專利名稱：Jak2外顯子12基因突變及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因組學(xué)領(lǐng)域，涉及JAK2基因突變及用途。具體涉及位于JAK2外顯子 12上的編碼序列及其在骨髓增殖性疾病的基因診斷中的用途。
背景技術(shù)：
研究顯示，Janus kinase 2 (JAK2)屬于Janus激酶家族，由1132個氨基酸組成， 相對分子量為131 X IO3,定位于9號染色體短臂2區(qū)4帶(9p24)，與JAKl、JAK 3以及TYK2 同屬于JAK家族，均為胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase，PTK)。JAK2基 因由7個高度保守的同源結(jié)構(gòu)域(JAK homology, JH)組成(JH1-JH7)，主要包括①N-端 FERM區(qū)(JH4-JH7)負責(zé)與相關(guān)細胞因子受體進行非共價結(jié)合；②N端JH3-JH4為假性SH2 區(qū)；③C-端酪氨酸激酶區(qū)(JHl區(qū))為激酶結(jié)構(gòu)域，靠近蛋白羧基端，是JAK2的催化功能 區(qū)，具有JAK2活性所必需的Phe-Trp-Tyr基團，該區(qū)的缺失將導(dǎo)致JAK2失活；④緊鄰SH2 區(qū)的假激酶區(qū)域(JH2)，結(jié)構(gòu)域類似于JHl，但沒有激酶活性，主要起抑制JAK2活性的作用， 該區(qū)結(jié)構(gòu)異?？蓪?dǎo)致 JAK2 異?；钴S(Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ，et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in humanmyeloproliferative disorders. Lancet. 2005 ；365(9464) 1054-61)。JAK2基因突變研究是近年來血液病研究的突破性進展之一?，F(xiàn)有技術(shù)公開了骨髓 增殖性疾病(myeloproliferative diseases,MPD),包括真性紅細胞增多癥(polycythemia vela, PV)、原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythemia, ET)和特發(fā)性骨髓纖維化 (idiopathicmyelofibrosis, IMF)是一組造血干細胞病變引發(fā)的惡性疾病，但這些疾病的 遺傳學(xué)基礎(chǔ)多年來一直未明了，直到2005年研究人員在本組疾病中發(fā)現(xiàn)存在JAK2點突 變(JAK2V617F)，才使MPD的診治進入了一個新紀(jì)元。JAK2V617是在第14外顯子v617位 點發(fā)生的點突變，纈氨酸(valine，V)被苯丙氨酸(phenylalanine，F(xiàn))取代。在JAK2的 結(jié)構(gòu)中，JHl為激酶域；而Val617位于與JHl相鄰的JH2，后者為假激酶域，與JHl結(jié)合并 抑制其激活。V617F突變使JH2失去了對JHl激酶活性的抑制作用，導(dǎo)致了 JAK2的持續(xù) 活化，由此造成細胞的增殖活性增強[Kilpivaara 0，Levine RL. JAK2and MPL mutations in myeloprolifer-ative neoplasms :discovery andscience. Leukemia. 2008 ；22(10) 1813-7]。JAK2V617F突變在真性紅細胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥和特發(fā)性骨髓纖維化 患者中存在很高的發(fā)生率。通過等位基因特異性多聚酶鏈反應(yīng)檢測到JAK2 V617F突變在 真性紅細胞增多癥患者中的發(fā)生率為90% ；原發(fā)性血小板增多癥和特發(fā)性骨髓纖維化患 者為 50%-60% [Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, et al. Lancet. 2005 ；365 (9464) 1054-61]。在未發(fā)現(xiàn)JAK2突變?nèi)狈617F突變患者的這些疾病的分子基礎(chǔ)尚不清楚。2007 年，有研究在JAK2V617F突變陰性的MPD患者中發(fā)現(xiàn)了外顯子12的突變，該突變同樣也可 造成JH2喪失對JH激酶活性的抑制，這為JAK2 V617F陰性的骨髓增殖性疾病患者提供了 分子標(biāo)志物和遺傳機制[Scott LM, Tong W, Levine RL, et al. JAK2 exon 12mutations in polycythemia vera and idiopathic erythrocytosis. NEngl J Med 2007;356:459-68·]。
正常生理情況下，JAK2介導(dǎo)促紅細胞生成素(EP0)、促血小板生成素(TP0)、粒-巨 噬細胞集落刺激因子、白細胞介素_3和生長因子在內(nèi)的多種細胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并調(diào)節(jié) 和促進細胞增殖。JAK2基因在造血調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，其下游的STAT家族是一種能與 DNA結(jié)合的蛋白家族，與JAK磷酸化信號通路偶聯(lián)(JAK-STAT信號通路)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作 用。JAK-STAT能把細胞外信號與基因表達調(diào)控直接聯(lián)系起來，啟動響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達， 完成細胞因子受體如促紅細胞生成素受體(EP0R)和促血小板生成素受體(MPL/TP0R)介導(dǎo) 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，產(chǎn)生細胞增殖效應(yīng)。這些位于外顯子12上的突變不僅為這些疾病的發(fā)生提供了遺傳學(xué)病因，也可 以作為特異性的生物標(biāo)志物，用來診斷骨髓增埴性疾病。在修訂的2008WH0分類系統(tǒng) 中，有無JAK2突變成為MPD主要的診斷指標(biāo)(MurugesanG, Aboudola S, Szpurka H, et al. Identification of the JAK2 V617Fmutation in chronic myeloproliferative disorders using FRET probesand melting curve analysis. Am J Clin Pathol,2006, 125 625-633)，由于這些突變導(dǎo)致JAK2酪氨酸激酶活性持續(xù)生高，這些突變也可以作為藥 物作用靶位，研究人員正在針對這些突變位點開發(fā)針對MPD高效的分子靶向藥物，將為MPD 的治療提高到一個新的水平。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供JAK2基因突變及用途。尤其涉及位于JAK2外顯子12上的 編碼序列及在骨髓增殖性疾病(MPD)的基因?qū)W診斷或治療中的用途。所述的骨髓增殖性疾病包括真性紅細胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥和特發(fā)性骨 髓纖維化等。本發(fā)明所述的JAK2基因突變其突變方式、突變序列和插入片段為在JAK2外 顯子12上1640位堿基后面插入了序列1的GTTTCACAAAATCAGAAATGAAGATTTGATATT長 達33的堿基，導(dǎo)致其蛋白序列F547變?yōu)長547，插入的堿基編碼的氨基酸序列為序列2的 FHKIRNEDLIFo本發(fā)明提供的JAK2基因突變?yōu)橹袊鳭AK2V617F陰性的MPD患者的突變位點，其表 現(xiàn)為在JAK2外顯子12上1640位堿基后面插入了序列1的堿基，其蛋白序列F547變?yōu)?L547，插入的堿基編碼的氨基酸序列為序列2的序列。本發(fā)明所述的JAK2基因突變通過下述步驟獲得1)采集標(biāo)本收集JAK2V617F陰性的MPD患者的外周血細胞，提取基因組DNA ；2)PCR 檢測針對外顯子12突變位點，設(shè)計引物序列3的上游引物 5，-AATGGTGTTTCTGATGTACC-3，，序列 4 的下游引物5，-AGACAGTAATGAGTATCTAATGAC-3，，擴 增片段長度為127bp ；使用HotStar Taq Master Mix試劑盒，在ABI 9700擴增儀上進行PCR擴增，取擴 增產(chǎn)物電泳；結(jié)果顯示，所測的擴增的目的條帶長度為127bp ；所測的JAK2V617F陰性的MPD患 者DNA含有突變位點，其除了與其他標(biāo)本相同的127bp條帶外，還多了一條分子量更大的條 帶 160bp ；
3)序列分析將上述PCR產(chǎn)物條帶進一步做基因測序，結(jié)果顯示，分子量較小的條帶(127bp)為 野生型(正常)具有序列5的核苷酸序列和編碼的序列6的氨基酸序列，與正常人JAK2基 因外顯子12序列完全一致；所述的分子量較大的突變型條帶(160bp)，其在JAK2外顯子12 上1640位堿基后面有GTTTCACAAAATCAGAAATGAAGATTTGATATT 33個堿基插入，具有序列7 的核苷酸序列和編碼的序列8的氨基酸序列。所述的JAK2基因突變，經(jīng)實驗證實，該突變可使特異性的受體酪氨酸磷酸化活性 持續(xù)增強，使紅細胞對細胞因子如EP0的反應(yīng)增強，持續(xù)激活JAK-STAT信號途徑，從而發(fā)生 細胞增殖。該基因突變對MPD的分類、診斷和治療能產(chǎn)生深遠的影響；該突變能成為治療 MPD的重要靶位，進一步制備針對該突變的Jak2抑制劑的靶向藥物用于治療骨髓增殖性疾 病 MPD。本發(fā)明中，可采用JAK2基因突變對臨床表現(xiàn)為紅細胞、粒細胞和血小板單系或多 系增多的MPD患者進行該突變位點檢測，有助于診斷或者排除MPD。本發(fā)明中，可采用JAK2基因突變位點序列制備診斷探針，能更簡便快捷的診斷 MPD 病。本發(fā)明中，可采用JAK2突變蛋白序列制備抗體，用于檢測突變的JAK2抗原，能更 簡便快捷的診斷MPD病。進一步，本發(fā)明中，按常規(guī)方法制備含有上述突變位點JAK2突變基因或者針對突 變蛋白抗體的試劑盒。本發(fā)明的有益效果為1)按照有無JAK2突變?yōu)镸PD主要的診斷指標(biāo)的2008 WHO分類系統(tǒng)，本發(fā)明所述 的JAK2基因突變對有關(guān)MPD的基因診斷工作帶來了顯著的便利，有利于進一步闡明MPD的 發(fā)病機制。2)由于JAK2突變廣泛存在于MPD，因此抑制JAK2基因來治療MPD的藥物具有相當(dāng) 廣闊的應(yīng)用前景；利用本發(fā)明將JAK2突變作為潛在的候選靶位，制備針對此突變的藥物， 抑制JAK2基因表達，為MPD病的治療提供新的方法。
圖1是JAK2基因結(jié)構(gòu)圖其中，F(xiàn)ERM 細胞因子受體結(jié)合區(qū)；SH2 細胞致敏區(qū)；Pseudo kinase 假激酶區(qū)；Kinase 激酶區(qū)。圖2 為 JAK2_exonl2 電泳結(jié)果，其中數(shù)字2-17為標(biāo)本編號，M代表分子量，長度單位bp，JAK2-eXOnl2(基因未發(fā)生突變)的目的條帶長度為127bp ；標(biāo)本2 (含有突變序列的患者)除了與其他標(biāo)本相同的127bp條帶外，還多了一條 分子量更大的條帶(160bp)。圖3 JAK2-exonl2野生型(基因未發(fā)生突變)測序結(jié)果。圖4 2號標(biāo)本(突變序列)測序結(jié)果。圖5 2號標(biāo)本突變的eXOnl2基因序列和蛋白序列突變表現(xiàn)示意圖，其中，框內(nèi)為插入的堿基序列，單劃線為插入的蛋白序列，表示在JAK2外顯子12上1640位堿基后面插入了 GTTTCACAAAATCAGAAATGAAGA TTTGATATT長達33的堿基，其蛋白序列F547變?yōu)長547，插入的堿基編碼的氨基酸序列為 FHKIRNEDLIFo
具體實施例方式實施例11)采集標(biāo)本收集JAK2V617F陰性的疑似MPD患者的外周血細胞，提取基因組 DNA ；所述的患者，四肢麻木長達2周，血常規(guī)化驗結(jié)果為
白細胞紅細胞血紅蛋白血小板中性粒 細胞％紅細胞 壓體紅細胞平 均體積平均血紅 蛋白量平均血紅 蛋白27. 47 X109 /L5. 37 X 1012 /L185 g/L510X 109 /L84. 7%56.6105. 434. 5327血液骨髓細胞形態(tài)學(xué)檢查報告特征描述為骨髓有核細胞增生活躍，粒紅細胞比例屬正常范圍。粒系增生，以桿狀分葉核細胞 居多，部分中性粒細胞可見空泡及中毒顆粒等退行性變，紅系比例與形態(tài)大致尚可，偶見雙 核早幼紅細胞。片上漿細胞易見，散在及小簇狀分布。全片找到巨核細胞272只，8/50顆 粒，41/50產(chǎn)板，1/50裸核。片上成簇及散在血小板易見，血小板形態(tài)大致正常。NAP 100% (+)，370 分。Fe 外鐵 + ++，內(nèi)鐵 34% +，1-2 粒。2) PCR 檢測設(shè)計引物序列3 的上游引物5，-AATGGTGTTTCTGATGTACC-3，，序列4 的下游引物5，-AGACAGTAATGAGTATCTAATGAC-3，，擴增片段長度為127bp ；采用HotStar Taq Master Mix試劑盒，在ABI 9700擴增儀上進行PCR擴增；反應(yīng)體系包括0. 5u 1上游引物(10pmol),0. 5u 1下游引物(lOmol), 12. 5 u 1 HotStar Taq Master Mix，1 ii 1 樣本 DNA，去離子水補足至 25 ii 1。擴增條件95°C 15min, 94°C 30s、55°C 30s、72°C 30s, 40 個循環(huán)后，72°C 5min 延伸，取 8iU 產(chǎn)物電泳；結(jié)果顯示，所測的擴增的目的條帶長度為127bp ；所測的JAK2V617F陰性的疑似患 者DNA含有突變位點，其除了與其他標(biāo)本相同的127bp條帶外，還多了一條分子量更大的條 帶 160bp ；3)序列分析將上述PCR產(chǎn)物條帶進一步做基因測序，結(jié)果顯示，分子量較小的條帶(127bp)為 野生型(正常)，與正常人JAK2基因外顯子12序列完全一致；分子量較大的條帶(160bp) 為突變型，其表現(xiàn)為在JAK2外顯子12上1640位堿基后面插入了 GTTTCACAAAATCAGAAATGAAGATTTGATATT 33 個堿基。實驗顯示，上述突變可使特異性的受體酪氨酸磷酸化活性持續(xù)增強，使紅細胞對 細胞因子如EP0的反應(yīng)增強，持續(xù)激活JAK-STAT信號途徑，從而發(fā)生細胞增殖。根據(jù)實驗及有關(guān)檢測結(jié)果增生性骨髓象，粒系有退行性變，NAP積分明顯增高， 臨床擬診斷為骨髓增殖癥。JAK2外顯子12基因突變及用途序列表SEQUENCE LISTING<110>復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院<120>JAK2外顯子12基因突變及用途<130>11<160>8<170>Patentln version 3. 1<210>1<211>33<212>DNA<213> 人<400>1gtttcacaaa atcagaaatg aagatttgat att33<210>2<211>12<212>PRT<213> 人<400>2Leu Phe His Lys lie Arg Asn Glu Asp Leu lie Phe1510<210>3JAK2外顯子12基因突變及用途序列表<211>20<212>PRT<213> 人<400>3Ala Ala Thr Gly Gly Thr Gly Thr Thr Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly151015Thr Ala Cys Cys20<210>4<211>24<212>PRT<213> 人0091]<400>40092]Ala Gly AlaCys Ala Gly Thr Ala Ala Thr Gly Ala Gly Thr Ala Thr0093]15 10 150094]Cys Thr AlaAla Thr Gly Ala Cys0095]200096]<210>50097]<211>1110098]<212>DNA0099]<213> 人0100]<400>50101]clclcltCBclclCCttctagtctt cagaacgaat ggtgtttctg atgtaccaac ctcaccaaca0102]ttacagaggcctactcatat gaaccaaatg gtgtttcaca aaatcagaaa t0103]<210>60104]JAK2外顯子12基因突變及用途序列表0105]<211>130106]<212>PRT0107]<213> 人0108]<400>60109]Met Val PheHis Lys lie Arg Asn Glu Asp Leu lie Phe0110]15 100111]<210>70112]<211>1110113]<212>DNA0114]<213> 人0115]<400>70116]aaatcaaacc ttctagtctt cagaacgaat ggtgtttctg atgtaccaac ctcaccaaca0117]ttacagaggc ctactcatat gaaccaaatg gtgtttcaca aaatcagaaa t0118]<210>80119]<211>240120]<212>PRT0121]<213> 人0122]<400>80123]Met Val PheHis Lys lie Arg Asn Glu Asp Leu lie Leu Phe His Lys0124]15 10 150125]lie Arg AsnGlu Asp Leu lie Phe0126]20
權(quán)利要求
JAK2外顯子12基因突變，其特征在于，在JAK2外顯子12上1640位堿基后面插入序列1的堿基。
2.按權(quán)利要求1所述的JAK2外顯子12基因突變，其特征在于，所述的插入的堿基編碼 序列2的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的JAK2外顯子12基因突變的制備方法，其特征在于，通過下述步驟1)采集標(biāo)本收集疑似骨髓增殖性疾病患者的外周血細胞，提取基因組DNA；2)PCR檢測，針對外顯子12突變位點，設(shè)計引物，獲得所測的擴增的目的條帶；3)序列分析，獲得JAK2外顯子12基因突變。
4.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的PCR檢測中設(shè)計的引物為序列3的 上游引物5’ -AATGGTGTTTCTGATGTACC-3，，序列 4 的下游引物5’ -AGACAGTAATGAGTATCTAATGAC-3，。
5.按權(quán)利要求1所述的JAK2外顯子12基因突變，其特征在于，所述的突變，其所在序 列具有序列7的結(jié)構(gòu)。
6.一種診斷探針，其特征是含有權(quán)利要求1所述的JAK2外顯子12基因突變。
7.一種抗體，其特征是針對含有權(quán)利要求2所述的氨基酸序列。
8.一種試劑盒，其特征是含有權(quán)利要求1所述的JAK2外顯子12基因突變。
9.一種試劑盒，其特征是含有權(quán)利要求7所述的抗體。
10.權(quán)利要求1所述的JAK2基因突變在制備診斷骨髓增殖性疾病診斷試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬基因組學(xué)領(lǐng)域，涉及位于JAK2外顯子12上的編碼序列及其在骨髓增殖性疾病基因診斷中的用途。所述的JAK2基因突變在JAK2外顯子12上插入序列1的堿基，其蛋白序列F547變?yōu)長547。經(jīng)實驗證實，該突變使特異性的受體酪氨酸磷酸化活性持續(xù)增強，使紅細胞對細胞因子如EPO的反應(yīng)增強，持續(xù)激活JAK-STAT信號途徑，從而發(fā)生細胞增殖。本發(fā)明的JAK2基因突變對有關(guān)骨髓增殖性疾病的基因診斷工作帶來了顯著的便利，有利于闡明該病的發(fā)病機制。利用該突變作為潛在的候選靶位，抑制JAK2基因表達，可為骨髓增殖性疾病的治療提供新的方法。
文檔編號C12P19/34GK101892251SQ200910051739
公開日2010年11月24日 申請日期2009年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月20日
發(fā)明者關(guān)明, 劉維薇, 張心菊, 許小平, 許笑, 陳勤奮, 陳波斌, 顧小葉, 馬瑋哲 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院