專利名稱：一種利用鷹嘴豆胞克魯維酵母表達系統大規模制備外源蛋白的發酵工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于遺傳工程和發酵工程領域，具體涉及一種鷹嘴豆胞克魯維酵母菌株Y179U及其重組蛋白表達系統，以及利用該表達系統高效制備外源蛋白的方法。
背景技術：
隨著生物技術工業的發展，異源蛋白的表達引起了廣泛的重視，其中涉及到醫藥、輕工、食品、飼料等行業，至今已建立了多種基因工程表達系統，如大腸桿菌表達系統、枯草桿菌表達系統、酵母表達系統、昆蟲表達系統、哺乳動物表達系統等。在真核表達系統中應用的最多的就是酵母表達系統，因為酵母表達系統相比于原核表達系統以及哺乳動物等真核表達系統有其自身的優勢，與哺乳動物表達系統相比酵母細胞便于培養，細胞繁殖快，生長周期短，基因操作簡單，與原核表達系統相比酵母表達系統可以實現分泌表達，能對基因產物進行翻譯后加工，得到正確折疊構象且有活性的蛋白。近年來，除了以釀酒酵母為代表的酵母表達系統應用較為廣泛外，幾種非常規酵母表達系統的研究也在進一步開展，特別是甲醇酵母表達系統、產脘假絲酵母表達系統，克魯維酵母表達系統等。已經商業化的畢赤酵母表達系統，利用醇氧化酶基因及其啟動子建立了一套有效的基因表達系統，并已用于多種外源蛋白的表達(Sreekrishna， K. et al. :J Basic Microbiol. ， 28 :265-278， 1988.Ellis， S.B.et al. :Mol. Cell Biol. ， 5 :1111—1121， 1985. Tschopp， J. et al. :NucleicAcids Res. ，15 :3859-3876， 1987.)。鷹嘴豆胞克魯維酵母中利用其自身菊粉酶的啟動子和終止子以及鷹嘴豆胞克魯維酵母營養缺陷型菌株Y179U建立的一套新型的表達系統，并已用于表達外源蛋白，如菊粉酶、人a2a干擾素、人a2b干擾素等(Cai XP et al.:Appl Microbiol Biotechnol. ，67 (3) :364-369，2005. Zhang J et al. :ApplMicrobiolBiotechnol. ，62(4) :387-391，2003.)。 近年來，發酵工藝在釀酒業、食茄加工業，醫藥行業等領域得到了廣泛的應用。在生物技術領域，為了盡可能地提高單位時間單位體積內的目的蛋白的產出量，不斷地對發酵工藝進行優化，已針對不同的表達系統建立了不同的發酵生產工藝。但是對于鷹嘴豆胞克魯維酵母這一新型酵母表達系統的發酵工藝，特別是在發酵罐中利用該系統高效制備外源蛋白的發酵工藝至今未見相關報道。
發明內容
本發明的目的是建立一套利用一種新型的鷹嘴豆胞克魯維酵母表達系統高效制備外源蛋白的發酵工藝。 本發明提供了一種利用鷹嘴豆胞克魯維酵母表達系統大規模制備外源蛋白的發酵工藝，鷹嘴豆胞克魯維酵母表達系統的宿主菌(Y179U)保藏號為CCTCCNo.M202031，將含有外源蛋白編碼序列的鷹嘴豆胞克魯維酵母基因工程菌株制備成種子液，轉接發酵罐中，28-32t:條件下發酵2-6天，然后去除菌體即得；發酵液初始菌濃度0D值為0. 4-0. 6 ;在發酵過程中維持葡萄糖濃度為0. 5-1%，質量體積比；在發酵過程的12h-18h連續補加12% (質量體積比)酵母粉，補加酵母粉的總量為發酵體積的3-5%，質量體積比；發酵過程中發 酵液pH值為5. 0-5.5。 本發明中，所述的外源蛋白是指生物酶，多肽，細胞因子或者表面抗原。 所述的含有外源蛋白編碼序列的鷹嘴豆胞克魯維酵母基因工程菌株，是利用基因
工程方法，將外源蛋白的基因序列克隆至可用于鷹嘴豆胞克魯維酵母表達系統的表達載體
中，并轉入鷹嘴豆胞克魯維酵母而得到的基因工程重組菌株。用于鷹嘴豆胞克魯維酵母表
達系統的表達載體可以采用P區DS。 本發明的一個實施例中，將genbank登錄號為AY534912的堿性甘露聚糖酶基因編 碼序列中499位一 1392位序列克隆到p區DS載體，形成p區DS-MAN330 ;(重組載體示意圖 參見圖7)再將重組表達載體p區DS-MAN330電轉化鷹嘴豆胞克魯維酵母Y179U(CCTCC No : M202031)，從而構建獲得組成型分泌表達的堿性甘露聚糖酶的鷹嘴豆胞克魯維酵母基因工 程菌株。 本發明中，所述的種子液制備，是將含有外源蛋白編碼序列的鷹嘴豆胞克魯維酵 母基因工程菌株在28-32t:條件下培養12-24小時制備成種子液。種子液的制備可以在搖 瓶中，也可以在發酵罐中。 本發明中，可以在發酵液初始成分中加入0.53%的酵母粉和1_3%的葡萄糖，質 量體積百分比。 本發明中，發酵液初始成分可以含有氯化鉀0.1-0.4%，質量體積百分比。
本發明中，發酵液初始成分可以含有氯化鈣0. 02-0. 05%，質量體積百分比。
本發明中，發酵液初始成分可以含有硫酸鎂0. 2-0. 4% ，質量體積百分比。
本發明中，發酵液初始成分可以含有硫酸鉀0. 2-0. 3%，質量體積百分比。
本發明中，發酵液初始成分可以含有維生素8^*10—5_5*10—%，質量體積百分比。
本發明中，發酵液初始成分可以含有磷酸氫二鉀0. 10. 3%，質量體積百分比。
本發明的發酵工藝中，大規模制備是指發酵液體積大，可以滿足工業化應用的要 求，發酵液體積可以是幾十升，幾十噸，甚至百噸。 本發明的發酵工藝中，ODe。。表示菌體濃度，是在分光光度計(UNIC 7200，上海儀器
有限公司)600nm處測定獲得的光密度(Optical Density)來表示。 本發明的發酵工藝中，測pH值可以采用pH值試紙、pH計等常規方法。 本發明提供的發酵工藝可以適用于含有各種外源基因的鷹嘴豆胞克魯維酵母基
因工程菌，發酵制備外源蛋白，這些外源蛋白包括生物酶，多肽，細胞因子，重組抗原等。 本發明利用新型鷹嘴豆胞克魯維酵母表達系統，首次建立了一種大規模制備外源
蛋白的發酵工藝。用本發明的發酵工藝可以制備的外源蛋白包括生物酶，蛋白等。用本發明
的發酵工藝可以制備的外源蛋白在發酵液上清中，去除發酵液中的菌體即得發酵液上清。
與實驗室制備或者搖瓶發酵方法相比，本發明的發酵工藝制備的外源蛋白數量大。與其他
基因工程酵母系統制備外源蛋白相比，本發明的發酵工藝制備外源蛋白產量高，發酵周期
短，發酵成本低，工藝簡單，適用于大規模工業化的需求。
圖1在大搖瓶中建立鷹嘴豆胞克魯維酵母基因工程菌株發酵的基本條件。圖中顯
示的是鷹嘴豆胞克魯維酵母基因工程菌株在2_4%國產酵母抽提物和1_3%葡萄糖基本培
養基中的菌體濕重以及發酵液上清中的酶活性隨培養時間的變化。 圖2發酵罐制備外源蛋白過程中的pH值變化 圖3發酵罐制備外源蛋白過程中的菌體濕重變化。 圖4發酵罐制備外源蛋白過程中的溶氧變化。 圖5發酵罐制備外源蛋白過程中的發酵產物酶活變化。 圖6發酵罐制備外源蛋白SDS-PAGE電泳圖。 圖7含有外源基因的p區DS重組載體結構示意圖。
具體實施例方式實施例1 :種子液的培養 將生長在SD平板(0. 5-1. 0% YNB， 1_3%葡萄糖，1. 5-2. 5%瓊脂糖，質量體積比)上的含有外源基因的鷹嘴豆胞克魯維酵母基因工程菌接種一環到200mlSD液體培養基(0. 67% YNB，2X葡萄糖，質量體積比)中，28。C -32。C振蕩培養12-24hrs，待菌液濃度達到0D6。。 = 3-6，即為種子液。 實施例2 :搖瓶放大發酵實驗建立發酵罐發酵的基本條件 在500-1000ml的搖瓶中進行放大發酵實驗，培養基體積30_100ml，以確定發酵罐發酵基本條件。選擇八種不同的培養基，分別為l號(酵母粉2-4%，葡萄糖1-3%)、2號(國產酵母抽提物2-4%，葡萄糖1-3% )、3號(玉米槳8-12%，葡萄糖1-3% )、4號(糖蜜8-12%)、5號(玉米漿1_3%，葡萄糖2-4%)、6號(糖蜜1-3% ) 、7號(國產酵母抽提物1_3%，葡萄糖2-4%，氯化鈉0. 1-0. 2% )以及8號(國產酵母抽提物3-5%，葡萄糖6_9%;氯化鈉0. 1-0. 2% )。將種子培養液分別接種上述八種不同的發酵培養基中，發酵液初始菌濃度為0D6。。 = 0. 4-0. 6 ;發酵液pH值為5. 0-5. 5， 28°C -32t:振蕩培養2-6天，搖床轉速200-240rpm。發酵培養液離心，沉淀進行菌體濕重的測定，發酵液上清進行表達蛋白的活性分析檢測。 以含有堿性甘露聚糖酶突變體基因的鷹嘴豆胞克魯維酵母基因工程菌發酵制備堿性甘露聚糖酶作為一個例子，結果表明酵母基因工程菌在2號培養基中發酵108小時堿性甘露聚糖酶的活性達到最高值，為1978. 5U/ml，此時的菌體濕重為7. 5%。工程菌在2號培養基發酵過程中菌體濕重的變化以及發酵上清酶活的變化見圖1。 堿性甘露聚糖酶活性的檢測方法是將發酵液上清液用Gly-NaOH緩沖液(pH9. 5)稀釋一定倍數，取100 iU稀釋液，加入900 ii 1底物(0. 5%槐豆膠-緩沖液)，混勻樣品和底物，70。C水浴反應10min，立即取出，置于冰上。略為冷卻(約需5min)后，各管加入lmlDNS試劑，混勻，沸水浴中10min，冷水冷卻。酶標儀下測0D570nm，最后根據甘露糖標準曲線計算堿性甘露聚糖酶酶活。 堿性甘露聚糖酶活性單位定義為每分鐘水解產生1微摩爾甘露糖所需要的酶量定義為一個單位(U)。 實施例3 :15L發酵罐制備外源蛋白發酵工藝的建立
將種子液接種到15L發酵罐中，發酵液初始菌濃可以是0D6。。 = 0. 4。發酵液初始 培養基成分為酵母粉1 % ，葡萄糖2 % ，硫酸鎂0.3%，硫酸鉀0.2%，磷酸氫二鉀0.1%，氯化 鉀O. 1X，氯化鈣0.03^和維生素B^W0—5%，質量體積百分比。在ll(TC下滅菌10min。發 酵溫度為2『C。發酵過程中用12X氨水和2M鹽酸溶液調節pH值5.2左右，發酵過程中使 用pH值5. 0-5. 5的消泡劑控制泡沫。發酵過程中當菌體處于對數生長期時，即在發酵過程 的12h-30h連續補80%葡萄糖溶液，維持葡萄糖濃度為0. 5-1%;在菌體處于對數生長初期 時，即在發酵過程的12h-18h連續補加12X酵母粉，補加酵母粉的總量為發酵體積的3-5X (質量體積比)。發酵過程中間隔6小時取樣一次，發酵液離心，沉淀進行菌體濕重的測定， 發酵液上清進行蛋白活性分析以及SDS-PAGE電泳檢測。 以含有堿性甘露聚糖酶突變體基因的鷹嘴豆胞克魯維酵母基因工程菌發酵制備 堿性甘露聚糖酶作為一個例子，發酵過程中的PH值變化見圖2 ;菌體濕重變化見圖3 ;溶氧
變化見圖4 ;發酵制備的堿性甘露聚糖酶活性變化見圖5(各數值均為平行三罐的平均值)；
發酵液上清SDS-PAGE電泳圖見圖6。 結果表明，用該發酵工藝制備堿性甘露聚糖酶，在發酵72h時，發酵液菌體濃度以 及發酵液上清酶活均達到最高，發酵液菌體濃度0D6。。為24. 58，菌體濕重為17. 82%，發酵 液上清酶活達3795U/ml。 實施例4 :3L發酵罐制備外源蛋白發酵工藝的建立 將種子液接種到3L發酵罐中，發酵液初始菌濃是0D6。。 = 0. 6。發酵液初始培養基 成分為酵母粉3.0%，葡萄糖3 % ，硫酸鎂0.4%，硫酸鉀0.3%，磷酸氫二鉀0.3%，氯化鉀 0.4X，氯化鈣0.04X和維生素BJW0—5%，質量體積百分比。在ll(TC下滅菌10min。發酵 溫度控制在28-3(TC 。發酵過程中用12X氨水和2M鹽酸溶液調節pH值5. 5左右，發酵過 程中使用pH值5. 5的消泡劑控制泡沫。其余同實施例3。 結果表明，在發酵約70h時，發酵液菌體濃度以及發酵液上清酶活均達到最高，三 次重復實驗發酵液上清酶活均達三千U/ml以上。
權利要求
一種利用鷹嘴豆胞克魯維酵母表達系統大規模制備外源蛋白的發酵工藝，鷹嘴豆胞克魯維酵母表達系統的宿主菌保藏號為CCTCC No.M202031，其特征是，將含有外源蛋白編碼序列的鷹嘴豆胞克魯維酵母基因工程菌株制備成種子液，轉接發酵罐中，28-32℃條件下發酵2-6天，然后去除菌體即得；發酵液初始菌濃度OD值為0.4-0.6；在發酵過程中維持葡萄糖濃度為0.5-1％，質量體積比；在發酵過程的12h-18h連續補加12％酵母粉，補加酵母粉的總量為發酵體積的3-5％，質量體積比；發酵過程中發酵液pH值為5.0-5.5。
2. 如權利要求1所述的發酵工藝，其特征是，所述的外源蛋白是指生物酶，多肽，細胞 因子或者表面抗原。
3. 如權利要求1所述的發酵工藝，其特征是，所述的菌株活化是將含有外源蛋白編碼 序列的鷹嘴豆胞克魯維酵母基因工程菌株在28-32t:條件下培養12-24小時制備成種子 液。
4. 如權利要求1所述的發酵工藝，其特征是，在發酵液初始成分中加入1_4%的酵母粉 和1_3%的葡萄糖，質量體積百分比。
5. 如權利要求1所述的發酵工藝，其特征是，發酵液初始成分含有氯化鉀0. 1-0. 4%， 質量體積百分比。
6. 如權利要求1所述的發酵工藝，其特征是，發酵液初始成分含有氯化鈣 0. 02-0. 05%，質量體積百分比。
7. 如權利要求1所述的發酵工藝，其特征是，發酵液初始成分含有硫酸鎂0. 2-0. 4%， 質量體積百分比。
8. 如權利要求1所述的發酵工藝，其特征是，發酵液初始成分含有硫酸鉀0. 2-0. 3%， 質量體積百分比。
9. 如權利要求1所述的發酵工藝，其特征是，發酵液初始成分含有維生素 B^氺10—5*10—5%，質量體積百分比。
10. 如權利要求l所述的發酵工藝，其特征是，發酵液初始成分含有磷酸氫二鉀 0. 1-0. 3%，質量體積百分比。
全文摘要
本發明屬于遺傳工程和發酵工程領域，是利用含有外源蛋白編碼序列的鷹嘴豆孢克魯維酵母基因工程菌高效制備外源蛋白的發酵工藝。發酵時，取上述基因工程菌株發酵2-6天，然后去除菌體，即得；發酵液初始菌濃度OD值為0.4-0.6，在發酵過程中維持葡萄糖濃度為0.5-1％；在發酵過程的12h-18h連續補加12％酵母粉，補加酵母粉的總量為發酵體積的3-5％(質量體積比)；發酵過程中調節發酵液pH值為5.0-5.5。用本發明方法可以大規模制備外源蛋白，蛋白活性高，發酵產量高，發酵周期短，發酵成本低，適用于推廣至大規模工業化生產。
文檔編號C12P21/02GK101781670SQ20091004539
公開日2010年7月21日 申請日期2009年1月15日 優先權日2009年1月15日
發明者樂科易, 呂紅, 潘賢, 袁漢英 申請人:復旦大學