胞抗原 受體識別表位。“CTL表位”就是當表位存在于與MHC I類分子結合的細胞表面上時，由細 胞毒性T淋巴細胞(通常為CD8+細胞)識別的表位。本文所用的術語“分離的”指描述處于與一種化合物的天然形成環境所不同的條 件下的有關化合物(如重組病毒、肽等)。“分離的”包括在樣本中一種有關化合物基本處 于富集狀態和/或在其中一種有關化合物有部分或基本上達到純化的各種化合物。包含本發明的重組桿狀病毒的各種組合物本發明還提供了包含本發明的重組桿狀病毒的各種組合物(包括藥用組合物)。包含本發明的重組桿狀病毒的各種組合物可以包含按重組桿狀病毒的實際用途 所選用的緩沖劑；還可包含適用于預定用途的其它物質。本領域技術人員都善于選擇的 緩沖劑，本領域已知有多種緩沖劑適用于預定用途。在有些實例中，該組合物可含有藥學上可接受的賦形劑，本領域已知有多種而無需在此詳細討論。藥學上可接受的各種賦形 劑在多種出版物已有詳述，包括如“Remington:藥學和藥學實踐”，第19版(1995) Mack Publishing Co.。可將藥用組合物制備成各種劑型，如粒劑、片劑、丸劑、栓劑、膠囊、懸浮液、噴霧、 栓劑、透皮藥物(如貼片等)、油膏、洗劑等。適用于口服或局部使用的藥用級別的有機或無 機載體和/或稀釋劑，可用于配制包含治療活性化合物的各種組合物。本領域已知的稀釋 劑包括水性介質、植物性和動物性油和脂肪。還可用穩定劑、潤濕劑和乳化劑、改變滲透壓 的鹽類或維持合適PH值的各種緩沖劑、和皮膚滲透增強劑等作為輔助性材料。本發明的重組桿狀病毒可用作免疫篩選針對E2蛋白的中和抗體。將本發明產生 的E2蛋白注射入動物體內，可大量產生多克隆抗體，并可通過常規方法篩選單克隆抗體。 通常，按本領域熟知的各種方法，用合適的藥用載體和/或運載體配制本發明的疫苗。合適 的載體是無菌鹽水。為此也可使用其它水性和非水性等滲無菌注射液以及水性和非水性無 菌懸浮液(已知都是藥學上可接受的載體，也是本領域技術人員所熟知的)。給出以下的實施例目的為說明本發明的各種具體實施方案，對本發明沒有任何形 式的限制。實施例1重組桿狀病毒的制備1.重組供體質粒的構建如圖IB 所示，E2 蛋白的編碼序列來自 NCBI(http;//www. ncbi.nlm. nih. gov/) 網站收錄的HCVlb型丙肝病毒表面糖蛋白E2的基因序列，選取E2胞外區序列克隆。使用 HCVlb的cDNA基因組為模板合成了其編碼序列，其序列為SEQ ID NO 1。氨基酸序列如SEQ ID NO :2。將該序列利用限制性酶切重組克隆入轉移載體PFastBacHTb (本實驗室提供)的 多克隆位點(凝血酶酶切位點)。該質粒中的Fc片段來源于pWS3(購自于Sigma公司) 的Fc片段，其序列如SEQ ID NO 7中所示，見圖IB0用正向引物5，-CCGCTCGAGACATGCCCA CCGTGCCCA-3，(SEQ ID NO 3)和反向引物 5，-CCCAAGCTTTTTACCCGGAGACAGGGA-3，(SEQ ID NO 4)從該質粒中克隆出Fc片段，并構建入pFastBac載體，在凝血酶酶切位點接頭序列 CTGGTGCCGCGCGGCTCT(SEQ IDNO 6)之后。該質粒還含有一信號肽序列，位于E2蛋白序列 之前，其序列為 ATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAGGCTTCAATAAGGAACACACAAGCAAGATGGTAAGCG CTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCG(SEQID NO :5)。質粒的構建步驟1.克隆E2胞外區全長序列模板為來自上海巴斯德研究所的HCVlb的cDNA基因組，根據www. ncbi. nlm. nih. gov查找的E2基因序列，采用軟件Primer Premier設計其胞外區引物。引物中引入凝血酶 酶切接頭。正向引物CGCGGATCCGAGACCCGTGTGACAGG(SEQID NO 8)反向引物CCGCTCGAGAGAGCCGCGCGGCACCAGCCATTTGATTGCA(SEQID NO 9)反義引物中引入凝血酶切位點(Ler-Val-Pro-Arg-Gly-Ser)，直接與E2基因相 聯。采用pfu聚合酶的PCR體系(50ul)進行PCR，條件為94°C 5m預變性；94°C 45s變 性；600C 45s退火；720C lm45s延伸；33個循環。瓊脂糖PAGE膠濃度為1% (mg/ml)
2. E2的基因回收，基因回收后跑膠驗證，證明得到了目的大小的單一的基因片段， BamHI & XhoI限制性內切酶37度酶切過夜，回收酶切基因片段。3. pFastBacHTb 載體(BamHI&XhoI)雙酶切后回收4.酶切基因與酶切載體IOul連接體系，16度連接5_8h5.將連接產物轉化DH5 α，挑取6個克隆，進行菌液PCR驗證。挑取陽性克隆株進 行菌液的小量抽提。該質粒圖譜如圖1Α。采用上海申能博彩生物技術有限公司提供的小量質粒快速抽提試劑盒，操作步驟 如下(1)取菌液2-3ml，高速離心12000rpm，Imin收集菌體。(2)棄上清，加入IOOul Solution I溶液，振蕩至菌徹底懸浮。(3)加入200ul SolutionII溶液，立即溫和顛倒5-10次(即加一管混勻一管)， 室溫靜置2min。(4)加入400ul Solution III溶液，立即溫和顛倒5-10次(即加一管混勻一管)， 室溫靜置2min。(5) 15000rpm離心IOmin (無需低溫離心)，上清移入3S吸附柱中，室溫靜置2min。(6) 12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中。(7)在吸附柱中加入700ul Wash Solution溶液，12000rpm離心lmin，倒掉收集管 中的液體，將吸附柱入同一收集管中。(8)重復步驟7—次(9) 12000rpm離心2分鐘，盡量去除液體，倒掉收集管中的液體。(10)將3S柱置于干凈的1. 5ml的離心管中，在3S柱的膜中央加入 30ulTEsolution，55_65°C水浴放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘，棄去3S柱，離心管中即為 質粒，-20°C保存。圖3為pFastBacHTb載體雙酶切后的基因割膠圖，載體為5600bp，條帶大小正確。圖4為E2基因割膠圖，大小為lkb，條帶大小正確。圖5為構建后的質粒轉化DH5a，4個克隆菌液驗證的結果，結果顯示4個克隆均為 陽性。圖6為小抽所得質粒37度過夜雙酶切(BamHI&XhoI)，跑膠驗證。結果顯示所切得 基因大小正確，即酶切位點正確無誤。2.重組黏粒的制備將獲得的重組pFastBac載體通過基因重組的方式轉化入大腸桿菌DHlOBac (來自 生化細胞所王綱組)中，獲得重組的宿主大腸桿菌細胞。37度，搖床250rpm，培養大腸桿菌，使E2編碼序列以及人源IgGFc序列在轉座酶 作用下重組入Bacmi黏粒的mini-attTn7位點。所述轉座酶由大腸桿菌DHlOBac中攜帶的 輔助質粒PM0N7124提供。然后，大腸桿菌在Luria培養基上涂布培養。挑取白斑菌落在含抗生素(篩選卡那霉素、慶大霉素和四環素抗性)LB培養擴增 質粒，加入50μ g/ml卡那霉素、7μ g/ml慶大霉素、10μ g/ml四環素篩選抗性菌株；37°C搖 菌培養24h。高速離心收集菌液沉淀(HOOOgXlmin)。
用300 μ 1 Solution I充分重懸沉淀；300 μ 1 Solution II至澄清，室溫放置 5min ；300 μ 1 Solution III輕混至形成白色沉淀；置于冰上5-10min。14000g離心lOmin，上清液轉移至加入800 μ 1異丙醇的EP管，輕輕混合，置于冰 上5 lOmin。15minl4000g離心，加入500 μ 1 70%乙醇，14000g離心5分鐘；重復步驟， 盡可能多吸去上清夜置于空氣中，40 μ IddH2O溶解DNA，可存于-20°C。3.重組桿狀病毒的制備(1)懸浮細胞的馴化過程待貼壁培養的昆蟲細胞Highfive (來自中科院生化細胞所王綱組)傳至3代，細 胞呈明顯分裂相，視野清澈；收集貼壁細胞傳至250ml血清瓶(轉瓶)，細胞密度4 X 105，終 體積50ml ；低溫搖床，27度，130rpm,培養2_3天；將轉瓶細胞移入IOcm培養皿，水平靜置 5分鐘，抱團細胞顆粒沉淀于培養皿底部；吸取上清懸浮細胞，重新置于250ml血清瓶，細胞 密度4X 105，終體積50ml ；低溫搖床，27度，130rpm,培養2_3天；重復抱團細胞沉淀步驟3 次，懸浮細胞可呈現單個細胞均勻分散的狀態，從而大大提高感染效率。250ml轉瓶細胞， 于低速離心機，以960rpm離心4分鐘，棄去上清；將細胞重懸，并以4X IO5細胞密度傳至3L 大轉瓶，終體積為400ml，于低溫搖床27度，130rpm培養至2X IO6細胞/ml。(2)昆蟲細胞的轉染27度恒溫培養箱培養上述馴化的昆蟲細胞，細胞狀態良好，傳至六孔板(康 寧公司)各孔9X IO5細胞，貼壁時間大于Ih;將上述步驟中所制得黏粒與脂質體 CellfectinTM(英偉托金公司Invitrogen)混合，覆蓋于六孔板昆蟲細胞表面，結合5h ；換 液后，培養72h，收獲上清即得病毒滴度為IO7的第一代重組桿狀病毒；裂解液(實驗室自 制，甘油(100% ) 30ml ；Tris-Cl (ρΗ6· 8，1Μ)，15ml ；EDTA, 0. 22g ；SDS, 6g ；溴酚藍 0. 03g ；DTT 0. 6mol/L)裂解胞漿，超聲破碎細胞(工作4”，間歇3”，4個循環)，釋放蛋白，western-blot 檢測目的蛋白的表達；將第一代重組桿狀病毒再次感染貼壁細胞，48h后收取上清即得病 毒滴度為IO8的第二代重組桿狀病毒，加入2%胎牛血清，避光保存于4度。第二代病毒苜 蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒AcNPV/E2-Fc于2009年4月30日保藏于中國典型培養物保藏 中心，保藏號為CTCC-V200909。4.重組病毒成功包裝的驗證(1)黏粒成功重組的驗證挑選3-5個純白色陽性克隆，以M13通用引物對黏粒進行PCR驗證，結果見圖7。 如步驟2所述抽提黏粒，50V，150min，0. 8%瓊脂糖凝膠(簡恩泰克公司)，五組條帶齊備； 結果如圖8所示。(2)黏粒成功感染的驗證2_4管黏粒分別轉染六孔板細胞，并觀察感染狀況，結 果如圖9所示。細胞感染后，體積增大并呈空泡透明狀。實施例2 :E2-Fc蛋白的制備和驗證1.E2-FC目的蛋白的表達250ml血清瓶培養實施例1中所得的馴化好的highf ive細胞至密度為 2X106cells/ml ；用所獲第二代陽性病毒，感染血清瓶中懸浮細胞(M. 0. I = 2)，于低溫搖 床27度，130rpm，培養72h，避免紫外線照射；于低速離心機，以2500rpm離心5分鐘，上清 即為擴增后病毒；將擴增后的病毒，感染細胞密度為2X106的大瓶懸浮細胞(M. 0.1 =4)，于低溫搖床27度，130rpm，培養72h，避免紫外線照射；如上文所述觀察到明顯的感染表征 后，收集大瓶細胞移至離心瓶，于低溫離心機4度，以6000rpm離心20min ；收集上清，經由 0. 45um濾膜過濾，再次收集上清，即得分泌表達的目的蛋白E2-Fc。2. E2-Fc 的純化得到的E2_Fc 蛋白由 AKTA 純化儀(GE healthcare)過 ProteinG 柱 (GEhealthcare)純化得到，一步純化即可得到較單一的目的大小條帶，SDS-PAGE， western-blot驗證條帶的正確性。結果如圖10 (western-blot)和圖ll(SDS-PAGE)所示。實施例3E2-FC的生物學功能驗證試驗E2-Fc蛋白和HCV天然E2結構蛋白的競爭性試驗使用Huh7. 5. 1細胞模型(來自于上海生科院巴斯德研究所)培養HCV病毒(來自 于上海生科院巴斯德研究所)，病毒分泌于細胞周圍或者存在于胞內，同時，病毒表達HCV 天然蛋白，例如E2結構蛋白。在96孔板(corning)中接入上述Huh7. 5. 1細胞，(在P2實驗室，37度，5 % C02 條件下)培養HCV病毒，48h ；用PBS潤洗細胞3次后，加入2 %多聚甲醛固定液使細胞 固定，從而保留HCV天然蛋白E2。人抗-E2抗體(該抗體由美國Scripps研究所Denis Burton博士饋贈的含有人抗-E2抗體的細胞培養上清，1 100倍稀釋)分別與待檢蛋白 E2-Fc (0. 15mg/ml)，不相關蛋白RBD-Fc (來自本實驗室，濃度0. 3mg/ml)(陰性對照)37度 體外孵育lh，用PBS潤洗固定細胞3次后，加入孵育混合物，之后用購自Invitrogen公司的 山羊抗人的紅色熒光標記的二抗(0. 5ug/ml)進行檢測。試驗結果如圖12所示。非相關蛋白與天然HCV結構蛋白無競爭能力，所固定HCV 蛋白牢固結合E2抗體，故顯示強的熒光；E2-Fc蛋白與所固定HCV蛋白競爭結合E2抗體， 顯示為極弱的熒光。試驗結果如圖12所示。非相關蛋白RBD-Fc與天然HCV結構蛋白無競爭能力，所 固定HCV蛋白牢固結合E2抗體，故顯示強的熒光；E2-Fc蛋白與所固定HCV蛋白競爭結合 E2抗體，顯示為極弱的熒光。實驗結果說明，E2-Fc與天然HCV結構蛋白E2形成競爭，抗E2特異性抗體對其有 特異性，因此具有生物活性。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>昆蟲桿狀病毒表達系統及用其表達E2蛋白的方法<130)092115<160>7<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>999
<212)DNA
(213)丙肝病毒(Hepatitis virus C)E2蛋白
(400)l
gagacccgtg tgacaggggg gcagatagcc agaaatgcct actcgctcac gaccctcttt60
tcatctgggt cggctcagaa catccagctc ataaacacca acggtagctg gcacatcaac1 20
aggactgccc tgaactgcaa tgactccctc aacaccgggt ttcttgccgc gctgttctac180
acgcacaagt tcaacgcgtc cggatgtcca gagcgcttgg ccagctgccg ccccattgac240
4]] aagttcgatc aggggtgggg tcccatcact tatgctgagc agggcggcca ggaccagagg300
ccttattgct ggcactacgc acctaaacca tgtggtattg tatccgcgtc gaaggtgtgt360
ggtccagtgt attgtttcac cccaagccca gttgtagtgg ggacgaccga tcggttcggt420
gtccctacgt atagctgggg ggagaatgag acagacgtgc tgctccttaa caacacgcgg480
ccgccgcaag gcaactggtt cggctgtacg tggatgaacg gcactgggtt caccaagaca540
tgcgggggcc ccccgtgtaa catcgggggg ggcggcaata acaccttgac ctgccctacg600
gactgtttcc ggaagcaccc cgcggccact tacacaaaat gtggttcggg accttggctg660
acacccaggt gcttggtaga ctacccatac aggctctggc actacccctg cactgccaac720
tttaccatct tcaaggttag gatgtatgta gggggcgtgg agcacaggct cgatgctgca780
tgcaattgga cccgagggga acgttgcaac ttggaggata gggatagatt ggagctcagc840
5]] ccgctactgc tgtctacaac agagtggcag gtgctgccct gttctttcac caccctaccg900
gctctgtcca ctggtttaat tcatctccat cagaacatcg tggacgtgca atacctgtac960
ggtatagggt cggcagttgt ttcctttgca atcaaatgg999
<210)2
<2l 1)363
<212)PRT
(213)丙肝病毒E2蛋白(Hepatitis virus C)
(400)2
Glu Thr Arg Val Thr Gly Gly Gin Ile Ala Arg Asn Ala Tyr Set Leu
l5lo15
6]] Thr Thr Leu Phe Set Set Gly Set Ala Gin Asn Ile Gin Leu Ile Asn
202530
Thr Asn gly Set Trp HiS Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp
354045
Set Leu Asn Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr HiS Lys Phe
505560
Asn Ala Set Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Set Cys Arg Pro Ile Asp
65707580
Lys Phe Asp Gin Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Ala Glu Gin Gly Gly
859095
7]] Gin Asp Gin Arg Pro Tyr Cys Trp HiS Tyr Ala Pro Lys Pro Cys Gly
100105llo
lie ValSerAlaSerLysValCysGlyProValTyrCysPheThrPro
115120125
Ser ProValValValGlyThrThrAspArgPheGlyValProThrTyr
130135140
Ser TrpGlyGluAsnGluThrAspValLeuLeuLeuAsnAsnThrArg
145150155160
Pro ProGlnGlyAsnTrpPheGlyCysThrTrpMetAsnGlyThrGly
165170175
Phe ThrLysThrCysGlyGlyProProCysAsnlieGlyGlyGlyGly
180185190
Asn AsnThrLeuThrCysProThrAspCysPheArgLysHisProAla
195200205
Ala ThrTyrThrLysCysGlySerGlyProTrpLeuThrProArgCys
210215220
Leu ValAspTyrProTyrArgLeuTrpHisTyrProCysThrAlaAsn
225230235240
Phe ThrliePheLysValArgMetTyrValGlyGlyValGluHisArg
245250255
Leu AspAlaAlaCysAsnTrpThrArgGlyGluArgCysAsnLeuGlu
260265270
Asp ArgAspArgLeuGluLeuSerProLeuLeuLeuSerThrThrGlu
275280285
Trp GlnValLeuProCysSerPheThrThrLeuProAlaLeuSerThr
290295300
Gly LeulieHisLeuHisGlnAsnlieValAspValGlnTyrLeuTyr
305310315320
Gly lieGlySerAlaValValSerPheAlalieLysTrpAspTyrlie
325330335
Val lieLeuPheLeuLeuLeuAlaAspAlaArgValCysAlaCysLeu
340345350
Trp MetMetLeuLeulieAlaGlnAlaGluAla
355360
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Fc正向引物
<400>3
Val Lys Phe AsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLys
505560
Thr Lys Pro ArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSer
65707580
Val Leu Thr ValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLys
859095
Cys Lys Val SerAsnLysAlaLeuProAlaProlieGluLysThrlie
100105110
Set Lys Ala LysGlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuPro
115120125
Pro Ser Arg AspGluLeuThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeu
130135140
Val Lys Gly PheTyrProSerAsplieAlaValGluTrpGluSerAsn
145150155160
Gly Gln Pro GluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSer
165170175
Asp Gly Pro PhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArg
180185190
Trp Gln Gln GlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeu
195200205
His Asn His TyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys
210215220
<210>8
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>E2正向引物
<400>8
cgcggatccg agacccgtgt gacagg
<210>9
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>E2反向引物
<400>9
ccgctcgaga gagccgcgcg gcaccagcca tttgattgca
權利要求
一種重組桿狀病毒，其特征在于，所述桿狀病毒保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CGMCC No.CTCC V200909。
2.如權利要求1所述的重組桿狀病毒，其特征在于，所述重組桿狀病毒含有重組表達 盒，所述重組桿狀表達盒含有病毒多角體蛋白啟動子P10、GP67信號肽序列、E2蛋白編碼序列、凝血酶酶切位點接 頭、人源IgG-Fc編碼序列、和Sv40PolyA。
3.如權利要求2所述的重組桿狀病毒，其特征在于，所述GP67信號肽位于多角體蛋白 和E2蛋白編碼序列之間。
4.如權利要求2所述的重組桿狀病毒，其特征在于，所述凝血酶酶切位點接頭和人源 IgG-Fc編碼序列依次連接在所述E2蛋白編碼序列下游。
5.如權利要求2所述的重組桿狀病毒，其特征在于，所述E2蛋白編碼序列編碼SEQID NO 2的E2蛋白。
6.一種生產重組E2蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟用權利要求1所述的重組桿狀病毒感染昆蟲細胞，分離純化產生的重組E2蛋白。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述昆蟲細胞通過重復懸浮培養除去抱團 細胞。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述昆蟲細胞是highfive昆蟲細胞。
9.一種重組E2蛋白，其特征在于，所述蛋白為E2-凝血酶酶切位點接頭-人源IgG-Fc 融合蛋白。
10.如權利要求9所述的重組E2蛋白，其特征在于，在所述蛋白的凝血酶酶切位點接頭 和人源IgG-Fc片段之間有XhoI酶切位點。
全文摘要
提供了昆蟲桿狀病毒表達系統及用其表達E2蛋白的方法。具體的，提供了重組的桿狀病毒，其具有保藏號CCTCC NoV200909；提供了用該重組桿狀病毒轉化的宿主細胞，以及用該宿主細胞生產重組E2蛋白的方法。
文檔編號C12R1/93GK101899419SQ20091005188
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月25日 優先權日2009年5月25日
發明者孫兵, 查業 申請人:中國科學院上海生命科學研究院