成團泛菌β-胡蘿卜素合成操縱子及其表達載體與應用的制作方法

專利名稱：成團泛菌β-胡蘿卜素合成操縱子及其表達載體與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種色素合成微生物操縱子，尤其涉及一種色素合成成團
泛菌屬微生物操縱子，更具體的是涉及一種成團泛菌(3-胡蘿卜素合成操 縱子及其在合成P-胡蘿卜素中的應用。
背景技術：
類胡蘿卜素是一種天然色素，是由8個類異戊二烯單位組成的一類碳 氫化合物及其氧化衍生物的總稱(J.Biotech., 1998， 59， 169)。
類胡蘿卜素可分為四個亞族，包括胡蘿卜素，如a-、 (3-、 Y-胡蘿卜 素，番茄紅素；胡蘿卜醇，如葉黃素，玉米黃素，蝦青素；胡蘿卜醇的 酯類，如(3-阿樸-8'-胡蘿卜酸酯；胡蘿卜酸，如藏紅素，胭脂樹橙。 類胡蘿卜素的基本結構是番茄紅素，其它類胡蘿卜素是由其氧化、氫化、 脫氫、環化以及碳架重排、降解而衍生。 一般類胡蘿卜素是C40分子，但 也存在高類胡蘿卜素(如C45和C50)和降解的類胡蘿卜素(如C30) (Plant Cell， 1995， 7， 1015)。類胡蘿卜素在自然界中廣泛存在，總數達 600多種，而其中有50余種能形成維生素A。 (3-胡蘿卜素、番茄紅素和蟲下 青素都是類胡蘿卜素家族中對人類健康十分重要的三個主要成員(Nutr. Cancer" 1991， 16， 93)。
美國商業情報機構(Global Industry Analysts (GIA))公司發表了一 份研究報告一一 《類胡蘿卜素全球戰略經營報告》，據該報告預測，隨 著含天然營養成分的保健品在消費市場呈現出良好發展勢頭，到2010年， 全球類胡蘿卜素市場的規模預計將達到10.6億美元。據調查，對類胡蘿卜 素這種抗氧化劑的需求之所以不斷增長，主要原因是消費者對自身健康的 日益關切以及老齡化人口的不斷增加。GIA公司的研究報告對類胡蘿卜素 市場進行了全面分解，以弄清楚哪些類別的類胡蘿卜素將可能在今后幾年 里獲得最大的發展。
在類胡蘿卜素的國際市場上，(3-胡蘿卜素是規模最大的一類產品。
32006年，歐洲在(3-胡蘿卜素上占據的市場份額高達43.3%。研究報告預測， 美國(3-胡蘿卜素市場的增長速度將超過歐洲。2007 — 2010年，美國市場的 增速將略高于歐洲市場，其市場價值預計將增加859萬美元。到2010年， (3-胡蘿卜素的市場將達到2.2億美元。此外，預計到2010年，全球蝦青素 市場的規模將達到2.19億美元；預計到2010年，全球蝦青素市場的規模將 達到4.5億美元。此外，從2007年-2010年，葉黃素和角黃素的總銷售額將 增加2880萬美元，葉黃素在歐洲市場的增長最為強勁。
所有類胡蘿卜素都是通過類異戊二烯化合物或萜類化合物途徑合成 的。它是一類從乙酰CoA開始生物合成的次生代謝產物，合成過程為3 個乙酰CoA分子通過失去l個分子的羧基而縮合成3,5-二羥-3-甲基戊酸
(MVA)，在酶的作用下磷酸化形成焦磷酸酯并經脫羧后形成異戊二烯 焦磷酸(IPP) ， IPP在IPP異構酶作用下異構為二甲基丙烯基二磷酸
(DMAPP) ， DMAPP依次與3分子的IPP在GGPS (GGPP合成酶)的作用 下，縮合生成二甲基辛烯焦磷(GPP)、法尼基二磷酸(FPP) 、 二甲基 辛烯二甲基辛烯焦磷酸(GGPP) 。 2個GGPP在八氫番茄紅素合成酶(PSY) 作用下頭對頭進行二聚作用形成第l個無色的類胡蘿卜素一一八氫番茄紅 素。八氫番茄紅素經過連續脫氫反應，共軛雙鍵延長，直至形成鏈孢紅素、 番茄紅素。番茄紅素在不同環化酶的作用下分別生成(x-胡蘿卜素、(3-胡蘿
卜素，(x、 (3-胡蘿卜素經引入、轉化、環化、氧化等反應形成結構更復雜 的蝦青素、葉黃素、新黃質等(Curr. Opin. Plant Biol., 2001， 4， 210)。 到目前為止，分別從多種細菌、植物、藻類和真菌中克隆了近150 個與類胡蘿卜素合成有關的基因。1995年Misawa從歐氏桿菌桿菌中克隆 獲得GGPP合成酶基因(crtE)、玉米黃素轉糖激酶(crtX)、番茄紅素 環化酶基因(crtY)、八氫番茄紅素脫氫酶基因(crtB)和P-胡蘿卜素羥 化酶基因(crtZ)，將這些基因分別轉化到植物中能夠使轉基因植物合成 不同類型的類胡蘿卜素或前體物質(US5,429,939) 。 1996年Ausich等人 從歐氏桿菌(五r渭'm'a /^6z'co/a)克隆獲得了櫳牛兒基腳焦磷酸化酶基因、 八氫番茄紅素合成酶基因、八氫番茄紅素脫氫酶基因以及番茄紅素環化酶 基因并分別將它們與葉綠素轉運肽編碼序列融合轉化到植物中提高了植 物類胡蘿卜素總量(US5,530,188)。植物中也相繼發現了類胡蘿卜素合成相關基因。1994年Bird將番茄中克隆到參與類胡蘿卜素合成的基因 pTOM5 (該基因與crtB同源)轉化到植物中，并發現該基因能夠調控植 物中番茄紅素的含量(US5，304，478) 。 1998年Cunningham從擬南芥中 克隆到s-番茄紅素環化酶基因、IPP異構酶基因和(3-胡蘿卜素羥化酶基因， 這些基因的功能在大腸桿菌中表達后獲得了驗證(US5，744,341 )。此外 Vainstein 1999發現其它與類胡蘿卜素相關的蛋白，如黃瓜中的CHRC和 CHRD蛋白(US6,551,793) 。 2002年Busch從煙草中克隆到；-胡蘿卜素 去飽和酶和番茄紅素合成酶(EP1，156,117) 。 Wang等2006年從枸杞中 克隆到與八氫番茄紅素合成酶基因(CN1884547)和P-番茄紅素環化酶同 源基因(CN1884546)。
目前，還沒有關于成團泛菌生產類胡蘿卜素的報道。

發明內容
本發明的一個目的在于提供一種成團泛菌P-胡蘿卜素合成操縱子，
該操縱子源自于成團泛菌屬(/^W^ea^9.)。
本發明的另一個目的在于提供一種成團泛菌(3-胡蘿卜素合成操縱子 的表達載體。
本發明的又一個目的在于提供一種成團泛菌(3-胡蘿卜素合成操縱子 及其表達載體在生物合成p-胡蘿卜素中的應用。
本發明的目的是通過如下技術方案實現的
(3-胡蘿卜素合成操縱子源自于成團泛菌，其核苷酸序列如SEQ ID No:l所示。
核苷酸序列如SEQ ID No:l所示的成團泛菌(3-胡蘿卜素合成操縱子 的獲取方法為利用金氏B (KB)培養基，先從變色稻谷樣中分離成團 泛菌，選擇菌落呈黃色細菌菌株；再將選擇出來的菌落置于LB液體培 養基中培養12小時以上；之后提取總DNA，再以總DNA為模板，采用 長基因PCR擴增和克隆方法(Appl Environ Microbiol， 1997， 63， 4504) 克隆并得到(3-胡蘿卜素合成相關的操縱子。
一種核苷酸序列為SEQIDNo:l的成團泛菌P-胡蘿卜素合成操縱子 的具體獲取方法為
5菌種分離
取變色稻谷加入無菌水，液氮中磨碎，稀釋10—100倍后涂布在KB
培養基上(2g/L蛋白胨，10g/L甘油，1.5g/LK2HP04， 1.5g MgS04'7H20， 15g瓊脂，pH7.2) ， 28"C培養16小時以上，篩選菌落呈黃色細菌菌株。 總DNA提取
將分離獲得的細菌單株在液體LB培養基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl， 10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH7.5)中培養過夜(16小時)， 菌體培養液以6，000g重力加速度離心5min，得到菌體沉淀。先將這些沉 淀在-20。C下冷凍lhr，之后使用TE緩沖液(10 mM Tris-HCl， 1 mM EDTA， pH8.0)清洗一次，然后懸浮于濃度為10mg/mL溶菌酶的無菌水中，37°C 搖床培養1 hr。
接著向培養液中加入0.5MEDTA， 10% (w/v) SDS和濃度為5M的 NaCl并輕輕振蕩混勻后，再加入濃度為20mg/mL蛋白激酶K， 37°C培 養lhr。用與培養菌液液體體積相當(1倍體積)的苯酚氯仿異戊醇 (25 : 24 : 1，體積比)提取DNA;水相用與相當水相體積1/2 (0.5倍體 積)的氯仿異戊醇(24 : 1，體積比)萃取，振蕩混勻后離心5min。水 相中加入與水相體積相當(1倍體積)的異戊醇，振蕩混勻后離心15min。 取沉淀，用70% (v/v)酒精沖洗DNA，干燥，之后在TE緩沖液中重懸 浮。
所得總DNA于4。C保存。 操縱子獲取
用0.02-0.5u/nL濃度限制性核酸內切酶Sau3A酶切提取所得的成團 泛菌總DNA，時間20-60分鐘，然后0.7% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳，切 下長度為5 — 7kb的DNA片段，用膠試劑盒(上海生工生物工程有限公 司)回收。選擇pG251 (CN1338515 NCBI)作為表達載體，用限制性核 酸內切酶SamHI酶切并進行膠回收。
先對酶切的載體質粒進行去磷酸化操作，以降低質粒自連，并對堿性 磷酸酶進行失活操作后(Sambrook，分子克隆手冊，1989)，再與外源 的DNA片段(即長度為5 — 7kb的成團泛菌DNA片段)連接。反應溫度 16°C，連接時間為10—12h。連接產物用正丁醇沉淀后，用70% (V/V)的乙醇離心洗滌，最后用
10pl的超純水溶解，將連接物進行電擊轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞， 點擊參數為電脈沖為2.5iaF，電壓2.5kV，電阻200Q,電擊時間為4.5S。 復蘇后，將菌液涂布于LB固體培養基(含有50(ig/mL氨芐青霉素)平板 上，37。C培養12—16hr，篩選顏色變黃的菌落。
連接前，將回收的部分酶解的細菌基因組DNA片段與pG251載體 DNA，用瓊脂糖凝膠電泳的方法(Sambrook，分子克隆手冊，1989)估 計濃度，確保連接反應中外源DNA的濃度至少是載體濃度3 — 5倍。
PCR擴增
以PCARl:5，-ATGATGACGGTCTGTGCAGAACAACA-3，禾n PCAR2: 5 ， -ATCATATGGATATGTTGTGGATTTGGAATG-3 ，為擴增引物對(3-胡
蘿卜素合成相關的操縱子進行PCR擴增。使用KODFXtaq酶，擴增條件 依次為94°C30秒，68°C30秒，72。C600秒，擴增30個循環。接著加 入2單位rtaq酶，在72。C延伸30分鐘。
PCR結束后，1。/。(w/v)瓊脂糖凝膠回收，獲得長度為6421 bp的SEQ ID No:l序列。
一種核苷酸序列為SEQ ID No:l的成團泛菌(3-胡蘿卜素合成操縱子 的基因合成方法(Nucleic Acids Research, 2004， 32， e98)，利用PCR進 行(3-胡蘿卜素合成操縱子全長擴增，在TaqDNA聚合酶存在的反應體系 中，使用多個擴增引物和2個外側引物完成。擴增條件依次為94"C預熱 1 min; 94。C30秒，5(TC30秒，72。C延長10min，共25個循環。PCR結 束后，0.8% (w/v)瓊脂糖膠回收。
SEQ ID No:l序列與表達載體相連接后轉入生物細胞中，能合成(3-胡蘿卜素。
SEQIDNo:l序列與表達載體相連接后轉入微生物細胞中，能合成(3-胡蘿卜素。
SEQIDNo:l序列與表達載體相連接后轉入原核微生物細胞中，能合 成P-胡蘿卜素。
表達載體應當包含編碼與類胡蘿卜素合成或代謝有關的一種或多種 酶以及至少一個能通過現有技術(J.薩姆布魯克等，科學出版社，1994)
7構建的啟動子(promoter)。此外，表達載體還可以含有一些調節子 (regulatory element)如抑帝U子(repressor)、抗生素標記(如氨節 青霉素、卡那霉素或新霉素等)或熒光標記(如綠色熒光蛋白GFP基 因)等。
一種表達載體，包括成團泛菌(3-胡蘿卜素合成操縱子SEQ ID No:l序列。
一種微生物表達載體，包括成團泛菌(3-胡蘿卜素合成操縱子SEQID No:l序列。
一種SEQIDNo:l序列轉入原核微生物細胞的方式，將SEQIDNo:l 序列直接與表達載體pBAD/TOPO ThioFusion (Invitrogen)相連，4°C 連接2小時，然后將該載體轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞(Invitrogen)中。
含有成團泛菌p-胡蘿卜素合成操縱子(SEQIDNo:l)的表達載體轉 入原核微生物細胞后，該細胞能合成(3-胡蘿卜素。將菌液涂布于LB固體 培養基，經過培養能獲得橘黃色菌落。
一種原核生物合成P-胡蘿卜素的方法為，將SEQ IDNo:l序列直接與 與表達載體pBAD/TOPO ThioFusion (Invitrogen)相連，4。C連接2小 時，然后將該載體轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞(Invitrogen)中，將 菌液涂布于含有50嗎/mL氨芐青霉素的LB固體培養基(15g/L瓊脂，5g/L 酵母提取物，5g/LNaCl， 10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH7.5)，該細胞 能合成(3-胡蘿卜素，經過培養能獲得亮黃色菌落。
然后挑取呈亮黃色的大腸桿菌菌落于LB液體培養基中，37'C振蕩培 養至OD6Q(H).5，加入0.05% —0.2% (w/v)阿拉伯糖后，37。C繼續振蕩培 養5—12小時。采用甲醇抽提細菌細胞中的(3-胡蘿卜素，使用分光光度 計在439nm下的吸光值。根據標準曲線計算樣品中|3-胡蘿卜素的含量。
本發明技術方案實現的有益效果
來自稻谷中內生的成團泛菌是一類高效合成f3-胡蘿卜素的細菌，克 隆此類細菌中的(3-胡蘿卜素合成操縱子，有利于將來基因工程培育高效 合成P-胡蘿卜素的不同物種。通過培養、提取總DNA和PCR擴增后得
8到的SEQIDNo:l的序列及其表達載體可以應用于(3-胡蘿卜素的生產。
本發明所述的術語與其一般概念相同。
所述的"核苷酸"和"引物"序列均為5，端至3，端。
所述的"生物合成"指利用微生物、植物細胞或組織，以發酵或培養
的方式合成目標產物，如(3-胡蘿卜素。
所述的"生物細胞"指微生物、植物細胞或組織。
所述的"微生物"指原核微生物或真核微生物，原核微生物主要為細
菌；真核微生物為真菌或藻類，真菌主要指酵母菌。


圖1為以pG251質粒構建DNA表達單元示意圖2為PCR擴增所得序列為SEQIDNo:l的類胡蘿卜素操縱子電泳 圖，其中泳道1為DNA分子量標記(Marker);泳道2為從大腸桿菌擴 增的對照組；泳道3為從成團泛菌擴增的(3-胡蘿卜素合成操縱子；
圖3為含有序列為SEQ ID No:l大腸桿菌和不含SEQ ID No:l序列大 腸桿菌在LB培養基上培養結果圖，其中圖的左半邊為不含SEQIDNo:l 序列大腸桿菌菌落，呈乳白色；圖的右半邊為含有序列為SEQIDNo:l 大腸桿菌菌落，呈亮黃色。
圖4為P-胡蘿卜素在439nm附近吸收光譜。
具體實施例方式
以下結合附圖詳細描述本發明的技術方案。實施例僅用以說明本發明 的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本 領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同 替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權 利要求范圍中。
本發明所用的試劑若未經說明，均購自西格瑪一奧德里奇(Sigma — Aldrich)公司。
9本發明涉及分子生物學實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》
一書(J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科學出版社，1994)。
該書及其后續出版版本是本領域技術人員在進行與分子生物學相關的實驗操作時最常用的具有指導性的參考書籍。
實施例1菌種分離
取變色稻谷樣中用70% (v/v)的乙醇表面消毒30秒，用無菌水沖洗后置于小研缽中研磨，將組織液在KB培養基(2g/L蛋白胨，10g/L甘油，1.5g/LK2HP04， 1.5gMgS04.7H20， 15g瓊脂，pH7.2)上畫線分離，28°C培養24hr后，挑取單菌落純化。挑取的黃色菌落呈圓形，隆起，表面光滑，濕潤，邊緣整齊，不產生熒光色素，革蘭氏染色反應為陰性的菌株；進一步通過顯微鏡篩選細胞呈直桿狀，周生鞭毛，無芽孢的菌株。將獲得的菌株稀釋104后反復2次在KB固體平板培養基上純合。
實施例2總DNA的提取
將實施例1中分離獲得的細菌單株在10ml液體LB培養基(5g/L酵母提取物(Invitrogen) ， 5g/LNaCl， 10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH7.5)中培養16小時，菌體培養液以6,000g重力加速度離心5min，得到菌體沉淀。先將這些沉淀在-20。C下冷凍lhr，之后使用TE緩沖液(10 mMTris-HCl， 1 mM EDTA， pH 8.0)清洗一次，然后加入20|il溶菌酶(Sigma-Aldrich)濃度為10mg/mL的無菌水懸浮，在37。C下搖床培養1hr。
接著加入50)aL濃度為0.5MEDTA， 50|il濃度為10% (w/v) SDS和50|11濃度為5M的NaCl并輕輕振蕩混勻后，再加入10(al濃度為20mg/mL蛋白激酶K (Takara日本)，反應物在37°C下培養lhr。用與培養菌液
液體體積相當(i倍體積)的苯酚氯仿異戊醇(25 : 24 : i，體積比)
提取DNA。水相用與相當水相體積1/2(0.5倍體積)的氯仿異戊醇(24 :1，體積比)萃取。振蕩混勻后離心5min。水相中加入與水相體積相當(1倍體積)的異戊醇。振蕩混勻后離心15min。取沉淀，用70% (v/v)酒精沖洗DNA，干燥，之后在TE緩沖液中重懸浮。
1所得總DNA儲存于4°C下備用。
實施例3成團泛菌菌株同源性分析
以實施例2抽提的總DNA為模板，利用成團泛菌的16s rRNA特異性引物進行擴增。擴增引物為P16SF: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'和P16SF: 5，-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3，。以KOD Plus (Toyobo日本)為Taq DNA聚合酶，擴增條件依次為94°C30秒，55°C30秒，72°C120秒，擴增30個循環。循環結束后，加入2個單位的rtaq酶(寶生物工程
(大連)有限公司)，72。C延伸300秒，擴增片段長1500bp (如下，請補充序列)。PCR結束后，1% (w/v)瓊脂糖凝膠回收，取10pl直接與T/A載體相連(寶生物工程(大連)有限公司)，4。C連接過夜。
先將該載體轉化入大腸桿菌DH5a感受態細胞中，再用ABI Prism BigDye的ABI3700毛細管自動化測序儀測序，測得的序列通過Blast程序與GenBank中核酸數據進行對比分析，得到菌株與成團泛菌中的16s rRNA
(AF394539 NCBI)有99%的同源性，從而證實分離菌株為成團泛菌。
實施例4卩-胡蘿卜素合成操縱子的獲取
圖1為以pG251質粒構建DNA表達單元示意圖。通過表達單元獲取(3-胡蘿卜素操縱子，具體方法如下用不同濃度(0.02 — 0.5u/pL)限制性核酸內切酶Sau3A (寶生物工程(大連)有限公司)酶切實施例2提取所得的成團泛菌總DNA，時間20-60分鐘，然后0.7% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳，切下長度為5 — 7kb的DNA片段，用膠試劑盒(上海生工生物工程有限公司)回收。
選擇pG251 (CN1338515 NCBI)作為表達載體，用限制性核酸內切酶^^HI (寶生物工程(大連)有限公司)酶切并進行膠回收。
先對酶切的載體質粒進行去磷酸化操作，以降低質粒自連，并對堿性磷酸酶進行失活操作后(Sambrook，分子克隆手冊，1989)，再與外源的DNA片段(即長度為5 — 7kb的成團泛菌DNA片段)連接。連接前，將回收的部分酶解的細菌基因組DNA片段與pG251載體DNA，用瓊脂糖凝膠電泳的方法估計濃度，確保連接反應中外源DNA的濃度至少是載體濃度3 — 5倍。反應溫度16匸，連接時間為10—12h。
連接產物用正丁醇沉淀后，用70% (v/v)的乙醇離心洗滌，最后用lOpl的超純水溶解，將連接物進行電擊轉化大腸桿菌DH5cc感受態細胞，電擊參數為電脈沖2.5pF，電壓2.5kV，電阻200Q，電擊時間為4.5S。復蘇后，將菌液涂布于LB固體培養基(含有50(ig/mL氨芐青霉素)平板上，37'C培養12—16h，篩選顏色變黃的菌落。
利用逐步序列測定方法對篩選獲得的重組子全序列進行DNA測序。測序的引物分別為
Pcxl: 5'-GATGTTTGATGTTATGGAGCAG-3'
Pcx2: 5，-CTCATCAGGATGACGGGGAA陽3'
Pcx3: 5 ，-CGACGTCACGATCGGGTGATC-3'
Pcx4: 5，-ACGCTGCGTAGCGCACATCG-3'
Pcx5: 5 ，-CGTCAGAATATCAAAGACTATG-3'
Pcx6: 5，-AGCGCCATTGAAGAGCTGTTC-3'
Pcx7: 5，-GAACTGCTGAGCCAGCAAGCAG-3'
Pcx8: 5'-CAACGATACGGCATCGCTGCA-3'
Pcx9: 5,-AACGCCAGTCCACCAGCACG-3'
所得SEQ ID No 1序列與來自泛球菌的類胡蘿卜素合成操縱子序列(AY876938 NCBI)同源性為92% (如下)。
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14<formula>formula see original document page 15</formula><formula>formula see original document page 16</formula><formula>formula see original document page 17</formula>實施例5(3-胡蘿卜素合成操縱子的擴增
以PCAR1: 5,-ATGATGACGGTCTGTGCAGAACAACA-3,和PCAR2: 5，-ATCATATGGATATGTTGTGGATTTGGAATG-3，為擴增引物，以實施例4 中制得DNA (SEQIDNo:l)為模版，對(3-胡蘿卜素合成相關的操縱子進行 PCR擴增。使用KOD FXtaq酶(Toyobo公司，日本)，擴增條件依次為94。C30 秒，68匸30秒，72。C600秒，30個循環。然后加入2單位rtaq (寶生物工程 (大連)有限公司)，在72。C延伸30分鐘。PCR結束后，1% (w/v)瓊脂糖 凝膠回收，獲得長度為6241bp的SEQIDNo:l核苷酸(見圖2)。
取10jal直接與表達載體pBAD/TOPOThioFusionTM (Invitrogen)連接， 4。C連接2小時，再將該載體轉化大腸桿菌TOP10 (Invitrogen)感受態細胞
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2中。菌液涂布于含有50pg/mL的氨芐青霉素LB固體培養基平板上，于37°C 培養12小時，獲得亮黃色菌落。
實施例6 P-胡蘿卜素合成操縱子基因合成
通過基因合成方法(Nucleic Acids Research, 2004， 32， e98)可以克隆 實施例5所得得(3-胡蘿卜素操縱子，所用的引物如下
1. EMPII-1:
ATG， ATG， ACG, GTC, TGT, GCA， AAA, CAA, CAC' GTC, AAA, AAC, ATA, CAC, AGG， CAT, GCA， GCC， AGC, CTG
2. EMPII-2:
CGG， TGG, AAG, CTG, ATC, AAG， CCG, TTC, CTC, AAT， GTC, GTT, CAA, CAG, GCT, GGC, TGC， ATG， CCT， GTG
3. EMPII-3:
CGG， CTT, GAT' CAG， CTT, CCA， CCG, GTT, GAA, AGC, GAA， CGT, GAC, TTA， GTG, GGC, GCT， GCA, ATG,CGC
4. EMPII-4:
CAG, TGG， ACG， GAT, ACG, CTG, GCC, TGT' TGC， CAG, CGC， ACC' GTC, GCG, CAT, TGC， AGC， GCC, CAC, TAA
5. EMPH-5:
GGC, CAG， CGT， ATC, CGT， CCA, CTG, CTG' TTG, TTG, CTG, CCC, GCG, CGC, GAT, CTG' TGC, TGC， AAC， GCC
6. EMPII-6:
CTC， TAC， TTC, GCA, GGC， GAG， ATC， AAG, CAG， GCC, GGC, CGG, CGT, GGC, GTT， GCA， GCA， CAG, ATC， GCG
7. EMPII-7:
GAT， CTC, GCC， TGC, GAA, GTA' GAG， ATG' GTG， CAT， GCA, AAA, TCA, CTG, ATT, CTG， GAT, GAC, ATG， CCC
8. EMPII-8:
GGT， CCG, ACG, TCC, GCG' TCG, CAG' TTG， TGC， GTC， ATC， CAT, GCA, GGG, CAT, GTC, ATC, CAG, AAT, CAG
9. EMPII-9:
CTG, CGA, CGC, GGA, CGT, CGG, ACC, ATT, CAA, TGC, CAG, TAT， GGT, GAA， CAT, GTC, GCG， ATT, CTG， GCC
10. EMPII-10:
AGC' GAC， CAC， GCC， GAA, TTT， CTT， ACT, CAG， CAG, GGC， CAC, TTC， GGC, CAG， AAT, CGC， GAC， ATG， TTC
11. EMPII-11:
AAG, AAA, TTC， GGC, GTG, GTC， GCT， GCG, GCA, GAA， GGC， TTA, ACG， GCA， ACC， ACC, AGA, GCC, GAC, GCT
12. EMPII-12:
CAG, CCC, CTG, CAT, GCC， GAC, TGC， GTG， GGA， TAA, TTC， TTT， CGC， AGC， GTC' GGC, TCT， GGT, GGT, TGC
13. EMPII-13:
GCA， GTC, GGC, ATG, CAG， GGG, CTG， GTG， CAG， GGA， CAG, TTA， ACG， GAT, CTT, TCA, GAA, GGT, GAC' AAG
14. EMPII-14:
ATA,GTG,ATT， CGT, CAT, CAG, TTT, GGC， GTC， AGC， GCT' GCG, TGC, CTT, GTC, ACC， TTC, TGA， AAG， ATC
15. EMPII-15:
AAA, CTG, ATG, ACG, AAT, CAC, TAT， ACC， ACC, AGC， ACC, CTG, CCA' TGC， GCC, TCC, ATG， CAG, ATG, GCC
16. EMPII-16:
CTG, TTC, GGT, TGC, TTC, ACC， TGA, GGC, TTC, AGT' TGC， GAT, AGA, GGC, CAT, CTG, CAT, GGA， GGC, GCA
17. EMPIH7:
TCA， GGT, GAA, GCA, ACC' GAA, CAG, CTG， CAC, CGT， TAA， ACG, CTT， AAT, CTC, GGT， CAG, GCT, TTC， CAG
18. EMPIH8:
TCC， GGT， GTC, GAC' CAT, GAA， GTC， AGT， GAG, ATC, GTC, CAG, GAG, CTG, GAA, AGC, CTG， ACC， GAG， ATT
19. EMPII-19:
GAC， TTC， ATG, GTC， GAC, ACC, GGA, ACC， GAT, GCT， CAT, CAG, GAT, GAC， GGG， GAA， TCA, ACG， CTG， GTG
20. EMPII-20:
GCG, CAG, TCG, CGT， GTC' AAC, CGC' CTG， TGG， TCC, CAG, CAG, ATT， CAC， CAG, CGT, TGA， TTC, CCC, GTC
21. EMPII—21:GCG, GTT， GAC, ACG， CGA， CTG， CGC， GAT， CAT， CTG， CGC， TGC， GCC， AGC， GAG, CAT, CTG, TTA, TCG， GCC
22. EMPII-22:
GGC， CTG， AAC, ATT， TTG， GTG， TGT， GGC, ATA, ATC, GGC, CTG, GCA， GGC, CGA， TAA， CAG， ATG， CTC， GCT
23. EMPII-23:
ACA， CAC, CAA， AAT, GTT, CAG, GCC， TGG' TCC, GAG, AAA, CCC, CTC, GCT， GCC， GTC， AGT, TAA, GGA, TGC
24. EMPII-24:
ATA， GAA， CGG,CGG， TGC, AAT， GAC， CGG, TGA， GTG, GCT, CAT, GCA, GCA, TCC, TTA, ACT, GAC, GGC, AGC
25. EMPII-25:
GTC， ATT, GCA, CCG, CCG， TTC, TAT, AGC, CAT, GTG， CAG, GCG, CTT， CAG， CAC， CTT, AGC, CAG， GCC, TTA
26. EMPII-26:
CGT， CTG, CTG， GAT， GAA， AGT' GAT, CTG, GTG, TCC， GCG, TGC, GAT， TAA， GGC， CTG, GCT, AAG, GTG, CTG
27. EMPII-27:
ATC, ACT, TTC， ATC.， CAG， CAG， ACG， AAC, GTT, AGC， GCG' CTA, CTC' ACC， GAG' AGC， CGT' ATC, GGC, AAT
28. EMPII-28:
CAG, ACT, GCC， CGC, CGG， ATG, CGA, GGC, TAG, GGC, CAG， CGG， GAA， ATT, GCC， GAT, ACG, GCT， CTC, GGT
29. EMPII-29:
TCG, CAT, CCG, GCG, GGC, AGT, CTG, GCA, CAC, ACC, CTG, CAA, CTG, GCG, CCG, CAT, CCT, CTC， GGC， CCT
30. EMPII-30:
GGT， GCT, GCG， GGC， CAT, CTC， ATT, GAT, CAG， TTT' CAG, CAT, TGA, AGG, GCC， GAG， AGG, ATG, CGG, CGC
31. EMPII-31:
AAT， GAG， ATG, GCC, CGC, AGC， ACC， GAT, ATG， CTC, TGC, CGT， GAA， CTG, CGG' GTG， GAG， CTG， AGG, AAG
32. EMP1I-32:
AGG， CTC， CAT, CTG, ATC， GAC, GAT, CAC, GCC, ATC， TTT, CGC， CAG' CTT， CCT， CAG, CTC, CAC, CCG， CAG
33. EMPII-33:
ATC， GTC， GAT, CAG， ATG, GAG， CCT, GCC' GGT， GCA, CCG， GCA， ACA， GAA, GCG, CTG, AAC, CTG， CCT， CAT
34. EMPII-34:
CGC,TTC， ACG'GTT， AAG,TGG, CAG, CGC' ACA, GGC, AAC， CGT， AAC， ATG, AGG, CAG， GTT, CAG, CGC, TTC
35. EMPII-35:
CTG, CCA, CTT， AAC, CGT， GAA, GCG' GAT, TTC， GGG， CTG， GCC, GTG, ATG， CCG， AAA, GAC, TAT， GCC, AGG
36. EMPII-36:
AGG, TTC, ACT, GGT, GCG， ATA， GCG， TTC, GCT， TGC' CTG, ATC, GGT, CCT， GGC， ATA, GTC， TTT， CGG， CAT
37. EMPII-37:
CGC, TAT， CGC， ACC， AGT， GAA' CCT， ATC， TAT, GAC， TGG， CTG, ATG' CGA' CGT， CAC， GAT, CGG, GTG, ATC
38. EMPII-38:
GGC， CCG, TGG， AGC, TAA, TCC, GAT， CGC, ATG, AGC, GTT, GCC, GCC， GAT, CAC， CCG， ATC, GTG， ACG, TCG
39. EMPII-39:
ATC'GGA,TTA,GCT， CCA， CGG， GCC， CAA， CTG, CAT, CAC， TGA， AAT， TCA， CCG, CTG， GCG， GAG, AAC, AGC
40. EMPII-40:
CAA, CGC, CTG, GCT， TGG, ATA, ATC, CAG， ATC， CGG' AAT， CAA, CTG, GCT, GTT' CTC, CGC， CAG, CGG, TGA
41. EMPII-41:
GAT, TAT, CCA， AGC, CAG, GCG' TTG, CGG, GAT， CAT, TTC, GAT, ACG' GTT, GGC， TCG, CTG， CGT, ACC, ACT
42. EMPII-42:
CGG, GAA, GTA， GCG' AGG, CTG， CGC， CTC， GAA， GGG, TGC, GGG， TTC, AGT， GGT， ACG, CAG, CGA， GCC, AAC
43. EMPII-43:
GCG， CAG, CCT， CGC， TAC, TTC, CCG， CAT, GGC, GAC， AGA, CCG, CGC， AAT, TCC, GCT， TCC, CTC' GGC， ACG
44. EMPII-44:
GAC,GAT， GGT， GGT， AAA,CAG， GCC， GTA, GCG， ATG, TCC， CTG, CAG, CGT， GCC， GAG, GGA， AGC, GGA, ATT
45. EMPII-45:
GGC, CTG, TTT, ACC， ACC， ATC， GTC， CGC, GAA， CGC, CAG, GAG, ATC， GAC, GCT, CAG, TTA， TTG， CTG， GCG
46. EMPII-46:
CAG， TTT， CTC, CGC， CTG， GAA， AGG， TGA， CAA, CCG, ACC, GCT, TTG， CGC, CAG， CAA， TAA, CTG， AGC, GTC47. EMPII-47:
CCT， TTC, CAG， GCG， GAG, AAA, CTG， GGC' CAG， GCC
48. EMPII-48:
CGT, AAT， GGC, TTG， ATC, GGC， CTG， CGC, CAG， TGC
49. EMPII-49:
CAG， GCC, GAT， CAA, GCC， ATT, ACG， CAC, GGC， GGC
50. EMPII-50:
CTG, ATC， TTT， GGC, CAG, CGG, GAT, CGT, CAG， CAG:
51. EMPII-51:
ATC， CCG, CTG， GCC， AAA， GAT， CAG， CCG， GGT， GTG:
52. EMPII-52:
CGC, CAT, GGA， GTG, GCT， GGT, GGT， AAA, GCG' TGA,
53. EMPII-53:
ACC, ACC, AGC, CAC, TCC' ATG, GCG, CGT, CAG， CTC,
54. EMPII-54:
CGC' CTG， ACG， ATG， TGC, GCT， ACG， CAG， CGT， TTT,
55. EMPII-55:
CGT' AGC, GCA， CAT'CGT， CAG, GCG, GGC, GGA, ACC,
56. EMPII-56:
ATA, GTC， TCT, CCT, CCT, GAC， GAC, CGG， CTG, GCT,
57. EMPII-57:
GTC, GTC， AGG， AGG， AGA， GAC, TAT, GCC， GAG， GTA，
58. EMPII-58:
GGC, CGC， TGC, TGT, CTC， AGC， CGC， AGG， CCG， ATC,
59. EMPII-59:
GCG， GCT， GAG， ACA， GCA， GCG, GCC， CTC， AAT, GCG，
60. EMPII-60:
AGA, TCT， TCC' GCA， TGA, GGC, GAC, CAG， GTG， TGA，
61. EMPII-61:
GTC, GCC, TCA, TGC， GGA, AGA, TCT, CAC, CGA' AAC，
62. EMPII-62:
CGG， TGC， CGA， AAG， CGG, ACC, TCA, TAG, CCA， GGC，
63. EMPII-63:
TGA, GGT, CCG, CTT， TCG, GCA， CCG, CAG, TCG， CAG,
64. EMPII-64:
GGC, GCA,AAC, CTG， TCG,CGG， ATG， ACC， TGC, CGG，
65. EMPII-65:
CAT, CCG， CGA,CAG,GTT, TGC, GCC, GGA， TCT， GCT,
66. EMPII-66:
CTC， TCC, AGC, ACC, CGG， CCA, TCG, TCC， AGC, GTA,
67. EMPII-67:
CGA， TGG, CCG, GGT， GCT, GGA' GAG， TGA, CGC， AGT,
68. EMPII-68:
TCC， TGT， CGG， ACG, GAC， GAC， TGG， AAG， CCC, ATG，
69. EMPII-69:
CCA， GTC, GTC， CGT, CCG， ACA, GGA， GAG, GCA， GCT，
70. EMPII-70:
CGA, TAG, CCT, GCC， TGC, TGA， TCT， ACC, GTG， GCA，
71. EMPII-71:
AGA, TCA, GCA， GGC, AGG, CTA, TCG， CTC， CGT， CTA，
72. EMPII—72:
AGC， CAT, GTT， CAG， GTG, GTC， GAT, TCC， GCC, GAC AGC， CGC, CTG， GTC, GGC， GGA, ATC， GAC, CAC, CTG ATG,CCT, ACG, GTG, CTG， GAT, GGG, ATT, AAC， CAC CGG' CGT， CAG, GTG， GTT, AAT, CCC, ATC， CAG, CAC GCT, GCC， AGA， GTG, GTC， TGG， CAC, GGT， ATC, CGA GGC'GCG' ACG, TCG， GAT， ACC, GTG, CCA, GAC， CAC CAG， ACC， CCA， CTG， GCT， GAT， GAA， AGC， TAC, GAT CAT, CTG， CTG， ATC， GTA， GCT， TTC， ATC, AGC, CAG ATT, CTG, GCC， GGC' GAC， ATT, GTC， GiVA, CAG, GCG TGT， CAG' CAT, CGC, CTG， TTC， GAC， AAT, GTC, GCC TGA， TCT， GAT, TCT， GGT， GGA, CGC， GCG， ACT, GGC AGC, CCG, TTG, GCC, AGT， CGC, GCG, TCC, ACC， AGA CAT, TCT, GCT, GAT， TGA, CGC， CGA, ACG， TGA， ACG TTG, GCA, CCG, CGT, TCA, CGT， TCG， GCG， TCA, ATC GCA， GCA， TCG， CTG， GAT， CGC， TCC， GCT， GGT, AGT CAG， TGA， TGT， ACT, ACC， AGC， GGA， GCG， ATC， CAG TCT, GAA, CAG， TGG, CTA, TTT, CTG, CGT, GAC， TGC AAG, CGC, TCC, GCA， GTC, ACG, CAG， AAA, TAG, CCA GCT， GAA, TAC, CCG, GGT， TGC' GAG， CAT, CGC， TTC ACC, GCG， CGT, GAA, GCG， ATG， CTC, GCA， ACC， CGG GAT, TGA， TGG， CCG, TGG， CTA， CCA, GCC， CGA， TGC CGC, 'AGC, GCG, GCA， TCG， GGC, TGG， TAG, CCA， CGG CAG， CGA， GCC, ACA, TGG， CCT， GAC' CGC, GCC， GAT TCC, ATT, TTG, ATC， GGC, GCG， GTC, AGG， CCA' TGT CAG， CCT， GCG, AAA， ATC, TGC, AGA， CAC' CCT， GCT
21， TCA， ATG, TAG, TGG, GTA， TCT, TCA, TTC， AGC， AGG， GTG， TCT, GCA， GAT， TTT
73. EMPII-73:
CAT, TGA, TAA, CGC， CAC， GCT' GGA, AGG, CGA' TCG， CGC, CCG' TCA， GAA, TAT, CAA' AGA， CTA， TGC,CGA
74. EMPII-74:
TCT, TCG, CGT, ATG, TGC, CGG, TCT, AAT, CGC, CAT， CCC, TGC, TCT， TCG, GCA， TAG, TCT， TTG, ATA'TTC
75. EMPII-75:
AGA， CCG' GCA, CAT， ACG， CGA, AGA, GCA, AGG， CGC， GTT, ACC， CAA' TAC， GCT， GAC, CGG, CGA, CGT, GGA
76. EMPII-76:
TTT， CCG, CTG, CAG, GGC, AGA, TCG, TGT, TTC， TGC, CAG， AAG, GTT, TCC， ACG， TCG， CCG, GTC， AGC, GTA
77. EMPII-77:
CGA， TCT, GCC， CTG, CAG, CGG， AAA, GCG, TGC, CGG, GTG， GGT, CCA, TCG, TAC, CAC， CGG, CTA, TTC， TCT
78. EMPII-78:
ATC， TGC， GCC, AGC, CGA， TCA, GCC' AGC, TTG, ACC, GCC, AGC， GGC, AGA, GAA, TAG, CCG， GTG， GTA， CGA
79. EMPII-79:
GGC， TGA, TCG' GCT， GGC， GCA， GAT， GCA， GAC， GCC, AAC， CTC, TGA, GAC, CCT, GCA， CGC， CAC' CAT, TCA
80. EMPII-80:'
AAG, AAG, CGC， TGT, TGC， TGC， CAT, GCC, TGA， CTG， GCG, AAT, TGC， TGA, ATG, GTG， GCG， TGC， AGG， GTC
81. EMPII-81:
ATG, GCA, GCA， ACA， GCG, CTT， CTT, CCA, AAT， GCT， GAA, CCG, TAT, GCT， GAA, TCT， GGC， GGG, TCC， AGC
82. EMPII-82:
AGG, CCG, TAA， GGA, CGT, TGC， ATA, ACC' TGC, CAG， CGC, TGG, TCA, GCT， GGA， CCC, GCC， AGA, TTC， AGC
83. EMPII-83:
TAT, GCA， ACG， TCC， TTA, CGG, CCT， TCC, CGA, AGG' TCT' GAT, CGC, CCG, TTC, CCA, TGC' GGG, TTT， ACT
84. EMPII-84:
GGC, TTG, CCG' CTT' AAG， ATG， GGC, AGC， CGA, TCA， GGC, ATT， GTG, AGT' AAA, CCC， GCA, TGG, GAA, CGG
85. EMPII-85:
GCC, CAT, CTT， AAG， CGG, CAA， GCC， GGA' GGT， CCC， CGT， TCT， GGC， GGC, GTT， ACA， GGC, TAT, TAT, GAC
86. EMPII-86:
TGT， AGT' TCT， ATT, CAT, TGC， ATC， GCC, TGT， TGA， CGG， TGA, CCA， GTC， ATA, ATA, GCC， TGT， AAC， GCC
87. EMPII-87:
GAT, GCA' ATG， AAT， AGA, ACT, ACA， GTA， ATT, GGC， GCA， GGC, TAC, CGT， GGT, CTG, GCT， CTG， GCA, ATT
88. EMPII-88:
CTC， CAG， CAG， TCC， GGT， TTG, AAC, GCC, TGA' CTT, CTG， AAG， GCG, AAT, TGC， CAG， AGC， CAG, ACC, ACG
89. EMPII-89:
GTT， CAA, ACC， GGA, CTG, CTG， GAG， CAG， CGT， GAC, AAG, TCT' GGC, GGC, AAA, GCT' TAT, GTC, TAT， CAG
90. EMPII-90:
GAT， TAC, CGT， GGG, GCC' GGC, ATC' ATT， CGT' GAA, GTT， CTG, ATG, CTG， ATA, GAC, ATA, AGC， TTT, GCC
91. EMPII-91:
GAT, GCC， GGC, CCC, ACG, GTA， ATC, ACC, GAT, CCC, AGC, GCC， ATT, GAA， GAG, CTG' TTC, ACC, CTC， GCG
92. EMPII-92:
CAC,CGG,CAT,CAG， CTC,GAC,ATA， GTC, AGA， GAG， CCC, TTT' ACC， CGC, GAG, GGT' GAA， CAG, CTC, TTC
93. EMPII-93:
TAT, GTC， GAG， CTG, ATG， CCG, GTG， AAG, CCG， AAA, TAC, CAA, CGG， TGC， TGG, GAG, TCG, GTC, AAG， GTG
94. EMPII-94:
CTG, CGC, TTC, CAC, CGC, CGG, CTG, ATC， GTT, GTC, ATA, ACT, GAA, CAC, CTT, GAC, CGA' CTC, CCA, GCA
95. EMPII-95:
CAG, CCG, GCG, GTG,.GAA, GCG, CAG， ATT， GCC， GCG， TCC， AAT, CCG， CGT， GAC, GTT， GAA， GGA， TAT， CGT
96. EMPII-96:
GCC, TTC, AGC, CTG， CAC' CGC' TCG, GGA， ATA， GGC, CAG， AAA, GCG， ACG， ATA, TCC, TTC， AAC, GTC' ACG
97. EMPII-97:
CGA, GCG， GTG, CAG， GCT, GAA, GGC, TAT， CTG, AAG， CTT， GGC， ACC， GTG， CCA， TTT， CTG， TCA， TTC， CGC
2298. EMPII-98:
CTG， AAG， AAA' TGC, CAG， CTG, TCG, CGC， TTG， CCG:
99. EMPII-99:
CGA， CAG， CTG, GCA， TTT， CTT， CAG， GCA， TGC, AGC:
100. EMPII-100:
TGA, GTG， GTC， GGA， GAA, GGC， CTG, ACG， CAG' ATG:
101. EMPII-101:
CAG， GCC, TTC' TCC, GAC， CAC， TCA， CTG, CTG, GTG:
102. EMPII-102:
GAC， GTT， CCA, TTC, ACG， AAC， CAG, CGC， ATC, CAT:
103. EMPII-103:
CTG， GTT, CGT， GAA， TGG， AAC, GTC， TGG， TTC， TCG:
104. EMPII-104:
CTC, CAC, TTC， GCC， GCC, GAG， ATC， TTC， AAA, CAG,
105. EMPII-105:
GAT, CTC， GC;C, GGC， GAA, GTG, GAG， CTC, AAT' GCC,
106. EMPII-106:
GAA, GAC, CCG， GCC， ATC， TGG， CAG, GTG, TAC， CGC,
107. EMPII-107:
CTG， CCA， GAT， GGC, CGG， GTC， TTC， CCG, ACG， CGC,
108. EMPII-108:
CTG， CGA， AGC， TGC, TTG， CTG, GCT， CAG' CAG， TTC，
109. EMPII-109:
AGC, CAG， CAA, GCA， GCT, TCG， CAG， GCG, CAG， GGA，
110. EMPII-110:
GTG， ATG， ATG, ATT， CAG, GCC， AGA, ATA， GAT, CAC,
111. EMPII-111:
TCT, GGC， CTG， AAT， CAT, CAT, CAC， GAT， CAG,CTG,
112. EMPII-112:
GCC, ATC， TAA， GTT， GGG, GAT， TTC， ATC, AAT, CAA,
113. EMPIH13:
GAA， ATC， CCC， AAC， TTA， GAT， GGC， CTG, GCA' GAG,
114. EMPIH14:
GCT' GCC， GCA， GGC， AAC， CGG， TGC， CAG, TGA, GCC，
115. EMPII-115:
GCA, CCG, GTT， GCC， TGC, GGC， AGC, TAC, TAC, GTG，
116. EMPII-116:
ATC， GCA， CAG， CGG, CGG, TGC, TTC， AAC， GGC， CCA,
117. EMPII-117:
GAA， GCA， CCG, CCG, CTG， TGC, GAT, CGC, ATA, CTC,
118. EMPII-118:
CGG, CGT, GAA' GAT, GCG, ATG， CGT, GAC， CCT, CTG，
119. EMPII-119:
ACG， CAT, CGC, ATC， TTC， ACG， CCG， AAA, GAT， TTC，
120. EMPII-120:
CCA, TTC， GCT, TTG， CGT， CAG， GAT, CGG， CTC, CAC，
121. EMPII-121:
ATC， CTG, ACG, CAA, AGC， GAA， TGG， AAC, CGG, CCT，
122. EMPIH22:
GAT， ACT， TGC， GCC， AGG, ATG, AGT， GGT， AGC， ACC，
123. EMPII-123:
CAG， CAT, GTC, GCG, GAA， TGA' CAG, AAA, TGG' CAC AGC,GAA, TAC， AGG, GAA， GTG， GCG, AGC， TAC， ATT CTC， ATC， TTC, AAT, GTA, GCT, CGC， CAC， TTC' CCT GAA, GGA， AAT， CCG, TTT， GGA， ACT, TCC, TCA, ATC CAT， TGT, ATA， GAT， TGA， GGA, AGT， TCC， AAA, CGG CGC, GGT, GGC, ACG， AGC, GCG， CGC, GTG， CAG， GGC TCC, CAC， CAT, GCC, CTG， CAC， GCG, CGC， GCT， CGT AGC， GTT， GCA, AGG， CTG， GAG， ACC, CAG， GAT, TTC GGT， AAT， CCT, GAA， ATC， CTG， GGT, CTC, CAG， CCT GCG, CGT, GCC, TCC' AAC， GCA， GAT, GTG， TTT， CAC GCG, GTA, GGT, GTG, AAA， CAC' ATC, TGC, GTT, GGA CGG, TCA， CTG, CAG， AAC， AGA, CGC, ATG， AGC， AAC ATT， TGG， CGA, GTT， GCT, CAT, GCG， TCT, GTT， CTG GCG， CAC, CAC, ACG， GTC, TGC， TTT， GGT, CCG, CGC CTC， TCG， ATA， GCG, CGG， ACC， AAA, GCA, GAC， CGT GAC， TCA， TCG, CTC, TAT， CTG， CAT, GCG， AAC， TGC ATC， GGT， CAC， GCA， GTT, CGC, ATG, CAG， ATA， GAG CTG' GCG， CGC， GTA, CCG， CAC， CTC, GAC， ACC, GAA GTC, GAT， CTC， TTC， GGT, GTC, GAG, GTG， CGG， TAC GAC, TAT， CTG, GAA, CAG， CAT, TAC, ATG, CCG, AAC GCT, ACT, CAG， GTT, CGG， CAT, GTA, ATG, CTG, TTC CGC,GAT, GAG, CTG， AAT， GCG, TAT， CAG, AGC， TCG CGA, GAA, GGC, CGA， GCT， CTG, ATA, CGC， ATT， CAG CAC, AAC， CGC, GAT, ACC, CAT, ATT, GAG, AAT， CTC GAC， CAG, ATA， GAG, ATT， CTC， AAT， ATG， GGT， ATC
23<formula>formula see original document page 24</formula>149. EMPII-149:
ACG， TTC, TCG， CAG，CGT，CGC,CTG,CAG，ACA,TGA， CAG，CGC,ACG，AGA，GTA, AAG，AAA, GCC,AAA， CGA
150. EMPII-150:
CGC, ATG, CAT, CAT,GCG，GTA'CGA'GGC,AAA,GAT,TGC,TGT, GTC,TCG,TTT, GGC,TTT, CTT,TAC， TCT
151. EMPII-151:
TCG， TAC， CGC, ATG，ATG,CAT,GCG，GTG，CGC，CAT， ATA,ACA,ACT,GCG,TAA， ATA，ACG， GAT，TCG, CGG
152. EMPII-152:
GAC， GGC,CTG, GTG，CAT,CAG,CGC，TGG，GGT，GTC， CGC,TAT, GTT,CCG,CGA, ATC，CGT， TAT，TTA， CGC
153. EMPII-153:
GCG， CTG， ATG， CAC，CAG,GCC，GTC,ATG,CAC,AAT， AAG，CCA, GAG，CAG,GCC， GTA,GAG, CGT,CAT, ACC
154. EMPII-154:
GGC, AGC， ACT, CGT，GTC,TGG，CCC,TTG,CAG，TGG， ATC,GGC， GCG，GGT，ATG, ACG，CTC， TAC，GGC， CTG
155. EMPII-155:
GGG, CCA， GAC, ACG，AGT，GCT,GCC,CAG,ATA，AAT， GAG，CGC, GAT,CGA，CAG， AGC，GGC, GAA,CAC， TGC
156. EMPII-156:
CCG， CAT， ACA， GGC,TGG，TTT，GAG，GTT，AAT,GAC， CTC,TAT， GCC，GCA，GTG, TTC，GCC， GCT,CTG, TCG
157. EMPII-157:
CTC， AAA, CCA， GCC,TGT,ATG,CGG，TTC，ATG,ATG, TGA,CAG, ATG,CCA,GCC， CCA，ACG, ACA'GCC， ATG
158. EMPII-158:
ATG, GAG, ATA， ACG,GCA，ACA,CTG,GCG， CAC，AGA， TAC,AAT， GTG，CAT,GGC， TGT，CGT, TGG,GGC, TGG
159. EMPII-159:
CAG， TGT, TGC, CGT,TAT，CTC,CAT,TGG, GAT,AAC， GAG,GAC， CAG,AAC,CGA， AAG,GGC， ATT，CCA， AAT
160. EMPII-160:
TCA， TAT， GGA， TAT，GAA，CTG，GAT,TTG， GAA，TGC， CCT，TTC， GGT，T
利用PCR進行(3-胡蘿卜素全長操縱子擴增，在10(^1反應體系中， EMPII-2—EMPII-159共158個引物的添加量為2ng，外側引物EMPII-1和 EMPII-160添加量為30ng。以KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)為Taq DNA聚合酶。擴增條件依次為94。C預熱1 min; 94°C30 s; 50°C30 s; 72'C10min，使用的，共25個循環。
PCR結束后，1% (w/v)瓊脂糖膠回收，取10pl直接與T/A克隆載體 相連(寶生物工程(大連)有限公司)，4°C連接過夜。高效轉化大腸桿菌DH5a 感受態細胞中，獲得陽性克隆。
實施例7 P-胡蘿卜素合成操縱子在大腸桿菌中表達 將實施例5所得的含有SEQ ID No:l序列的大腸桿菌與不含SEQ ID No 1序列大腸桿菌共同涂布于LB固體培養基(15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物， 5g/LNaCl， 10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH7.5)， 28。C培養24小時，結果 見圖3，其中圖的左半邊為不含SEQIDNo:l序列大腸桿菌菌落，呈乳白色； 圖的右半邊為含有序列為SEQIDNo:l大腸桿菌菌落，呈亮黃色。實施例8大腸桿菌生產(3-胡蘿卜素
挑取實施例7當中呈亮黃色的大腸桿菌菌落于20ml LB液體培養基 (5g/L酵母提取物，5g/LNaCl， 10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH7.5)中， 37。C振蕩培養至OD600=0.5，再加入0.05% — 0.2% (w/v)阿拉伯糖，37。C繼 續振蕩培養5 — 12小時。之后培養液在5,000g重力加速度下離心5min，無菌 水清洗1次。所得的細胞沉淀用2ml濃度為lM磷酸緩沖液(113g/LK2HP04， 47g/L KH2P04)重懸浮，然后將其轉移到微量離心管中，以12,000g再次離 心5min。沉淀用濃度為5ml/g的甲醇重懸浮后，以12,000g再次離心5min， 去除上清液后，沉淀于鋁箔中保存。
用甲醇抽提沉淀四次，每次的上清液分別裝入試管中保存。對每個樣品 測定其在439nm下的吸光值(根據(3-胡蘿卜素吸收光譜確定，見圖4)。將 各部分收集到一起混勻，0.22^im膜過濾滅菌，測定混合液在439nm下的吸光 值。根據標準曲線計算樣品中P-胡蘿卜素含量。每克濕重細胞e-胡蘿卜素 含量達到0.56 mg。<110〉上海市農業科學院
<120>成團泛菌e-胡蘿卜素合成操縱子及其表達載體與應用 <130> 0911006 <160> 1
<170> Patentln version 3.3
<210> SEQ ID No 1 <211> 6241 <212> DNA
<213>成團泛菌P-胡蘿卜素合成操縱子 <400>1
3tgstgscggtctgtgc3saacaacacgtcscsggc3tgcagccagcctg60
ttgaggaacggcttgstcagcttccaccggacgtgactta120
gtgggcgctgcaatgcgcgacggtgcgctggcaacaggccagcgtat ccgtccsctgetg180
ttgttgctgcccgcgcgcgstctgtgctgcaacgccacgccggccggcctgcttgatctc240
gcctgcgs3gtagagatggttcsctgatt ctggatgacatgccctgcatg300
gatgacgcac3sctgcgacgcggscgtcgggccsgt3tgg360
gcgsttctggccgssgtggccctgctgagtgcgtggtcgctgcggc3gss420
ggctt33cggagccgacgcttstcccscgcagtcggcatg480
csggggctgggtt33cggatctttc3ga^ggtgsc33ggc3cgcagcgct540
gacgccaasctgstgscgsstcact3tscc3ccsgcsccctgccatgcgcctccatgcag600
stggcctctstcgcsactgssgcctcaggtgaagcaaccg3acsgctgesccgttas3cg66 0
ctt wtctcggtcsggctttccsgctcctggsegstctesctgacttcatggtcgacacc720
ggaaccgatgctcatcsgg3tgscggggsstc己3cgctggtg wtctgct780
gcggttg3cscgcgsctgcgcgatcatctgcgctgcgccagcgsgcstctgttstcggcc840
tgccsggccgatt3tgccscgttcsggcctggtccgagaaacccctcgct900
gccgtcagtt3sggstgctgC3tgsgccsctcaccggtcattgcsccgccgttctstsgc960
catgtgcsggcgcttcsgcsccttagccaggccttaatcgcacgcggacaccagatcact1020
ttcatccsgctsgcgcgctsctc3ccg3gsgccgtatcggC3己tttcccg108 0
ctggccctsgcctcgcstccggcgggcsgtctggcacacaccctgcssctggcgccgcst1140
cctctcggcccttcaatgctg333Ctgstc3己tgagatggcccgcsgcsccgatatgctc1200
tgccgtg己3Ctgcgggtggsgetgsggssgctggcgaaagggcgtgstcgtcgstcag126 0
atggagcctgccggtgcsccggcsacsgaagcgctgsscctgcctcatgttacggttgcc1320
27tgtgcgctgccacttasccgtgaagcggatttcgggctggccgtgatgcc1380
gccaggaccg3tc3ggc33gcgaacgct己tcgcaccagtgS3CCt3tct5tgactggctg1440
stgcgscgtcacgstcgggtgstcggcggcascgetestgcgatcggsttsgctccscgg1500
gcccsactgcttcsccgctggcgg3g33C3gccsgttgattccggatctg156 0
gsttstcessgccsggcgttgcgggatcstttegstseggttggctcgctgcgtsccsct1620
gsscccgcscccttcgsggcgcsgcctcgctacttcccgcsccgcgc33t1680
tccgcttccctcggcscgctgc3gggsc3tcgctscggcctgtt七3CC3Cestcgtccgc1740
gascgccagg3gstcgscgctc己gttsttgctggcgcaaagcggtcggttgtcscctttc180 0
csggcggsgsa3ctgggccaggccsgcc3tgttcaggtggtcgattccgccgsccsggcg1860
gctgcsctggcgcsggccgatcasgccsttacgcacggcggestgcctscggtgctggat1920
gggattasccacctgacgccgetgctgacgstcccgctgggccgggtgtg1980
gctgcc3gagtggtctggcacggtatccgscgtcgcgcctcscgctttscC3CC3gCC3C2040
tccstggcgcgtcagctccagsccccsctggetgstg333gctscgstC32100
acgctgcgtagcgcsc3tcgtcaggcgggcgg33ccattctggccggcgscsttgtcgaa2160
csggcgatgcgccggtcgtcaggaggagagsct3tgccgsggtstgatct2220
gattctggtggacgcgcgeictggccddcgggctgatcggcctgcggctg5g3csgc5gcg2280
gccct CMtgcgcattctgctgattgscgccgaacgtgsacgcggtgccaatcacscctg2340
gtcgcctcatgcggaagatctcsccgaascgcagcatcgctggatcgctccgctggtsgt2400
acstcactggcctggct己tgaggtccgctttcggcdccgcagtcgcagtctgascagtgg24 60
ctatttctgcgtgactgcggsgcgcttccggcsggtc3tccgcgacaggtttgcgccgga2520
tctgctgctg33tacccgggttgcgsgcatcgcttcacgcgcggttscgctggscgatgg2580.
ccgggtgctgcagtgattgatggccgtggctaccsgcccg3tgccgcgct2640
gcgcatgggcttccsgtcgtccgtccgscsctcsgcgsgccscstggcct2700
gaccgcgccgatgcc3cggtagatcagcaggcaggctatcgetccgtct32760
csgcctgcga3 wtctgcsgacsccctget3CCC3Ct3C3ttg己t33cgc2820
cacgctggaaggcgatcgcgcccgtC3gsstdtgccg33gagcagggatg2880
gcgsttsgsccggcacatacaggcgcgttaccc33tscgctgsceggegs2940
cgtggaaaccttctggcagagccctgcsgcgg333gcgtgccgggtgggt3000
ccatcgtsccaccggctattctctgccgctggcggtcssgctggctgstcggctggeges3060
gstgcsgacgccaacctctgagaccctgcacgccsccattcsgc33ttcgccsgtcsggc3120
csgcgcttcttcca33tgctgaaccgtatgctg wt ct ggcgggtccsgc3180
tgsccsgcgctggcaggttatgc3scgtccttacggccttcccgssggtctgatcgcccg3240
ttcccstgcgggttt3CtC3csatgcctg3tcggctgcccatcttaagcg3300
ggtccccgttctggcggcgtt3C3ggctstt3tgactggtescegtesseaggegstges3360
c t acsgtMttggcgcaggctsccgtggtctggctctggcsattcgcctt3420
28cagsagtcsggcgttcaasccggsctgctggsgcsgcgtgacsagtctggcggcs3sgct3480
13tgtctatccttcacgaatgstgccggcccc3cggtsstC3 ccgstccc3540
sgcgccsttgsagsgctgt tcsccctcgcgggt3ssgggctctctgactatgt cgagctg3600
3tgccggtgsagccgaast3ccsacggtgctgggsgtcggt csaggtgttcagtt s t gac3660
ascgatcagecggcggtggseigcgcsgsttgccgcgtccsat ccgcgtgacgt tgaagga3720
tegtcgetttctggcctsttcccga_gcggtgcaggctg5dggctatct3780
3ccgtgecatttctgtcattccgcgacatgctgcggc3sgcgcgscsgctggcatttctt3840
csggcdtgesgcsgcgsst3caggg33gtggcgagctacattgaagatgagcstctgcgt3 900
csggecttctccga ccact cactgctggtgcgtttggsac11 CCt tc3960
tatac33ttggatgcgctggttcgtgaatggsacgtctggttctcgcgcggtggcscg4 0 20
sgcgcgcgcgtgcagggcatggtgggsctgtttgasgstctcggcggcgasgtggsgctc4080
gecagegttgcssggctggsgscccsgg己tttcsgg3ttaccgcggt3C3cctgcca4140
gatggccgggtcttcccg^cgcgcgcgcgtgcctccascgcsgstgtgtttC3C3CCt3C4200
cgcgssctgctgagccagcaagcagcttcgcaggcgcagggscggtcact4260
cgeatgsgcasctcgcc333tgtgatctattctggcctga31 cs t cs t c<acga tcagetg4320
gcgcsccscacggtctgc11tggtccgcgctatcgagsgttgsttgstgsS3tCCCC33C4380
ttsgstggccctC3tcgctctstctgcatgcgsactgcgtgsccgatggc4440
tc己ctggcaccggttgcctgcggc3gcttacgtgctggcgcgcgtsecgcacctcgac4500
tcgact gggccgttgsagcsccgccgctgtgcgstcgcdt3Ctcgactat4560
ct ggaa cagestts C31 gccgaa cctgagtagccagagggt cacgcatcgcat ct t cacg4620
ccgs33gatttccgcgstg3gctgaatgcgtstcagsgctcggccttctcggtggagccg4680
cctgscgcaaagcgaatggasccggcctcacaaccgcgstdcccatsttgsg33tctc4740
tatctggtcggtgctaccactcstcctggccaggggtgattggctcggcc4800
33ggctsccgcaggattgatgctggcccstctggcttgsstsgsgggtcsctgcccg己tc4860
stgccgt己gsC3ccstggsggtgggeitcgs33sgwt tgccsccgcgt111 ctgcstg4920
3tgcct ttsccggacgcsgcgtgctg己tgcgtgccgtcactgtgcsgstg4980
tgattgacgatcaggtactgggscgcagc3scgstscggcatcgctgcaatctggsgaac5040
3gcgcctggcgcsgctggsg3tgasttcgcgtc3ggcctstgccggatccC3gstgcstg510 0
sgcccgcctttgcttcctcccaggsggtggcg3g3ttctgcctgcttscg5160
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atgst3cgctgcgttactgtt3cc3cgttgcscgsgtggttggcctgstg3tggcgcsgs5280
ttatgggcgtgccacgctggatccsgcctgcgagttcggtctggcgassc5340
acctgaccaaesttgcgcgcgstcgcgttgaag3tgctgssgcgggscgctgctstctgc5400
ccgctgcgtggctggctgasgagccgctgstctcgccgstccgcacagtc54 60
gccsggcactgcaagtcggcggcggsgcccta11atcgat5520<image>image see original document page 30</image>
權利要求
1、一種成團泛菌β-胡蘿卜素合成操縱子，序列為SEQ ID No1。
2、 根據權利要求1所述的成團泛菌(3-胡蘿卜素合成操縱子，在生物合成卩-胡蘿卜素中的應用。
3、 根據權利要求1所述的成團泛菌P-胡蘿卜素合成操縱子，在利用原核微生物合成(3-胡蘿卜素中的應用。
4、 根據權利要求3所述的成團泛菌P-胡蘿卜素合成操縱子，在大腸桿菌合成P-胡蘿卜素中的應用。
5、 一種包含權利要求1所述成團泛菌卩-胡蘿卜素合成操縱子的表達載體。
6、 根據權利要求5所述的含有成團泛菌(3-胡蘿卜素合成操縱子的表達載體，其特征在于所述表達載體為pBAD/TOPO載體，其通過與SEQ ID No:l序列直接連接形成。
7、 根據權利要求5所述的含有成團泛菌p-胡蘿卜素合成操縱子的表達載體，在生物合成P-胡蘿卜素中的應用。
8、 根據權利要求6或7所述的含有成團泛菌(3-胡蘿卜素合成操縱子的表達載體，在大腸桿菌合成卩-胡蘿卜素中的應用。
全文摘要
一種成團泛菌β-胡蘿卜素合成操縱子，全長6241bp。通過培養、提取總DNA和PCR擴增后得到操縱子的序列為SEQ ID No 1。將該序列及其表達載體可以應用于β-胡蘿卜素的生產。
文檔編號C12N15/31GK101487007SQ20091004494
公開日2009年7月22日 申請日期2009年1月6日 優先權日2009年1月6日
發明者付曉燕, 姚泉洪, 孫廣東, 彭日荷, 熊愛生, 田永生, 永 薛, 偉 趙, 金曉芬, 峰 高 申請人:上海市農業科學院