專利名稱：3-甾酮-9α-羥基化酶基因、3-甾酮-9α羥基化酶還原酶基因、相關(guān)載體和工程菌及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及3-甾酮-9a-羥基化酶及其還原酶技 術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種3-甾酮-9a-羥基化酶基因、 一種3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因、 相關(guān)栽體和工程菌及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甾體化合物(Steroids)又稱類固醇，是一類以環(huán)戊烷多氫菲為母核，結(jié)構(gòu)相似的化合 物。其基本結(jié)構(gòu)如下所示，由三個(gè)六元環(huán)和一個(gè)五元環(huán)纟且成，分別稱為A、 B、 C、 D環(huán)， 在母核的第IO、 13位有曱基，第3、 11、 17位可能有羥基、酮基或烷基，A、 B、 C與D環(huán) 可有雙鍵，17位上常有長短不同的側(cè)鏈。由于甾體母核上取代基、雙鍵位置或立體構(gòu)型 等的不同，形成了 一系列具有獨(dú)特生理功能的化合物。
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9a-羥基甾體化合物是制備9-卣代腎上腺皮質(zhì)激素與11-酮基甾體的重要前體物，具有 9a-羥基化功能的微生物多是甾體化合物的降解菌，例如紅球菌、分枝桿菌、簡單節(jié)桿菌、 鏈霉菌、諾卡氏菌等，這些菌不能直接應(yīng)用于生產(chǎn)。國外已通過菌種選育、反應(yīng)體系優(yōu) 化等工作，使分枝桿菌與紅球菌在對(duì)甾體側(cè)鏈解的同時(shí)實(shí)現(xiàn)甾體的-9a-羥基化，但由于生 產(chǎn)效率不高、有甾體l-位脫氫等副反應(yīng)存在，因而近幾年有學(xué)者通過對(duì)紅球菌甾體l-位脫 氫酶的敲除研究，獲得了無甾體l-位脫氫副反應(yīng)的基因工程菌。因此，如果能夠克隆鑒 定9a-羥基化酶基因，從而構(gòu)建相關(guān)高效表達(dá)載體，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)9a-羥基化酶的高效表達(dá)，這 必將大大提高相關(guān)甾體藥物的生產(chǎn)效率，并減少副反應(yīng)發(fā)生。
當(dāng)今甾體藥物生產(chǎn)采用的是微生物轉(zhuǎn)化與化學(xué)轉(zhuǎn)化相結(jié)合的方法，其中 一些微生物
轉(zhuǎn)化反應(yīng)在轉(zhuǎn)化效率、反應(yīng)選擇性、環(huán)境友好性等方面具有化學(xué)轉(zhuǎn)化法不可比擬的優(yōu)勢(shì)， 因此在甾體藥物的生產(chǎn)中占有重要地位，得到了大規(guī)模應(yīng)用。
作為甾體藥物工業(yè)生產(chǎn)體系中的瓶頸環(huán)節(jié)， 一些微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)嚴(yán)重制約著甾體醫(yī)
7藥產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，同時(shí)也是甾體藥物生產(chǎn)成本高昂的一個(gè)重要原因。我國甾體醫(yī)藥生 產(chǎn)企業(yè)眾多，產(chǎn)值巨大，針對(duì)當(dāng)前一些重要的甾體微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，成功進(jìn)行高效生產(chǎn) 菌抹的改造與開發(fā)，必將受到產(chǎn)業(yè)界的歡迎，從而從整體上大大提升我國甾體醫(yī)藥產(chǎn)業(yè) 的生產(chǎn)水平，其產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益將是十分可觀的。
針對(duì)甾體醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)體系中的重要微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，通過基因工程技術(shù)改造，開 發(fā)高效微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，可大大提高甾體藥物的生產(chǎn)效率與產(chǎn)品品質(zhì)，有助于降低甾體 藥物生產(chǎn)過程中的能耗、提高藥物前體的利用率、簡化生產(chǎn)步驟，降低生產(chǎn)成本，從而 有助于甾體藥物價(jià)格的下降。此外，微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好，屬綠色化工 技術(shù)，大力推廣其在生產(chǎn)中的應(yīng)用，是社會(huì)可持續(xù)性發(fā)展的必然要求。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的就是針對(duì)上述存在的問題與不足，提供一種3-甾酮-9ot-羥基化酶基 因、 一種3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因、相關(guān)載體和工程菌及應(yīng)用，采用這些工程菌可 以進(jìn)行3-甾酮-9a-羥基化，可以大大提高甾體藥物的生產(chǎn)效率與產(chǎn)品品質(zhì)，有助于降低甾 體藥物生產(chǎn)過程中的能耗、提高藥物前體的利用率、簡化生產(chǎn)步驟，降低生產(chǎn)成本，且 反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好，適合于大力推廣應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供了一種3-甾酮-9a-羥基化酶基因，其特點(diǎn)是， 所述3-甾酮-9a-羥基化酶基因編碼SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其無義突變序列。根 據(jù)本發(fā)明的3-甾酮-9a-羥基化酶基因，可實(shí)現(xiàn)多種基因工程菌抹的構(gòu)建，包括無3-甾酮-9a-幾基化酶活性或高3-甾酮-9a-羥基化酶活性的菌林。
較佳地，所述3-甾酮-9a-羥基化酶基因與SEQ ID NO:l所示序列的第1328-2516位核芬 酸序列具有70 %以上的一致性，更優(yōu)的是具有87%以上的一致性或與所述SEQ ID NO: 1所 示序列具有60%以上的 一致性。SEQ ID NO: 1所示序列的其余核苷酸序列含有該酶的調(diào)控 元件與鄰近基因片段。
較佳地，所述3-甾酮-9a-羥基化酶基因編碼的蛋白序列與所述氨基酸序列具有75 %以 上的 一致性，更優(yōu)的是具有80%以上的 一致性，又更優(yōu)的是具有90 %以上的 一致性。
較佳地，所述3-甾酮-9a-輕基化酶基因來源于分枝桿菌屬微生物。
更佳地，所迷分枝桿菌屬微生物是快速生長型分枝桿菌。
更進(jìn)一步地，所述快速生長型分枝桿菌是M，Wa"en、w印.NRRL B-3683與B-3805,更進(jìn)一步地，所述快速生長型分枝桿菌是MjcoZ)acten'w附NwIB-01,保藏編 號(hào)是CCTCCM 209094。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種3-甾酮-9a-羥基化酶，其特點(diǎn)是，所述3-甾酮-9a-羥基化酶是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其無義突變序列。
較佳地，所述3-甾酮-9a-羥基化酶與所述氨基酸序列具有75。/。以上的一致性，更優(yōu)的 是具有80%以上的 一致性，又更優(yōu)的是具有90 %以上的 一致性。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種基因工程表達(dá)載體，其特點(diǎn)是，所述表達(dá)載體整 合有上述的3-甾酮-9a-羥基化酶基因。
較佳地，所述表達(dá)載體是細(xì)菌表達(dá)載體、酵母表達(dá)栽體或哺乳動(dòng)物表達(dá)栽體。
更佳地，所述細(xì)菌表達(dá)栽體是大腸桿菌表達(dá)栽體、鏈霉菌表達(dá)載體或分枝桿菌表達(dá) 載體。
更進(jìn)一步地，所述大腸桿菌表達(dá)載體是pET表達(dá)載體，所述鏈霉菌表達(dá)載體是pLMJ 鏈霉菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體，所述分枝桿菌表達(dá)載體是pFZ36分枝桿菌整合載體或 pAL5000或pFZ2分枝桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體。所述pET系列質(zhì)粒載體宿主菌為大腸 桿菌BL21用熱激方法導(dǎo)入，所述pLMJ鏈霉菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體宿主菌為變鉛青鏈 霉菌用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入，所述pAL5000或pFZ2分枝桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體、 pFZ36分枝桿菌整合載體利用電轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入。
可以理解，通過基因操作可以實(shí)現(xiàn)3-甾酮-9a-羥基化酶在多種微生物中的表達(dá)。在本 發(fā)明的另一方面，提供了一種基因工程表達(dá)菌抹，其特點(diǎn)是，所述基因工程表達(dá)菌抹含 有上述的細(xì)菌表達(dá)載體或者整合有上述的3-甾酮-9a-羥基化酶基因。
較佳地，所述細(xì)菌表達(dá)栽體是大腸桿菌表達(dá)載體、鏈霉菌表達(dá)載體或分枝桿菌表達(dá) 栽體，相應(yīng)地，所述基因工程表達(dá)菌抹是大腸桿菌、鏈霉菌或分枝桿菌。
更佳地，所述大腸桿菌表達(dá)栽體是pET表達(dá)載體，所述鏈霉菌表達(dá)栽體是pLMJ鏈霉 菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)栽體，所述分枝軒菌表達(dá)栽體是pFZ2分枝桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá) 載體、pFZ36分枝桿菌整合栽體或pAL5000或pFZ2分枝桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體，相 應(yīng)地，所述大腸桿菌是BL21菌抹，所述鏈審菌是變鉛青鏈霉菌S^e/7f(w^cM //v/tto附，所 述分枝桿菌是jVfyco6ac,e〃-, NRRL B-3683與B-3805、 A^coZ>acfe;-/ww ，egwa/7纖、
9在本發(fā)明的另 一方面，提供了上述的基因工程表達(dá)菌林在降解甾醇制備9a-羥基雄甾 -4-烯-3,17-二酮(9aOH-AD)中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的另一方面，提供了上述的基因工程表達(dá)菌抹在對(duì)3-酮甾體化合物進(jìn)行901-羥基化反應(yīng)制備3-酮-9a-鞋基甾體化合物中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分枝桿菌基因工程突變菌林，其特點(diǎn)是，通過突 變上述的3-甾酮-9a-羥基化酶基因，并通過同源重組構(gòu)建獲得。即通過基因操作實(shí)現(xiàn)3-甾 酮-9a-羥基化酶功能的失活，失活可以是活性完全喪失或部分喪失，來構(gòu)建無3-甾酮-901-羥基化酶活性的分枝桿菌基因工程菌抹，其通過對(duì)3-甾酮-9a-羥基化酶基因進(jìn)行耙向性 的、無標(biāo)記性的基因工程操作實(shí)現(xiàn)。
較佳地，所述突變是缺失或點(diǎn)突變所述3-甾酮-9a-羥基化酶基因。可對(duì)SEQIDNO:l 的任一部分與任一 長度的基因片段進(jìn)行缺失或?qū)EQ ID NO: 1中任 一位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變。
在本發(fā)明的另 一方面 > 提供了上述的分枝桿菌基因工程突變菌抹在降解甾醇制備雄 甾-4-烯-3,17-二酮(AD)中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的另 一方面，提供了上述的分枝桿菌基因工程突變菌抹在降解甾醇制備雄 甾-l,4-二烯-3，17-二酮(ADD)中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的另 一 方面，提供了上述的分枝桿菌基因工程突變菌林在降解甾醇制備9a-雄甾-4-烯-3 ， 17-二酮(9aOH-AD)中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因，其特點(diǎn)是，所述 3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因編碼SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其無義突變序列。
較佳地，所述3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因與SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有 70%以上的一致性，更優(yōu)的是具有80。/。以上的一致性，又更優(yōu)的是具有85%以上的一致 性。
較佳地，所述3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因編碼的蛋白序列與所述氨基酸序列具有 70 %以上的 一致性，更優(yōu)的是具有80%以上的 一致性，又更優(yōu)的是具有85 %以上的 一致性。
較佳地，所述3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因來源于分枝桿菌屬微生物。 更佳地，所述分枝桿菌屬微生物是快速生長型分枝桿菌。
更進(jìn)一步地，所述快速生長型分枝桿菌是Mj;coZ)""er/iwz ip. NRRL B-3683與B-3805、 Myco6a"e''i, 扁eg附油'，、 Afyco6ac/er/ww ybr/w/ZwOT 、 j^fycoZ ""en'請(qǐng) gf/v畫、更進(jìn)一步地，所述快速生長型分枝桿菌是Myco/u "ehww weoawww NwIB-Ol,保藏編 號(hào)是CCTCCM 209094。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶，其特點(diǎn)是，所述3-甾 酮-9a-羥基化酶還原酶是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其無義突變序列。
較佳地，所述3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶與所述氨基酸序列具有70。/。以上的一致性， 更優(yōu)的是具有80%以上的一致性，又更優(yōu)的是具有85%以上的一致性。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種基因工程表達(dá)載體，其特點(diǎn)是，所述表達(dá)載體整 合有上述的3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因。
較佳地，所述表達(dá)載體是細(xì)菌表達(dá)載體、酵母表達(dá)栽體或哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。
更佳地，所述細(xì)菌表達(dá)載體是大腸桿菌表達(dá)載體、鏈霉菌表達(dá)載體或分枝桿菌表達(dá) 載體。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種基因工程表達(dá)菌抹，其特點(diǎn)是，所述基因工程表 達(dá)菌抹含有整合有上述的3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因的細(xì)菌表達(dá)載體或者整合有上 述的3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因。
較佳地，所述細(xì)菌表達(dá)栽體是大腸桿菌表達(dá)載體、鏈霉菌表達(dá)載體或分枝桿菌表達(dá) 栽體，相應(yīng)地，所述基因工程表達(dá)菌林是大腸桿菌、鏈霉菌或分枝桿菌。
較佳地，所述基因工程表達(dá)菌林還含有整合有上述的3-甾酮-9a-羥基化酶基因和/或 整合有上述的3-甾酮-9a-羥基化酶基因的細(xì)菌表達(dá)載體。可以用含有3-甾酮-9a-幾基化酶 基因和/或3-甾酮-9a-幾基化酶的還原酶基因的載體轉(zhuǎn)化分枝桿菌或鏈霉菌或大腸桿菌， 使3-甾酮-901-羥基化酶體系在分枝桿菌或鏈霉菌或大腸桿菌中高活性表達(dá)。
分枝桿菌或鏈霉菌較佳地如上所述。3-甾酮-9a-羥基化酶和3-甾酮-901-羥基化酶的還 原酶在分枝桿菌或鏈霉菌中可以通過表達(dá)性重組載體進(jìn)行表達(dá)，所用重組基因工程載體 為低拷貝型或高拷貝型的分枝桿菌基因表達(dá)栽體；3-甾酮-9a-羥基化酶和3-甾酮-9a-羥基 化酶的還原酶在分枝桿菌中可以是整合在染色體上進(jìn)行表達(dá)的，通過靶向、無標(biāo)記的方 式進(jìn)行整合，3-甾酮-9a-羥基化酶基因和3-甾酮-9a-羥基化酶的還原酶基因在染色體上是 單拷貝或多拷貝整合的。
在本發(fā)明的另 一方面，提供了上述的具有3-甾酮-9a-羥基化酶基因和/或3-甾酮-9a-羥 基化酶還原酶基因的基因工程表達(dá)菌林在對(duì)3-酮基甾體化合物進(jìn)行9a-羥基化反應(yīng)制備3-酮-9a羥基甾體化合物中的應(yīng)用 。
11在本發(fā)明的另 一方面，提供了 一種新金分枝桿菌(Myco&ac/er/ww "eoawn/附)，所述 新金分枝桿菌的保藏編號(hào)是CCTCC M 209094。
較佳地，包括上述的3-甾酮-9a-羥基化酶基因和/或上述的3-甾酮-9a-輕基化酶還原酶 基因。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種雙組分式IA型末端氧化酶體系，其特點(diǎn)是，包括 上述的3-甾酮-9a-鞋基化酶基因編碼的3-甾酮-9a-鞋基化酶和上述的3-甾酮-9a-鞋基化酶 還原酶基因編碼的3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶。因此，3-甾酮-9&-羥基化酶與3-甾酮-9(1-羥基化酶的還原酶組成了雙組分式IA型末端氧化酶體系，即3-甾朋-9a-羥基化酶體系，該 酶體系可催化3-酮基甾體化合物為3-酮基-9a-雍基化甾體化合物。
在本發(fā)明的另 一方面，提供了上述的雙組分式IA型末端氧化酶體系在對(duì)3-酮甾體化 合物進(jìn)行9a-羥基化反應(yīng)制備3-酮-9a羥基甾體化合物中的應(yīng)用。
在上述應(yīng)用中可以采用上述基因工程菌株的全細(xì)胞或粗酶液進(jìn)行。
本發(fā)明提供了 一種3-甾酮-9a-羥基化酶基因及3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因，通過 構(gòu)建各種表達(dá)栽體并轉(zhuǎn)化相關(guān)菌抹，從而獲得多種高表達(dá)菌抹，采用該高表達(dá)菌抹或其 粗酶液可以用于催化生產(chǎn)3-甾酮9-a羥基化甾體化合物，可以大大提高甾體藥物的生產(chǎn)效 率與產(chǎn)品品質(zhì)，有助于降低甾體藥物生產(chǎn)過程中的能耗、提高藥物前體的利用率、簡化 生產(chǎn)步驟，降低生產(chǎn)成本，且反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好，適合于大力推廣應(yīng)用，具有較 高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
圖1為本發(fā)明的3-甾酮-9a-羥基化酶催化甾體化合物生成9a-鞋基化產(chǎn)物的反應(yīng)示意圖。
圖2為擴(kuò)增本發(fā)明的3-甾酮-9a-羥基化酶基因的一具體實(shí)施例的保守序列時(shí)的核酸電 泳圖。其中泳道l是DNA標(biāo)準(zhǔn)marker,泳道2 4是相同的PCR重復(fù)。
圖3為擴(kuò)增圖2的具體實(shí)施例的全序列的電泳圖。其中泳道1是DNA標(biāo)準(zhǔn)marker,泳道 2-3是相同的PCR重復(fù)。
圖4為pET-MS.KSH載體構(gòu)建過程的酶切驗(yàn)證圖謙。其中泳道l是DNA標(biāo)準(zhǔn)marker,泳 道2是pET-MS.KSH經(jīng)Nco I、 Hind III雙酶切結(jié)果，泳道3是pET-MS.KSH重組質(zhì)粒單酶切 結(jié)果。
圖5為基因工程菌BL21/MS.KSH( NwIB-901)的表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖，其中， 泳道l為0小時(shí)的全菌，泳道2為加IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)后的全細(xì)胞蛋白電泳圖；泳道3為加IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)后破菌離心上清可溶表達(dá)蛋白；泳道4為加IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)后破菌離心包涵體； 泳道5為蛋白電泳標(biāo)準(zhǔn)Marker;泳道6為加IPTG誘導(dǎo)過夜后的全細(xì)胞蛋白電泳圖；泳道7 為加IPTG誘導(dǎo)過夜后破菌離心上清可溶表達(dá)蛋白。
圖6為圖5的基因工程菌BL21/MS.KSH ( NwIB-901 )的表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化AD的反應(yīng)產(chǎn)物 TLC層析圖譜。泳道l, 2分別為BL21/MS.KSH轉(zhuǎn)化AD的反應(yīng)產(chǎn)物；泳道3為底物AD層析 圖譜；泳道4， 5分別為原始菌種AfycoZw"en'ww "eoowww NwIB-01轉(zhuǎn)化底物的層析圖。
圖7為含有本發(fā)明的3-甾酮-9a-羥基化酶基因及3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶的表達(dá)載 體的酶切驗(yàn)證電泳圖。泳道1為DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker;泳道2為Xho1 Nco I雙酶切驗(yàn)證；泳道3 為Hind III Xhol雙酶切驗(yàn)證；泳道4為Hind III單雙酶切驗(yàn)證。
圖8基因工程菌NwIB-901、 NwIB-906、 NwIB陽術(shù)、NwIB-908轉(zhuǎn)化雄甾-4-烯-3，17匿 二酮(AD)制備9a-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9a-OH-AD )。
圖9基因工程菌NwIB-902、 NwIB-903、 NwIB-904、 NwIB扁905、 NwIB-卯9、 NwIB-910 轉(zhuǎn)化降解甾醇生產(chǎn)9a-羥基雄甾-4-烯-3，17-二酮(9a-OH-AD)、雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD ) 與雄甾-l,4-二烯-3,17-二酉同(ADD)。
菌林Myco^""/ww NwIB-Ol ，保藏時(shí)間2009年4月28號(hào)，保藏地點(diǎn)是武漢
中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)是CCTCC M 209094。
具體實(shí)施例方式
為更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí) 施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí) 驗(yàn)室手冊(cè)》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件進(jìn)行。
在本發(fā)明的實(shí)施例中使用的大腸桿菌BL21、 JM109、 DH5a、 TOP10、及pET22、 pET28、 pET32載體均購自Novagen公司，引物均由大連寶生物(Takara)公司合成。
實(shí)施例l 3-甾酮-9a-羥基化酶基因(KSH)的獲得
發(fā)明人自行篩選到了一抹降解甾體化合物的菌抹，經(jīng)鑒定為分支桿菌屬，命名為 Myco^"eWw附NwlB匿Ol，寸果藏編號(hào)是CCTCC M 209094。本實(shí)施例通過PCR方 法從該菌林克隆到3-甾酮-9a-羥基化酶的全基因序列。 1.1、 3-甾酮-9a-羥基化酶基因保守序列的獲得通過基因同源比對(duì)以下四林分支桿菌(數(shù)據(jù)來源于NCBI,序列號(hào)見后)
Mycobacterium avium 104 ( gb|CP000479.1|)
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 ( gb|CP000511.1|)
Mycobacterium gilvum_PYR-GCK ( gb|CP000656.1|)
Mycobacterium smegmatis str. MC2 155 ( gb|CP000480.1|) 得到分支桿菌中3-甾酮9a-羥基化酶的保守序列，利用軟件Oligo 6.0及Primer 5.0設(shè)計(jì)
兼并引物，利用降落及熱不均衡PCR擴(kuò)增新金分支桿菌3-甾酮9a-羥基化酶基因的部分序 列。PCR引物為KSH-l和KSH-2，其序列分別如下
KSH-1: 5，-TGCCCGTTCCACGACTG-3，；
KSH-2: 5，-CAGCAGCGGRTTGTCGAT隱3'。
以所篩選的菌林總DNA為模板，以引物KSH-l和KSH-2為引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具 體條件如下
取適量的模板DNA 2pL, 10xPCR Buffer 2pL, 25mM MgCl2 1.6pL， 2.5 mM dNTP 1.6nL,引物(20nmol/L)各lnL, Taq DNA聚合酶1 U,補(bǔ)水至總體積20pL。見下表。
表l PCR反應(yīng)體系(20 nL ) Table 1 PCR amplification system(20 jiL)
ConpoiicntsVolumeFinal concentration
ddH209單
10xPCR Buffer2都L2.0mmol/L
MgCl21.6pL1.6mmol/L
dNTPl單1.6mmol/L
Primer Gjl攀20(_imol/L
Primer G2l都L20)nmol/L
Template2.0jxL
rTaq DNA polymerase1都L
反應(yīng)過程95。C5min; 95°C 30s, 56°C 30s， 72°C 60s, 30個(gè)循環(huán)；72°C 10min。 將獲得的PCR產(chǎn)物(3個(gè)重復(fù))進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，根據(jù)圖2結(jié)果，回收約500-800bp
的片段，并將其克隆至載體pMD19-T (購于TaKaRa公司)中測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，獲得
的PCR產(chǎn)物符合預(yù)期，經(jīng)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)為M.S-AT57/基因的保守序列。
1.2、全長3-甾酮9a-羥基化酶基因MS-^SE的獲得
14根據(jù)保守序列，設(shè)計(jì)并合成用于擴(kuò)增全長MS-iCS/Z基因的PCR引物叩-1、 up-2和 down-l、 down-2，其中，up-l、 up-2用于擴(kuò)增保守序列的上游片段，down-l、 down-2用 于擴(kuò)增保守序列的下游片段，其序列分別如下所示
up-l: 5'- CCCTCGTGGTCATGCCAGACGAAGAGCAG -3';
叩-2: 5，- GCCACTACCCGGTCAGTCAGGACTCCTT陽3，；
down-1: 5 ，- CGCATACTGCGCCAACTGCCGTTTTGTAG -3,;
down-2: 5'- CGGCTTGCCGTCGAGGTAGTCCTTCAC -3'。
染色體走讀(Chromosome walking )具體實(shí)施方法如下
1. 從菌液樣本提取全基因組DNA;
2. 根據(jù)保守片段序列設(shè)計(jì)染色體走讀引物；
3. 分別用粘性末端DNA內(nèi)切酶(五coRI，//Zmffll， Saw3Al和PWl)將基因組消化并分 別純化；
4. 將純化的片段分別與相應(yīng)接頭Cassette ( ￡coRI Cassette,//z"i/HI Cassette, 5""w3AI Cassette和尸sfI Cassette )連才委，即得到四種GenomeWalker libraries, 直"l矣以這四種 GenomeWalker libraries作模板，用通用引物C1 (設(shè)計(jì)為與Cassette配對(duì)退火)和基因特異 性引物S1 (分別用upstream和downstream)為引物對(duì)，進(jìn)行PCR。采用巢式和嵌套PCR程 序30循環(huán)(94°C， 30秒；55°C 2分鐘；72。C， l分鐘)有PCR產(chǎn)物膠回收純化；
5. 為提高擴(kuò)增特異性，采用巢式PCR策略，將上步產(chǎn)物稀釋50倍作模板，用通用引 物C2 (設(shè)計(jì)為與Cassette配對(duì)退火)和基因特異性引物S2 (分別用upstream和downstream ) 為引物對(duì)，進(jìn)一步PCR。產(chǎn)物純化、克隆、測(cè)序分析，得到保守序列上、下游序列，拼 接后得全長基因，命名為M.S-ATS//。
運(yùn)用GeneBank中的ORF finder將測(cè)序得到的DNA序列翻譯成氨基酸序列，再用 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)程序?qū)怂岷偷鞍仔蛄羞M(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如下
根據(jù)測(cè)序和比對(duì)結(jié)果，得到的全長3-甾酮9a-羥基化酶基因MS-KS7/序列如SEQ ID NO:l所示，同時(shí)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，擴(kuò)增到的酶為新的3-甾酮9a-羥基化酶，與已報(bào)道 i^oifococc^ eoV&o;wfc中3 -甾酮9a-羥基化酶的核苷酸同源度為70%,蛋白同源度為 69% ( 7 /zot/ococ eo^ropo/"中的KSH是GeneBank中唯一標(biāo)示的3-甾酮-9a-羥基化酶基 因)。
實(shí)施例2 3-甾酮-9a-羥基化酶過表達(dá)的大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建 2.1、基因3-甾酮9a-羥基化酶的克隆根據(jù)3-甾酮9a-羥基化酶(MS-/:S//)全長基因序列，設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增引物KSH-Q和 KSH-H,其序列如下所示
KSH々5'- CGCCCATGGCCGTGACTACCGAGACAG -3，； KSH-H: 5' - CGAAGCTTTCAGCTCGGCTGCGCGGACT -3,。
其中，在引物KSH-Q上引入NcoI酶切位點(diǎn)，在引物KSH-H上引入HindIII酶切位點(diǎn)。 以所篩選的野生菌抹總DNA為模板，以引物KSH-Q和KSH-H為引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，具體條件如下
反應(yīng)體系Tag酶緩沖液5pl，模板lpl, dNTP4pl，上下游引物各lpl,純水33iiL 反應(yīng)過程95°C 5min; 95°C 30s， 56°C 30s， 72。C 90s, 30個(gè)循環(huán)；72°C 10min。 將PCR產(chǎn)物(2個(gè)重復(fù))進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，根據(jù)圖3結(jié)果，回收 大小約1200bp的片段。
2.2、 重組表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化
將實(shí)施例2.1得到的片段經(jīng)Nco I、 Hind III雙酶切，目的DNA片段回收純化后，與同 樣經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切過的質(zhì)粒pET-22b(+)(約5.5kb)在T4 DNA連接酶的作用下，16。C連 接，篩選，得到重組質(zhì)粒pET-MS.KSH。雙酶切驗(yàn)證所得的重組質(zhì)粒，見圖4。將其測(cè)序， 測(cè)序結(jié)果顯示，克隆入的3-甾酮9a-幾基化酶基因序列如SEQ ID NO:l所示。4安常M^方法 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,獲得生產(chǎn)3-甾酮-9a-羥基化酶的基因工程菌NwlB-卯l。
2.3、 工程菌表達(dá)及優(yōu)化 從轉(zhuǎn)化平板上任意挑取1個(gè)實(shí)施例2中獲得的NwIB-01菌落，接入2mL含有75ng/mL
氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37。C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，加入IPTG至終濃度1 mmol/L, 在誘導(dǎo)的不同時(shí)間(如0.5、 1、 2、 3、 4和5h)。離心收集菌體，超聲破菌，離心收集上清， SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖5所示。根據(jù)圖5結(jié)果，MS.KSH蛋白主要為可溶表達(dá)，且蛋白 表達(dá)量較高，在約40kDa處看到清晰條帶，與預(yù)期的3-甾酮9a-羥基化酶大小吻合。隨著 誘導(dǎo)時(shí)間的延長，可溶性蛋白所占比例明顯提高，在低溫誘導(dǎo)過夜情況下，大部分蛋白 為可溶性表達(dá)。
2.4、 表達(dá)產(chǎn)物鑒定
取適量上述工程菌細(xì)胞胞漿，加入終濃度分別為3.5 (iM的spinach ferredoxin, 0.1 units 的『60^(1( 111"^八0 + reductase和20 pM的AD,于30。C下^f呆溫5 min。再加入終濃度為1 mM 的NADPH,使反應(yīng)體積最終定格在2ml，于30。C空氣浴中緩慢搖動(dòng)2 h,進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。 最終用同體積的乙酸乙酯萃取反應(yīng)液三次，真空干燥，適量色譜純曱醇復(fù)溶后，用C-18
16柱HPLC液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)分析。結(jié)果如圖8所示，加入的底物AD中有一部分被轉(zhuǎn)化為產(chǎn) 物9a-OH-AD。
薄層層析(TLC):展開劑采用石油醚/乙酸乙酯(6:4至7:3);薄板采用煙臺(tái)硅膠廠 出品的5xl0cm的預(yù)制板；顯色，采用20%的硫酸溶液均勻噴淋，并于100。C烘箱內(nèi)烘 烤5min至顯出斑點(diǎn)。結(jié)果如圖6所示
實(shí)施例3 3-甾酮-9a-羥基化酶基因在分枝桿菌的過表達(dá)和整合表達(dá)
利用pAL5000和pFZ2分枝桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體將3-甾酮9a-輕基化酶基因重 新導(dǎo)入分枝桿菌，以使原始分枝桿菌菌種中的3-甾酮-9(1-羥基化酶基因過表達(dá)。 所用引物序列如下
U:CGGGGATCCGTGACTACCGAGACAG D:GGCAAGCTTTCAGCTCGGCTGCGCGGACT
PCR反應(yīng)體系退火條件經(jīng)優(yōu)化確定為56.5。C卯s。從分枝桿菌中克隆出1.2kb的KSH基 因，經(jīng)回收與載體pMD19-T連接，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒，測(cè)序-瞼證。用限制性內(nèi)切酶BamHI、 H i nd III雙酶切克隆栽體，回收插入到經(jīng)相同酶切的分枝桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒 pAL5000和pFZ2中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAL5000-KSH和pFZ2-KSH,經(jīng)序列測(cè)定證實(shí)含有KSH 基因，且基因序列和閱讀框架正確。
電轉(zhuǎn)重組質(zhì)粒pAL5000-KSH或pFZ2進(jìn)入分枝桿菌(以NwIB-201例，該菌是NwIB-Ol 的衍生菌林，該菌林的3-甾酮-A"-脫氫酶已被失活，因而該菌降解甾醇只生成AD)并用卡 那霉素平板進(jìn)行篩選。所得工程菌命名為NwIB-902(低拷貝)，NwIB-卯3(多拷貝)
利用pFZ36分枝桿菌整合表達(dá)載體將3-甾酮9a-羥基化酶基因?qū)敕种U菌整合(以 NwIB-20I例，該菌是NwIB-01的衍生菌抹，該菌抹的3-甾S同-zV-脫氫酶已被失活，因而 該菌降解甾醇只生成AD)。最終基因整合表達(dá)菌種命名為NwIB-卯4 (單拷貝)， NwIB-905(多拷貝)。
所用引物序列如下
U:GACGAATTC GTGACTACCGAGACAG D:CGCAAGCTTTCAGCTCGGCTGCGCGGACT
整合質(zhì)粒pFZ36構(gòu)建、電轉(zhuǎn)及篩選同上。PCR反應(yīng)體系退火條件經(jīng)優(yōu)化確定為58。C， 2 min， PCR產(chǎn)物克隆入質(zhì)粒pMD19-T中，用限制性內(nèi)切酶ECORI、 HindIII雙酶切克隆栽 體，回收插入到經(jīng)相同酶切的分枝桿菌-大腸桿菌穿梭整合質(zhì)粒pFZ36。實(shí)施例4 3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因的得到
通過對(duì)已知分枝桿菌3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因的分析，選擇了紅串紅球菌和三 抹分技桿菌的3-甾酮-9a-羥基化酶基因進(jìn)行基因同源比對(duì)(數(shù)據(jù)來源于NCBI，序列號(hào)見 后)
7 /zottococciw ef7r7j/-o/>o//s ( gb|AY083509.11); A/戸6a"er/臓謝 (gb|CP000479.1|) Af戸k "m'畫v朋Z (3!a/固7 PYR-1 ( gb|CP000511.1|); A/》v:oZv "e/7'w/w jwegw"/7、 str. MC2 155 ( gb|CP000480.1|);
在得到分枝桿菌中3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶保守序列的相關(guān)信息之后，利用軟件 Oligo 6.0及Primer 5.0設(shè)計(jì)兼并引物，利用降落及熱不均衡PCR擴(kuò)增分枝桿菌 Mycobacterium neoaumm NwIB-01的部分序歹寸。
設(shè)計(jì)的兼并引物如下
KSHB-U1: 5 ， -TGRCAGGCCAGGAWSAGNCC-3'; KSHB-U2: 5'-CCGCAGYKGCCCTCNCGGCA-3，； KSHB-U3: 5'陽SANCGAYTCCAGCCAGTGCA隱3'; KSHB-U4: 5'-SCTCGTCRCGGTTGGCGTAG-3，； KSHB-D1: 5 ，-TCACMCCGRTSATGTCGATC-3，； KSHB-D2: 5'-SAACTGGYTGTGYGACAACG-3，； KSHB-D3: 5 ，-TCGGTGGCNCGCTGCTAYTC-3';
以Myt'o6a"e〃'ww7 NwIB-01的基因組DNA為沖莫板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用PCR反
應(yīng)體系如下取適量的模板DNA2pL， 10xPCR Buffer 2fiL, 25mM MgCl21.6fiL, 2.5 mM dNTP1.6iaL,引物(20nmol/L)各lpL， Taq DNA聚合酶1 U，補(bǔ)水至總體積20)aL。所用 PCR反應(yīng)程序如下94。Cl分鐘，50。C30秒，72°C 1.5分鐘，30個(gè)循環(huán)。
通過NCBI Blastn比對(duì)，通過上述方法獲得的3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因的保守 序列。與紅串紅球菌i /w6tococcws eo^n)pofo中3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶有65%的同源 性，和恥垢分枝桿菌Myco6ac"r/ww2 swegwato str. MC2 155有77%的同源性，和結(jié)核分枝 4干菌AfycoZ)a"e,/ww fw6ercw/cw、有73。/8的同源4生。
得到部分保守序列后利用Genome-Walking克隆基因全長(方法如前所述)。
實(shí)施例5 3-甾酮-9a-羥基化酶及其還原酶基因的共表達(dá)
才艮據(jù)A^coZ)flc eWzw "eoawraw NwIB-01的基因走讀已知序列分別設(shè)計(jì)3-甾酮-9a-羥基化酶及3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶引物。
KSHU: 5'- CGCCCATGGCCGTGACTACCGAGACAG -3， j KSHD: 5'- CGAAGCTTTCAGCTCGGCTGCGCGGACT -3'
KSHBD: 5，- GAGACTCGAGCTANTCGTCRTAGGTGACTT-3，
其中，在引物KSHU上引入Nco I酶切位點(diǎn)，在引物KSHD上引入Hind III酶切位點(diǎn)， 在引物KSHBU上引入Hind III酶切位點(diǎn)，在引物KSHBD上引入XhoI酶切位點(diǎn)。在引物兩 端分別引入酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，為了增加翻譯效率在正向引物還引入了核糖體結(jié)合位 點(diǎn)序列(SD)和間隔序列(aagaaggagatatacc),并把起始密碼子由GTG改為ATG,終止密碼子 由TAG改為TAA，符合大腸桿菌密碼子偏好。
將3-甾酮-9a-羥基化酶基因(KSHA)的克隆片段經(jīng)NcoI、 HindIII雙酶切，目的DNA 片段回收純化后，與同樣經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切過的質(zhì)粒pET-22b(+)(約5.5kb)在T4 DNA連 接酶的作用下，16。C連接，篩選，得到重組質(zhì)粒pET-MS.KSHA。
將3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因(KSHB)克隆片段經(jīng)Hindin、 Xhol雙酶切，目的 DNA片段回收純化后，與同樣經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切過的質(zhì)粒pET-MS.KSH (約6.8kb)在T4 DNA連接酶的作用下，16。C連接，篩選，得到重組質(zhì)粒GB-MS.KSHAB(約8.0kb)。酶切 驗(yàn)證(圖7)構(gòu)建的質(zhì)粒并按常規(guī)方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得共表達(dá)3-甾酮-901-羥基化酶與3-甾酮-901-羥基化酶還原酶的基因工程菌。所得工程菌命名為NwIB-906。
實(shí)施例6 3-甾酮-9a-羥基化酶鏈霉菌基因工程菌抹的構(gòu)建
利用pLMJ鏈霉菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體將3-甾酮-9a-羥基化酶基因重新導(dǎo)入鏈霉 菌宿主菌，以使鏈霉菌宿主菌中的3-甾酮-9a-羥基化酶基因過表達(dá)。宿主菌為變鉛青鏈霉 菌用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入。最終基因過表達(dá)菌種命名為NwIB-907(單拷貝)、NwIB-908 (多拷貝)。
所用引物序列如下
U:CGCCATATGGTGACTACCGAGACAG
D: CGGAATTCTCAGCTCGGCTGCGCGGACT
PCR反應(yīng)體系退火條件經(jīng)優(yōu)化確定為56。C 1.5 min。從分枝桿菌中克隆出1.2kb的KSH 基因，經(jīng)回收與載體pMD19-T連接，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)i正。用限制性內(nèi)切酶NdeI、 EcoRI雙酶切克隆載體，回收插入到經(jīng)相同酶切的pLMJ鏈霉菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒 中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pLMJ-KSH,經(jīng)序列測(cè)定證實(shí)含有KSH基因，且基因序列和閱讀框架正確。
利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pLMJ-KSH導(dǎo)入鏈霉菌。整合質(zhì)粒pLMJ72構(gòu)建、 電轉(zhuǎn)及篩選同上。
鏈霉菌原生質(zhì)體的制備在250 ml三角并瓦中加入25 ml鏈霉菌液體培養(yǎng)基然后加 入一定量的孢子懸液及所需的生長因子后在200 rpm搖床上培養(yǎng)36-40 h離心收集菌絲 體小心倒去上清液重新用10.3%蔗糖懸浮洗滌2次后離心倒去上清液打散，然后取適量 的菌絲體加入到5 ml緩沖液配制的溶菌酶溶液中溶菌酶終濃度2 mg/ml, 30。C溫育 15-60min。 3000 r/min離心10 min去上清用手指彈動(dòng)輕輕打散原生質(zhì)體沉淀塊后加入15 ml P緩沖液洗滌3次離心及去上清。
實(shí)施例7 3-甾酮-9a-幾基化酶缺失的分枝桿菌基因工程菌林的構(gòu)建方法
構(gòu)建分枝桿菌基因敲除質(zhì)粒，該質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)化進(jìn)入分枝桿菌。利用卡納青霉素及潮 霉素進(jìn)行雙抗篩選，然后利用蔗糖平板進(jìn)行復(fù)篩，得到基因敲除克隆子。利用PCR方法 對(duì)上述克隆子進(jìn)行驗(yàn)證。最終針對(duì)不同的分枝桿菌菌抹，進(jìn)行3-甾酮-9a-羥基化酶基因的 缺失，所得菌種分別命名為NwIB-909、 NwIB-910。其中NwIB-909來源于NwIB-Ol; NwIB-910來源于NwlB-206, NwIB-206來源于NwIB-Ol,具有高3-甾S同-A、脫氮酶活性。
具體步驟如下
敲除質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)分枝桿菌M，oZ)arten'wm neoawram NwIB-01序列設(shè)計(jì)敲除上下游引物。
ksh國uu GGCCTGCAGCGATGCCGCCGAGGTGTACG ksh畫ud GGCAAGCTTCGGCTGTCTCGGTAGTCACG ksh-du CGCAAGCTTCGCAGCCGAGCTGATGACCA ksh陽dd CAGCGGCCGCCCCCCGCACTGACCGAGTCC 分別將目標(biāo)基因3-甾酮-9a-羥基化酶的上下游基因克隆到pMD19-T載體上，然后分別 用PstI、 HindIII, HindIII、 Notl酶切，酶切產(chǎn)物分別連接在經(jīng)相應(yīng)酶切的分枝桿菌基因敲 除質(zhì)粒pIL上。分別用PacI酶切上述質(zhì)粒和pGOAL19質(zhì)粒后進(jìn)行非定向連接，構(gòu)建基因敲 除質(zhì)粒MS-QCKSH。
2.敲除質(zhì)粒導(dǎo)入分支桿菌感受態(tài)制備 一級(jí)種子OD長到1.0左右，1。/。轉(zhuǎn)接二級(jí)種 子；24h后加入2。/。甘氨酸繼續(xù)培養(yǎng)24h。離心收集菌體，分四次用10%甘油沖洗懸浮菌體 并離心，最后加入lml甘油懸浮菌體，并分裝保存。電轉(zhuǎn)化1(Hd質(zhì)粒加入300pl感受態(tài)菌 體中放置10min，電擊條件如下12.5kv/cm、 25|xF、 20ms。3.重組子篩選電轉(zhuǎn)產(chǎn)物加入培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)3-24h，涂布培養(yǎng)基成分如下hyg 50ng/ml' Kn20嗎/ml、 X-gal 50pg/ml。經(jīng)SCO單交換菌挑取挑取帶藍(lán)斑菌落，pcr驗(yàn)證 和DSO雙交換菌挑取將驗(yàn)證好的SC0菌涂布含2。/。的蔗糖平板，挑取白色菌落。
實(shí)施例8 基因工程菌NwIB-901、 ISwIB-906、 NwIB-907、 NwIB-卯8在3-酮基甾體9a位羥 基化中的應(yīng)用
以AD作為底物為例，投料量為0.5-3%的條件下，轉(zhuǎn)化時(shí)間為5-10天，這些工程菌抹 對(duì)AD的轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖8所示，除NwIB-01外，AD的轉(zhuǎn)化率均在95。/。以上。 具體反應(yīng)過程可參照如下方式進(jìn)行
利用1%-10%的表面活性劑、聚合物或有機(jī)溶劑(例Tween80、乙醇、硅油、豆油等 等)等物質(zhì)對(duì)甾體化合物進(jìn)行助溶。采用兩級(jí)或三級(jí)培養(yǎng)，以1%-50%的種子接種最終的 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，甾體化合物可以在任一時(shí)間進(jìn)行投加。甾體轉(zhuǎn)化的條件是培養(yǎng)溫度25-37 。C,高溶氧值，pH可控在5.0-8.0之間，以薄層層析(TLC)或高效液相色譜(HPLC)分 析確定轉(zhuǎn)化反應(yīng)的結(jié)束時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后，齒體轉(zhuǎn)化物可用同體積的乙酸乙酯，氯仿等 有機(jī)溶劑萃取三次，合并反應(yīng)液，真空干燥，進(jìn)而進(jìn)行分析與產(chǎn)品制備。
對(duì)于AD為底物，采用l。/。-10。/。的Tween80和硅油為AD的助溶劑，在裝樣量為30毫升 的250毫升搖瓶中采用兩級(jí)培養(yǎng)，其中以3-30%的種子量接種含有0.5-3 %植物甾醇的二級(jí) 培養(yǎng)基，在26-35。C, 200-300rpm, pH 5.0-8.0之間的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)3-7天，AD轉(zhuǎn)化 率高于95%，生成9a-OH-AD。
薄層層析(TLC)的操作條件為展開劑采用石油醚乙酸乙酯(6:4至7:3 );薄板采 用煙臺(tái)珪膠廠出品的5xl0cm的預(yù)制板；顯色，采用20。/。的硫酸溶液均勻噴淋，并于IOO 。C烘箱內(nèi)烘烤5min至顯出斑點(diǎn)。
實(shí)施例9 基因工程菌NwIB-卯2、 NwIB-903、 NwIB-904、 NwIB-905、 NwIB-909、 NwIB-910 在甾醇降解制備AD與ADD中的應(yīng)用
以植物甾醇為底物，基因工程菌NwIB-902、 NwIB-卯3、 NwIB-904、 NwIB-卯5 、 NwIB-卯9、 NwIB-910可以降解轉(zhuǎn)化甾醇生產(chǎn)雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD )或雄甾-l，4-二烯 -3,17-二酮(ADD)或9a-雄甾-4-烯-3,17-二酮(9a-OH-AD),如圖9所示。具體反應(yīng)過程 類同于實(shí)施例8。
NwIB-902、 NwIB-903、 NwIB-904 、 NwIB-905轉(zhuǎn)化降解甾醇可生產(chǎn)9a-OH-AD; NwIB-909可降解轉(zhuǎn)化甾醇同時(shí)生成AD和ADD,其中ADD與AD的摩爾數(shù)之比約為10比1;NwIB-910則降解轉(zhuǎn)化甾醇只生成ADD,無其它代謝中間產(chǎn)物的積累。
綜上所迷，采用本發(fā)明的3-甾酮-9ct-鞋基化酶基因和/或3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基 因構(gòu)建的工程菌，可以大大提高甾體藥物的生產(chǎn)效率與產(chǎn)品品質(zhì)，有助于降低甾體藥物 生產(chǎn)過程中的能耗、提高藥物前體的利用率、簡化生產(chǎn)步驟，降低生產(chǎn)成本，且反應(yīng)條 件溫和、環(huán)境友好，適合于大力推廣應(yīng)用。
在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出 各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書和附圖應(yīng)被認(rèn)為是說明性 的而非限制性的。序列表
<110> 華東理工大學(xué)
<120> 3-甾酮-9a-鞋基化酶基因、3-甾酮-9a-幾基化酶還原酶基因、相關(guān)載體和工 程菌及應(yīng)用
<160> 4
<210> 1
<211> 3717
<212> DNA
<213> #斤金分4支斥干菌(il^coZ)flfc&n'w附weoflwn^n )
<220> <221> <222〉 <223>
gene
(1328)..(2516) 3-甾酮-9a-羥基化酶基因
<400> 1
ggcactgggt cacgcctatg gcggcggcgc gcagtacttc tcgatgtggg tcgtcggggc 60
cg3C肪gccc acccggtgac cgcaccggtg acgctggcgg gtcgacggtc gcgggaggcg 120
gccgtcgccc gcgacaaggc ggcctggctg gcggtgttcg ccgacgacgc gatcgtcgag 180
g3tccg3tcg gaccgtcgca "tttcgscccc gagggt犯gg gccatcgcgg casggaggcc 240
atcgccgcct tcttcgacaa ggcgatcgcc ccgagtcagc tcgaattccg cttcgagaag 300
3cctatgtct gcggccccga 3gaggcc犯c gtcgggcata tcgtgatcgt cgccggcggc 360
taccgcgtgg tggcagaggg cgtgttcacc taccgcgtga acgccgaggg caagattgct 420
gcgctgcgcg cctactggg3 3gtgg3caag gcgaccgcca gcgcacaacg ggtgtgacgg 480
ccgggtgtgc gggctccgst cgcgtaggct gggcagcgst ttcgtccgct aggtgtctcg .5幼
aattgatgtt gtcccgatca catgtagtcg ctgccgcact gctcgccgtc ggcctctccg 600 cctgcgctcc cagccagccg ggtgccccga gcagcgctgc gccgacgctg cccgcattca . 660
ccaccagcgc cactcccacg accaccgcgc ccgcgcaggc caccgactac acccggctac 720
tggtcaccgc cgccgatctc agtgacgccg aggacacctt caccgagcgg cacatcgaag 780
cctcaccagg cgggctgccg ggggcgagtg cgtttttcgt caacgccgag gacacccgcg 840
ccatcagctc gacgatcctg gtctacgaca acccgggcac cgccgcgacc gcgctcaagg 900卿cgcgggg cacgctgggt agcagggtga cgggaaaccc ggtgcccggc ggggtgggtc 960
cggacagcgt gatggtccgt ggcgccgacc cggacgaggc caaggacatc accgtgctga 1020
tgttcaccca gggtcgcgcg ctggcgcgcc tgg組tcca gagcgcgggc ggcgacgcca 1080
ccaccgacgg ctacgtgacc accgtcggca agatgcagca gatcgcgctg cgctccggtc 1140
tgcaagacga gaactgagcc ggcgcccggt accgccgggc gtgttcgata gctccagcta 1200
tctccagccg agccgcattc cgtcggttca tggctacaaa acggcagttg gcgcagtatg 1260
cgttgcgcac tgcccggtca犯actgtaac gtgttctagt tagagagacc兆atacggga 1320
ggcccaccgt gactaccgag acagccggca ttcgcgagat cgacaccggc gacctgcccg 1380
accgctatgc gcgcggttgg cattgcctgg gsccggtgaa ggactacctc gacggcaagc 1440
cgcacggggt ggagatcttc gacaccatgc tggtcgtctt cgccgactcc gagggtgagc 1500
tcaaggttct ggacggttac tgccggcaca tgggcggcaa cctcgcccag ggcaccatca 1560
agggtgacac cgtggcctgc ccgttccacg attggcgctg gggtggcgac ggcaagtgca 1620
agctcgtccc ctacgccaaa cgcacaccgc gcctggcccg cacccgcgcc tggcacaccg 1680
acgtacgcgg cgggctgctc ttcgtctggc atgaccacga gggcaaccca ccgcagcccg 1740
aggttcggat ccccgagatc cccgagttcg ccagcgacga ctggaccgac tggcggtgga 1800
acacgatgct catcgagggc tccaactgcc gcgagatcat cgacaacgtc accgacatgg 1860
cgcacttctt ctacatccac tacgggttgc cgacgtactt caagaacgtc ttcgagggcc 1920
acatcgccag ccagtaccta cacaacgtcg gccgtcccga cgtcaacgac ctgggcacca 1980
cctacggtga ggcgcacctg gattccgagg cgtcctetctt cggtccgtcg ttcatgatca 2040
actggctgca caacaactac ggcgggttca aggccgagtc gatcctgatc aaccgccact 2100
acccggtcag tcaggactcc ttcgtgctgc agtggggcgt catcgtcgaa aagcccaagg 2160
ggctcgatga gaagaccacc gaca兆ctgg cccgcgtctt caccgagggc gtctccaagg 2220
ggttcctgca ggacgtcgag atctggaagc acaeigscccg gatcgacaac ccgctgctgg 2280
tcgaggagga cggcgccgtc tatcagatgc gccgctggta tcagcagttc tacgtcgacg 2340
tcgccgacgt gacacccgat atgaccgacc gcttcgagat ggaggtcgac accaccatcg 2400
2460
cc^cgag肌gtggcatgtc gaggtcgagg
a^acctg犯 24
gctgcagcag gacgccgccg3gcaggscgc cgccgaacag ggtgagccgc犯aaagagtc cgcgcagccg agctgatgac 2520
cacgcatgac gagcgggccg gaacaccaga tattgacgat ctggcccgct ccatgctgct 2580
cctgcacggc ggacscgacg acgaggacga ccacgaccetc ccggaccccg tacgagtacc 2640
ggg￡ta_ctggt ccaaggcacc ggatttcagc tccgatccgc tccgggcggc ggcggtgcac 2700
g幼gccaccg agcgggacaa gcagcggtat ctgscctccg ggttggcctc agtggeictgc 2760
cggtactgtc atgccaccgt gcaggtcaag aagctgggca ccgaacacac gtcggtgcag 2820
tggaattcgg cggcgaccaa gcgctgcgcg gtctttcgac gagatccgtt cctccggcgg 2880
cgatccggca cgggcacgct cgtgccaccg gctcaccgac agcatc犯gc acgccatcgc 2940
cgagggatgc ctggaggaat tctccagcgc accctccccc ggcgacggct aggttctctc 3000
ttgcgatttc ggtgaggata cgtgcgcacg gcgtacgtat cctcaccgaa atccaaattc 3060
ccttg朋gcg ctccttgacc tgctcgtcgg tcagcccgta atcgctgagc gagtaggtat 3120
gcttgggtgc ccgcggcctt cttgctctcc tcgtggctgg cggtcatggc ctggcgcgcc 3180
gcatcggtga actcgatccc gaacgtgctg tagatcccct ccactgcggc gaccggatcc 3240
ttgatgaact cgaaat兆tc gacatcgcag aactgtgccg gatcatgctt ggcccgttcg 3300
gcgttgaaca gttccagccc acgggaccag gtctccaggg agtcctcgcc gatgaccttg 3360
ccggagaagc tgttcgacca gccctcggtg gtgtgctggg ccagtgagca catcgaggcc 3420
atgatcgtct cggccggccg gtggcattgc accaccagcg catcggggta ggcagcgaac 3480
aacgcgtcga gggcgaacag gtggctcgga ttcttgagca cccagcgctt ttcgggctcg 3540
ttgaggccga tcaactgcag gttcttgcga tgccgctgat aggacttggt ccagtcctgc 兆OO
tgggccagcc aacgcgaata ggtggggatg tgcgccaggg tctcatagga caccgaatgc 3660
agcg8ttgcc gteacagctg ccagcactct tcgacctcgt cggcggtcat gtagtgc 3717
<210〉 2 <211> 395 <212> PRT
<213〉 新金分枝桿菌(玲co6""m', weom/r,) <楊> 2
Val Thr Thr Glu Thr Ala Gly lie Arg Glu lie Asp Thr Gly Asp Uu1
10
15
Pro Asp Arg Tyr Ala Arg Gly Trp His Cys Leu Gly Pro Val Lys Asp 20 25 30
Tyr Leu Asp Gly Lys Pro His Gly Val Glu lie Phe Asp Thr Met Leu 35 40 45
Val Val Phe Ala Asp Ser Glu Gly Glu Leu Lys Val Leu Asp Gly Tyr 50 55 60
Cys Arg His Met Gly Gly Asn Leu Ala Gin Gly Thr lie Lys Gly Asp 65 70 75 80
Thr VaX Ala Cys Pro Phe His Asp Trp Arg Trp Gly Gly Asp Gly Lys 85 90 95
Cys Lys Leu Val Pro Tyr Ala Lys Arg Thr Pro Arg Leu Ala Arg Thr 100 105 110
Arg Ala Trp His Thr Asp Val Arg Gly Gly Leu Leu Phe Val Trp His 115 120 125
Asp His Glu Gly Asn Pro Pro Gin Pro Glu Val Arg lie Pro Glu lie 130 135 140
Pro Glu Phe Ala Ser Asp Asp Trp Thr Asp Trp Arg Trp Asn Thr Met 145 150 155 160
Leu lie Glu Gly Ser Asn Cys Arg Glu lie lie Asp Asn Val Thr Asp 165 170 175
Met Ala His Phe Phe Tyr lie His Tyr Gly Leu Pro Thr Tyr Phe Lys 180 185 190
Asn Val Phe Glu Gly His lie Ala Ser Gin Tyr Leu His Asn Val Gly 195 200 205
Arg Pro Asp Val Asn Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Gly Glu Ala His Leu 210 215 220
Asp Ser Glu Ala Ser Tyr Phe Gly Pro Ser Phe Met lie Asn Trp Leu 225 230 235 240
His Asn Asn Tyr Gly Gly Phe Lys Ala Glu Ser lie Leu lie Asn Arg 245 250 255
26His Tyr Pro Val Ser Gin Asp Ser Phe Val Leu Gin Trp Gly Val lie 260 265 270
Val Glu Lys Pro Lys Gly Leu Asp Glu Lys Thr Thr Asp Lys Leu Ala 275 280 285
Arg Val Phe Thr Glu Gly Val Ser Lys Gly Phe Leu Gin Asp Val Glu 290 295 300
lie Trp Lys His Lys Thr Arg lie Asp Lys Pro Leu Leu Val Glu Glu 305 310 315 320
Asp Gly Ala Val Tyr Gin Met Arg Arg Trp Tyr Gin Gin Phe Tyr Val 325 330 335
Asp Val Ala Asp Val Thr Pro Asp Thr Thr Asp Arg Phe Glu Met Glu 340 345 350
Val Asp Thr Thr lie Ala Asn Glu Lys Trp His Val Glu Val Glu Glu 355 360 365
Asn Leu Lys Leu Gin Gin Asp Ala Ala Glu Gin Asp Ala Ala Glu Gin 370 375 380
Gly Glu Pro Gin Lys Glu Ser Ala Gin Pro Ser 385 390 395
<210> 3 <211〉 1056 <212> DNA
<213> 新金分枝桿菌(Afyco6a"en.w附恥oawn/附) <220>
<221> 基因 <222> (1)..(1056)
<223> 3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因 <400> 3
atgacggagg agccgctcgg cagccatgtg ctggaactgg agatcgccgc cgtcgttgag gagaccgccg atgcccggtc gctcgtgttc gacatcccgg ccggcagcga tatgcccgcc gagaggttgc ggtactcgcc cggccagttc ctgacgctgc gcgtgcccag cgagcggscc ggatcggtgg cccgctgcta ctccctgtcg agctcgcccg cacacggcga gaagctgacc gtgaccgtca agcggaccgc cgacgggtac gcgtcgaatt ggctgtgcgs ca^cgcccat
27
60 120 180 240 300cgcggtatgc gcatgcatgt gctggcacca tcgggcacct tcgtccccac gacgctggac accgacttcc tgctgttggc cgcgggcagc gggatcaccc cgatgatggc gatctgtaag tccgccctcg ccgagggctc cggaaaggtc gtcctggtct acgccaaccg tgacgagaac tcggtcatct tcgccgatgc gctgcgtgag ttggccgccg cgcacccgga ccggctgacg gtgatccact ggctggagac cgtacagggg ttgcccaaca ccgatgcgct ggc,gacgctg gtgcgaccgt tcgccgcata tgaggcattc atctgcgggc ccggcccgtt catgtccgcc gccgaagcgg cgtgcaagac cgtcgatgcc aggcatatcc acatcgaggt gttcaagtcg ctggattccg acccgttcgc tc鄉(xiāng)tcgtc atagacgtgg acgaagacga cgaccgcggc cccgcgcagg cgatcgtcga actcgacggc accacccacg agatcgaatg gccgcgtaag gccaagttgc tcgatgtgct gctgaacaag ggtctggacg caccgttctc ctgccgggag ggccactgcg gggcgtgcgc ggtgctgatg cgc肌gggcg atgtcgagat gg柳tcaac gatgtcctgg agccgtccga actcgacgag ggcctcatcc tggcctgcca ggctttgccg acatcggatc cggtggaagt cacctacgac gaatag
<210> 4 <211> 351 <212> PRT
<213> i/f金分斗支4干菌(Afyco6a"en'wm weom/n/m ) <400> 4
Met Thr Glu Glu Pro Leu Gly Ser His Val Leu Glu Leu Glu lie Ala 15 10 15
Ala Val Val Glu Glu Thr Ala Asp Ala Arg Ser Leu Val Phe Asp lie 20 25 ~ 30
Pro Ala Gly Ser Asp Met Pro Ala Glu Arg Leu Arg Tyr Set Pro Gly 35 40 45
Gin Phe Leu Thr Leu Arg Val Pro Ser Glu Arg Thr Gly Ser Val Ala 50 55 60
Arg Cys Tyr Ser Leu Ser Ser Ser Pro Ala His Gly Glu Lys Leu Thr 65 70 75 80
Val Thr Val Lys Arg Thr Ala Asp Gly Tyr Ala Ser Asn Trp Leu Cys
360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 105685
90
95
Asp Asn Ala His Arg Gly Met Arg Met His Val Leu Ala Pro Ser Gly 100 105 110
Thr Phe Val Pro Thr Thr Leu Asp Thr Asp Phe Leu Leu Leu Ala Ala 115 120 125
Gly Ser Gly lie Thr Pro Met Met Ala lie Cys Lys Ser Ala Leu Ala 130 135 140
Glu Gly Ser Gly Lys Val Val Leu Val Tyr Ala Asn Arg Asp Glu Asn 145 150 155 160
Ser Val lie Phe Ala Asp Ala Leu Arg Glu Leu Ala Ala Ala His Pro 165 170 175
Asp Arg Leu Thr Val lie His Trp Leu Glu Thr Val Gin Gly Leu Pro 180 185 190
Asn Thr Asp Ala Leu Ala Thr Leu Val Arg Pro Phe Ala Ala Tyr Glu 195 200 205
Ala Phe lie Cys Gly Pro Gly Pro Phe Met Ser Ala Ala Glu Ala Ala 210 215 220
Cys Lys Thr Val Asp Ala Arg His lie His lie Glu Val Phe Lys Ser 225 230 235 240
Leu Asp Ser Asp Pro Phe Ala Gin Val Val lie Asp Val Asp Glu Asp 245 250 255
Asp Asp Arg Gly Pro Ala Gin Ala lie Val Glu Leu Asp Gly Thr Thr 260 265 . 270
His Glu lie Glu Trp Pro Arg Lys Ala Lys Leu Leu Asp Val Leu Leu 275 280 285
Asn Lys Gly Leu Asp Ala Pro Phe Ser Cys Arg Glu Gly His Cys Gly 290 295 300
Ala Cys Ala Val Leu Met Arg Lys Gly Asp Val Glu Met Glu lie Asn 305 310 315 320
Asp Val Leu Glu Pro Ser Glu Leu Asp Glu Gly Leu lie Leu Ala Cys 325 330 335
29Gin Ala Leu Pro Thr Ser Asp Pro Val Glu Val Thr Tyr Asp Glu 340 345 350
權(quán)利要求
1.一種3-甾酮-9α-羥基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羥基化酶基因編碼SEQ IDNO2所示的氨基酸序列或其無義突變序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的3-甾酮-9a-羥基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9a-輕基化 酶基因與SEQ ID NO:l所示序列的第1328-2516位核苷酸序列具有70。/。以上的一致性 或與所述SEQ ID NO: 1所示序列具有60%以上的 一致性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的3-甾酮-9a-輕基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9a-羥基化 酶基因與SEQ ID NO: 1所示序列的第1328-2516位核普酸序列具有87%以上的 一致性。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的3-甾酮-9a-羥基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9a-羥基化 酶基因編碼的蛋白的氨基酸序列與所述氨基酸序列具有75 %以上的 一致性。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的3-甾酮-9a-羥基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9a-羥基化 酶基因編碼的蛋白的氨基酸序列與所述氨基酸序列具有80%以上的 一致性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的3-甾酮-9a-羥基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9a-羥基化 酶基因來源于分枝桿菌屬微生物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的3-甾酮-9a-羥基化酶基因，其特征在于，所述分枝桿菌屬微生物 是快速生長型分枝桿菌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的3-甾酮-9a-輕基化酶基因，其特征在于，所述快速生長型分枝桿 菌是A(yco6acter/ww 5/ . NRRJL B-3683與B-3805 、 Afyco6acfen'w附 5Twegmarism 、
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的3-甾酮-9a-羥基化酶基因，其特征在于，所述快速生長型分枝桿 菌是Myco^"eWww "eoa"ra附NwIB-Ol,保藏編號(hào)是CCTCC M 209094。
10. —種3-甾酮-9a-羥基化酶，其特征在于，所述3-甾酮-9a-羥基化酶是SEQ ID NO:2所示 的氨基酸序列或其無義突變序列。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的3-甾酮-9a-羥基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9a-羥基化 酶與所述氨基酸序列具有75 %以上的 一致性。
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的3-甾酮-9a-羥基化酶基因，其特征在于，所迷3-甾酮-9a-羥基化 酶與所述氨基酸序列具有80%以上的 一致性。
13. —種基因工程表達(dá)栽體，其特征在于，所述表達(dá)載體整合有權(quán)利要求l所述的3-甾酮 -901-羥基化酶基因。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的基因工程表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體是細(xì)菌表達(dá)載 體、酵母表達(dá)載體或哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的基因工程表達(dá)栽體，其特征在于，所述細(xì)菌表達(dá)載體是大腸桿 菌表達(dá)載體、鏈霉菌表達(dá)載體或分枝桿菌表達(dá)載體。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的基因工程表達(dá)載體，其特征在于，所述大腸桿菌表達(dá)載體是pET 表達(dá)載體，所述鏈霉菌表達(dá)載體是pLMJ鏈霉菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體，所述分枝桿 菌表達(dá)載體是pFZ36分枝桿菌整合載體或pAL5000或pFZ2分枝桿菌-大腸桿菌穿梭表 達(dá)載體。
17. —種基因工程表達(dá)菌抹，其特征在于，所述基因工程表達(dá)菌林含有權(quán)利要求13所述的 基因工程表達(dá)載體或者整合有權(quán)利要求1所述的3-甾酮-9a-羥基化酶基因，其中所述基 因工程表達(dá)載體是細(xì)菌表達(dá)載體。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的基因工程表達(dá)菌抹，其特征在于，所述細(xì)菌表達(dá)載體是大腸桿 菌表達(dá)載體、鏈霉菌表達(dá)載體或分枝桿菌表達(dá)載體，相應(yīng)地，所述基因工程表達(dá)菌抹 是大腸桿菌、鏈霉菌或分枝桿菌。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的基因工程表達(dá)菌林，其特征在于，所述大腸桿菌表達(dá)栽體是pET 表達(dá)載體，所述鏈霉菌表達(dá)載體是pLMJ鏈霉菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體，所述分枝桿 菌表達(dá)載體是pFZ36分枝桿菌整合載體或pAL5000或pFZ2分枝桿菌-大腸桿菌穿梭表 達(dá)載體，相應(yīng)地，所述大腸桿菌是BL21菌抹，所述鏈霉菌是變鉛青鏈霉菌&reptowF^ //W(/aws,聲斤述分4支4干菌是Afyco6a"e"'w附5/ . NRRL B隱3683與B-3805、 A(yco6a"en'ww
20. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的基因工程表達(dá)菌林在降解甾醇制備9a-羥基雄甾-4-烯-3,17-二 酮中的應(yīng)用。
21. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的基因工程表達(dá)菌抹在對(duì)3-酮甾體化合物進(jìn)行9a-羥基化反應(yīng)制 備3-酮-9a-羥基甾體化合物中的應(yīng)用。
22. —種分枝桿菌基因工程突變菌抹，其特征在于，通過突變權(quán)利要求1所述的3-甾酮-9(1-羥基化酶基因，并通過同源重組構(gòu)建獲得。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的分枝桿菌基因工程突變菌抹，其特征在于，所述突變是缺失或 點(diǎn)突變所述3-甾酮-9a-羥基化酶基因。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的分枝桿菌基因工程突變菌抹在降解甾醇制備雄甾-4-烯-3,17-二酮中的應(yīng)用。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的分枝桿菌基因工程突變菌林在降解甾醇制備雄甾-1 ，4- 二烯 -3，17-二酮中的應(yīng)用。
26. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的分枝桿菌基因工程突變菌抹在降解甾醇制備9a-雄甾-4-烯 -3.17-二酮中的應(yīng)用。
27. —種3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因，其特征在于，所迷3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基 因編碼SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其無義突變序列。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因與SEQ ID NO:3所示的核苦酸序列具有70 %以上的 一致性。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9(1-羥基化酶還原酶基因與SEQ ID NO:3所示的核芬酸序列具有80%以上的一致性。
30. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9a-鞋基化酶還原酶基因編碼的蛋白序列與所述氨基酸序列具有70 %以上的 一致性。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因，其特征在于，所迷3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因編碼的蛋白序列與所述氨基酸序列具有80%以上的 一致性。
32. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因來源于分枝桿菌屬微生物。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因，其特征在于，所述分枝桿菌 屬微生物是快速生長型分枝桿菌。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的3-甾酮-9a-幾基化酶還原酶基因，其特征在于，所述快速生長 型分才支4干菌是Afyco6a"er/ww7 sp. NRRL B-3683與B-3805、 AfycoZ fl!"e〃'ww s附egw"/7'sw、
35. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的3-齒酮-9a-羥基化酶還原酶基因，其特征在于，所述快速生長 型分枝桿菌是MycoZ^c/en'ww "eoawrwm NwIB-Ol,保藏編號(hào)是CCTCC M 209094。
36. —種3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶，其特征在于，所述3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶是SEQID NO:4所示的氨基酸序列或其無義突變序列。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的3-甾酮-9a-羥基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9a-羥基化 酶還原酶與所述氨基酸序列具有70 %以上的 一致性。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的3-甾酮-9a-鞋基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9a-羥基化 酶還原酶與所述氨基酸序列具有80%以上的 一致性。
39. —種基因工程表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體整合有權(quán)利要求27所述的3-翁酮 -9(1-羥基化酶還原酶基因。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的基因工程表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)栽體是細(xì)菌表達(dá)載 體、酵母表達(dá)載體或哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的基因工程表達(dá)載體，其特征在于，所述細(xì)菌表達(dá)載體是大腸桿 菌表達(dá)栽體、鏈霉菌表達(dá)栽體或分枝桿菌表達(dá)載體。
42. —種基因工程表達(dá)菌抹，其特征在于，所述基因工程表達(dá)菌抹含有權(quán)利要求39所述的 基因工程表達(dá)載體或者整合有權(quán)利要求27所述的3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因，其 中所述基因工程表達(dá)載體是細(xì)菌表達(dá)栽體。
43. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的基因工程表達(dá)菌抹，其特征在于，所述細(xì)菌表達(dá)載體是大腸桿 菌表達(dá)載體、鏈霉菌表達(dá)載體或分枝桿菌表達(dá)載體，相應(yīng)地，所述基因工程表達(dá)菌抹 是大腸桿菌、鏈霉菌或分枝桿菌。
44. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的基因工程表達(dá)菌抹，其特征在于，所述基因工程表達(dá)菌林還含 有權(quán)利要求13所述的基因工程表達(dá)載體或者整合有權(quán)利要求l所述的3-甾酮-9a-羥基 化酶基因，其中所述基因工程表達(dá)栽體是細(xì)菌表達(dá)載體。
45. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的基因工程表達(dá)菌抹在對(duì)3-酮甾體化合物進(jìn)行9a-幾基化反應(yīng)制 備3-酮-9a羥基甾體化合物中的應(yīng)用。
46. —種新金分枝桿菌(Myco6a"e/"/w/w weoawww ),所述新金分枝桿菌的保藏編號(hào)是 CCTCC M 20卯94。
47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的新金分枝桿菌，其特征在于，包括權(quán)利要求l所述的3-甾酮-9a-羥基化酶基因和權(quán)利要求27所述的3-甾酮-9a-羥基化酶還原酶基因。
48. —種雙組分式IA型末端氧化酶體系，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的3-甾酮-901-鞋基化酶基因編碼的3-甾酮-9a-羥基化酶和權(quán)利要求27所述的3-甾酮-9a-羥基化酶還 原酶基因編碼的3 -甾酮-9a-羥基化酶還原酶。
49. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的雙組分式IA型末端氧化酶體系在在對(duì)3-酮甾體化合物進(jìn)行9a-羥基化反應(yīng)制備3-酮-9(X羥基甾體化合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種3-甾酮-9α-羥基化酶基因及3-甾酮-9α-羥基化酶還原酶基因，通過構(gòu)建各種表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化相關(guān)菌株，從而獲得多種高表達(dá)菌株，包括大腸桿菌、鏈霉菌和分枝桿菌，還可構(gòu)建無3-甾酮-9α-羥基化酶活性的分枝桿菌，上述構(gòu)建的高表達(dá)菌株或其粗酶液可以用于催化生產(chǎn)3-甾酮-9-α羥基化甾體化合物，上述無3-甾酮-9α-羥基化酶活性的分枝桿菌可以用于降解甾醇制備雄甾-4-烯-3，17-二酮或雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮，上述這些工程菌株可以大大提高甾體藥物的生產(chǎn)效率與產(chǎn)品品質(zhì)，有助于降低甾體藥物生產(chǎn)過程中的能耗、提高藥物前體的利用率、簡化生產(chǎn)步驟，降低生產(chǎn)成本，且反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好，適合于大力推廣應(yīng)用，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101565709SQ20091005161
公開日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2009年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月20日
發(fā)明者抗 姚, 王風(fēng)清, 范書玥, 巍 魏, 魏東芝 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)