專利名稱：副球菌蝦青素合成操縱子及其表達載體與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》 一書(J.薩 姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科學出版社，1994)。該書及其后續出版版本是本 領域技術人員在進行與分子生物學相關的實驗操作時最常用的具有指導性的參考書籍。
實施例1菌種分離 從上海近海深水區取污泥，稀釋10-100倍后涂布在LB固體培養基上(15g/L瓊 月旨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl， 10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH7. 5) ， 28。C培養24小時。 挑取紅色菌株，該菌落呈圓形，隆起，表面光滑，濕潤，邊緣整齊，無色，不產生熒光色素，革蘭氏染色反應為陰性的菌株；進一步通過顯微鏡篩選無鞭毛，無芽孢的桿狀菌株。將獲得的 菌株稀釋104后反復在LB固體平板培養基上純合。
實施例2總DNA的提取 將實施例1中分離獲得的細菌單株在10ml液體LB培養基(5g/L酵母提取物 (Invitrogen)，5g/L NaCl， 10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH7. 5)中培養16小時，菌體培 養液以6，000g速度離心5min，得到菌體沉淀。這些沉淀在_20°C下冷凍lhr。之后使用 TE(10mM Tris-HCl， lmMEDTA，pH 8. 0)溶液清洗一次。加入含有20 y 1濃度為10mg/mL溶菌 酶(Sigma-Aldrich)的無菌水懸浮，在37"C下搖床培養lhr。加入50 y L 0. 5MEDTA，50ii 1 10% (w/v) SDS和50 iil濃度為5M的NaCl輕輕振蕩混勻。再加入10 y 1濃度為20mg/mL 蛋白激K(Takara日本)，反應物在37t:下培養lhr。用與培養菌液液體體積相當(1倍體
積)的苯酚氯仿異戊醇(25 : 24 : i)提取dna。水相用與相當水相體積1/2(0.5倍
體積)的氯仿異戊醇(24 : 1)萃取。振蕩混勻后離心5min。水相中加入與水相體積相 當(l倍體積)的異戊醇。振蕩混勻后離心15min。取沉淀，用70% (v/v)酒精沖洗DNA，干 燥，之后在TE緩沖液中重懸浮。所得總DNA儲存于fC下備用。
實施例3副球菌菌株同源性分析 以實施例2抽提的總DNA為模板，利用16s rRNA兩端引物進行擴增。擴增的引物 為16SR1 :5， CAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3，和16SF :5， TACGGCTACCTTGTTACGACTTC3，。以KOD Plus(Toyobo日本)為Taq DNA聚合酶，擴增條件依次為94。C 30秒，55。C 30秒，72。C 120 秒，擴增30個循環。循環結束后，加入2個單位的rtaq酶(寶生物工程(大連)有限公 司)，72t:延伸300秒，擴增片段長1408bp(如下)。PCR結束后，1X (w/v)瓊脂糖凝膠回 收，取10iU直接與T/A克隆載體相連(寶生物工程(大連)有限公司)，4t:連接過夜。再 將該載體轉化入DH5a感受態中。利用ABI Prism Big Dye的ABI3700毛細管自動化測 序儀測序，測得的序列通過Blast程序與GenBank中核酸數據進行對比分析，得到菌株與 Paracoccus屬中的許多種菌的16s rRNA有98X的同源性(NCBI)。菌株系統發育地位上屬
于副球菌屬(paracoccus)。1C3g3gtttg3tctggcttcaggcttaacacatgc朋gtcg3gCg3g3CCttcgggtcteg61CggCgg3Cgggtg3gt朋Cgcgtgggaacgtgcccttctctecgg朋tegccccggga^121Ctggg3gt朋teccgtatacgccctttggggg朋3gattt3tCgg3g朋ggatcggcccg181cgttggattaggtagttggtggggt朋tggCCC3CC33gCcgacgatccatagctggttt241g卿ggEltgEltcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacg301gtggggaatcttegac朋tgggggcaaccctgatctagccatgccgcgtgagtgatg^g361gccttagggttgtaaagctctttcagctggg朋gat朋tg3cggteccagC3g^g^gC421cccggcteactccgtgccagcagccgcggt朋tecggagggggctegcgttgttcggaat481tactgggcgt朋3gCgC3Cgtgggcggactgg朋3gtC3g3ggtg3朋tCccagggctca541accttggaactgcctttgaaactatcagtctggagttcgag卿ggtg3gtggaattccg6013gtgt卿ggtgaaattcgtagatettcgg3gg朋C3CC3gtggcg朋ggcggctcactg661gctcgatectgacgctgaggtgcgaaagcgtgggg￡lgC￡l￡lac3ggattegataccctggt721agtccacgccgte朋cgatg朋tgccagacgtcggcaagcatgcttgtcggtgtcacacc781t朋cggatteagcattccgcctggggagtacggtcgcaag
841 acgggggccc gcac^gcgg tggagcatgt
901 accaaccctt gacatggcag gaccgctgga
961 cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg
1021 cgagcgcaac ccacgtccct agttgccagc
1081 atgateagtc ggagg^ggt gtggatgacg
1141 tacacacgtg ctacaatggt ggtgacagtg
1201 attgtcctct gcaactcgag ggcatgaagt
1261 ccgcggtgaa tecgttcccg ggccttgtac
1321 ctecccgacg acgctgcgct aaccttcggg
1381 ggggtg卿t
ggttteattc g^gc^cgc gcag^cctt gagattcagc tttctcgtaa gagacctgca tgtcgtgaga tgttcggtte agtccggc皿 attcagttgg gcactctatg gaaactgccg tcaagttctc atggccctta cgggttgggc ggttaatccc caaaagccat ctcagttcgg tgg33tcgct agteatcgcg g^cagcatg acaccgcccg tcacaccatg ggagttggtt gggcaggcgg ccacggtegg atc3gcgact
cgteac^gg tegccgte 實施例4蝦青素合成操縱子的擴增
以CAT 1 :5， GAATTCTGCAGGCGCTGGCGGCGCCGTTCCACGAC3，和CAT2 :5， CATAGGCTAAG CCGCGCCGCCCCGCGGGACTATTCTGGCCGATCA3'為擴增引物，以實施例2中制得的總DNA為模版， 對蝦青素合成相關的操縱子進行PCR擴增。使用K0D FX taq酶(Toyobo公司，日本)，擴 增條件依次為94。C 30秒，68。C 30秒，72。C 600秒，30個循環。然后加入2單位rtaq(寶 生物工程(大連)有限公司)，在72t:延伸30分鐘。PCR結束后，1% (w/v)瓊脂糖凝膠回 收，獲得長度為6352bp的SEQ ID No :1核苷酸(見
圖1)。 取10 iU直接與T/A克隆載體相連(寶生物工程(大連)有限公司)。4t:連接過 夜，高效轉化DH5a感受態中。37t:培養后，獲得橘黃色菌落(見圖2)。圖2左半邊為含有 SEQ ID No l序列的大腸桿菌菌落，呈橘黃色)；右半邊為不含SEQ ID No 1序列大腸桿菌 菌落，呈乳白色)。 實施例5蝦青素合成操縱子基因的合成 以基因合成方法(Nucleic Acids Research, 2004， 32， e98)將蟲下青素操縱子(SEQ ID No:l)克隆。設計的引物如下
l.EMPII-1: GAA， TTG， ACT, GCA， GGA， ACT, GGC， AGC， GCC， GAT， CCA， CGA， CTG， GAG， CAT, CCC， CAC， GAC， CGC， GTC
GTG， GGG
CGG， GAA
CCG， TGA
CCA， CAG
2. EMPII-2 : ACC， CGG， TCC， ，ATG， CTC
3. EMPII-3 : GAT， GAT， GGG， ，GGA， CAC
4. EMPII-4 : TGC， CCC， ACG， ，CGC， AGC
5. EMPII-5 : TGG， CGC， GGA， ，CGC， CTT
CGC， CCC， ATC， ATC， GGC， GCT， GTG， GCG， CGC， AGC， GAC， GCG， GTC，
GCG， GGA， CCG， GGT， TCT， GAC， CGG， GTC， GGG， CGG， GCT， GCG， TCA，
AGG， TCC， GCG， CCA， TCG， CGG， ATG， GAT， TTC， GCG， GTG， TCC， TTC，
CCT， CGT， GGG， GCA， AGC， GGC， GCG， CGC， TTT， GCC， CGC， CGC， GGG，
TGG， CCC:
CGC， CGA:
GCG， GAT:
GGA， CCC:
TCC， ATC:
GGC， AGT:
GCC， TTG:
GTG， GTT:
CAC， AGC:
GTT， CAT:
AAC， AAT:
TGT， CCT:
ACA， TGC:
6. EMPII-6 : AGC， TGC， CTC， GCG， GCG
7. EMPII-7 : GTC， CCA， CGT， CCT， TGC
8. EMPII-8 : CCA， GGC， CGT， CCG， GTG
9. EMPII-9 : GGT， GCT， GGT， CGG， CGC
10. EMPII-10 : TCC， CCC， GGA， CCC， GTT
11. EMPII-11 : GCC， GAT， CGC， TCT， GAC
12. EMPII-12 : GCG， GCG， TTG， GGC， AGG
13. EMPII-13 : CTC， GAA， CGG， TCT， GGA
14. EMPII-14 : AGG， TGA， CCC， GCA， TGC
15. EMPII-15 : CCT， GCC， GGT， CAT, CGC
16. EMPII-16 : GCA， CGC， GCC， CCG， ACC
17. EMPII-17 : GTC， GGA， CGT， GAT， ACT
18. EMPII-18 : TGC， TTG， ACG， TGG， GGC
ACG， ACG， TGG， GAC， AGG， TGA， TCG， AAC， AGG， GCC， AAG， GCG， CTG，
CGT， GAG， GCA， GCT， GCG， CAT， GGC， CAT， GTA， CTG， CAC， CGG， ATC，
GGC， ACC， AGC， ACC， GGC， GCG， CTG， CGC， AGC， GCC， GCA， AGG， TCG，
GCC， ACG， GCC， TGG， TGG， CCA， ATG， GTC， GCA， AAG， AAC， GGG， GAT，
GTC， GCG， ATC， GGC， GCA， GAG， TAC， AGT， CCC， GCG， GCG， CCG， GGG，
GAC， TCC， GGG， GGA， CAA， GAT， GAG， CGC， ACA， TGC， CCT， GCC， CAA，
ATG， CCG， TTC， GAG， ACG， ATC， AGG， CTT， GTG， GCG， GTC， AGA， ACT,
CAT， CAA， CGC， CGC， ATG， GCT， TGC， AAT， GCA， TGT， GCA， TGC， GCT，
GCG， ACC， GGC， AGG， ATG， CCA， TGG， GCC， GCC， GCG， TCC， AGA， AAC，
CGC， GGG， TCA， CCT， GGC， CCT， GGC， CTG， GCT， GTT， GGT， CGG， ATT，
GGC， ACG， TCC， GAC， CCG， TGC， ATC， GCG， CCA， TGC， GCG， ATG， ATG，
GCC， GGC， GCG， TGC， GCG， CGG， CAA， TGC， GCC， GAT， GCC， CCA， GCA，
ATC， ATC， TTG， CGC， CAC， GAA， AAT， CCG， GCA， AAG， AGT， ATC， AGG，
9
AAA， CGA
TTT， GTT
CGA， CCG
TCG， CGC
GCC， GAT
GGC， CAG
TAT， CCC
ATA， GCG
TTA， TCA
TAA， CGG
ATG， ACG
CAT， GCG
CAC， GGA
19. EMPII-GCG， CAA，
,CGA， GCC
20. EMPII-CGC， GCG，
,CCA， GCA
21. EMPII-CGC， GGT，
,GGT， GCT
22. EMPII-CCC， AGC，
,CAG， CCG
23. EMPII-GTT， GTA，
,GCC， GTC
24. EMPII-CAA， GTG，
,TTG， ACC
25. EMPII-GCT， GTG，
,GGA， CCG
26. EMPII-GAC， ACA，
,TCG， TGG
27. EMPII-GCG， GAT，
,TCA， CGT
28. EMPII-CGC， AGG，
,CCA， ATT
29. EMPII-GGT， GCC，
,AAT， TTG
30. EMPII-CGT， CAA，
,GTG， GCC
31. EMPII-GTG， CTG，
,AGG， CTG
-19 : GAT，
-20 : TAC，
-21 : CCG，
-22 :
ATC，
-23 :
TGC，
-24 : GGG，
-25 : CGT，
-26 : GGG，
-27 :
CAG，
-28 : CGC，
-29 : GTG，
-30 : CTC，
-31 :
GTG，
GAT， CGT， CAA， GCA， CAT， GGC， CGA， TCA， CCG， CCA， TGC， TGG， AAC，
CAG， CGG， ACC， GCG， GCG， CCA， TGG， TCG， AAA， TCT， GGC， TCG， TCG，
CTG， GTA， CGC， GCG， CTT， CAT， CGG， CAC， CTG， TTT， CGG， CTG， GCG，
AGC， GCA， TAC， AAC， GTC， ACG， TTG， ACG， GGC， AGC， AGC， ACC， CGG，
GCT， GAT， GCT， GGG， AAA， TCG， CTG， CAT， GTA， CGT， GGT， CAA， CTG，
AAC， ACG， CAC， AGC， CGG， ATC， GAC， GGG， AGG， ATC， GAC， GGC， ATC，
GTT， CCC， CAC， TTG， GCT， GCG， GCA， CCG， GGC， CGG， CCA， CGA， CGC，
TCG， CTG， ATC， CGC， GAC， GAG， CGC， GCA， TTA， TGG， CGG， TCC， GGG，
CGA， CCC， TGT， GTC， GCT， GCT， GAG， CTG， CTA， TCA， AAT， TGG， CCG，
AAC， CAC， GGC， ACC， GTC， GGG， TGC， CGG， TGG， TGA， ACG， TGA， TGA，
GTT， GCG， CCT， GCG， CAG， CAC， CCG， CAC， CAA， GGT， GGC， CAC， CGC，
CAT， CAC， CAG， CAC， GGT， GGC， GAC， GAC， GAT， CAG， CAA， ATT， CGT，
ATG， GAG， TTG， ACG， AAG， TAT， TCC， GTC， CAA， CGC， TGG， ATA， CAG，
GTG， CTG:
GGC， CTG:
GCC， GTA:
TTG， GGC:
CAA， CCC:
ATC， CCG:
GAT， GTA:
GTC， AGC:
GAC， GCA:
GAC， CCG:
GTC， GGC:
TGC， GAC:
GCA， GCG:
32. EMPII-GTC， GTG， TAT， CCA
33. EMPII-TCC， CAC， GTA， CCC
34. EMPII-GAT， CCA， CAC， CTC
35. EMPII-CTG， TGC， ATG， ACC
36. EMPII-CAC， AAA, GAT， CCA
37. EMPII-GGC， GTC， CGC， GGC
38. EMPII-CTG， CAG， GCG， GAT
39. EMPII-TAT， CAG， TTC， GGC
40. EMPII-GTC， CTG， ATG， CGG
41. EMPII-GTC， GAC， GAG， GAG
42. EMPII-GGC， TCG， CCG， CAG
43. EMPII-TGC， TGC， CGG， CGC
44. EMPII-CCG， CCG， CGA， GGG
-32 : TTC，
-33 :
CAC，
-34 : GCG，
-35 : ACG，
-36 : ATC，
-37 : CTG，
-38 : GCG，
-39 : GAA，
-40 : CTG，
-41 : AAG，
-42 : AGG，
-43 : TGG，
-44 :
CAT,
CTC， GTG， GTG， GGA， CGG， GTG， CCA， GCC， CAA， GCG， CAG， CCT， TCC，
GAG， GAA， CAC， GAC， CAC， GGG， CTG， GAA， GAG， AAC， GAG， GTG， TAC，
GAC， CGT， GCA， CAG， CAG， CGT， GGC， GAT， CAC， CGC， GGG， TAC， CAG，
GTC， CGC， TGG， ATC， TAA， ACG， CCG， GTC， CTG， TGG， TGG， ATC， GGG，
ATG， CAG， GAC， GCC， ATA， GAT， CAG， CCA， ATA， GAC， GGT， CAT， GCC，
CAT， GAT， TTT， GTG， GTT， CAT， CAG， CGC， TGG， CCA， ATC， CGC， TAC，
GTC， TTC， CTG， ATA， CAG， GCG， TCT， GCG， ATA， GCC， GCC， GCG， CGG，
GAC， CGC， CTG， CAG， CAT， GCG， GTC， GAG， CCG， CGC， CCG， CAT， TGC，
CAG， CTT， GTC， GAC， GAG， GCC， CGC， ATA， GAA， GAA， GCC， GAA， GCT，
CTG， CAG， CAG， GAC， GTG， AAG， ACG， TCA， AGC， GTA， CTG， CGG， GCC，
CTG， CCA， GCA， GCA， CGT， CAT， CCG， TCA， CGT， GGG， CTC， CTC， CGG，
CAG， CCT， CGA， GCC， TTG， CGA， ACG， CCC， TGA， TCG， CCC， TCG， CGC，
GGT， CCA， GCA， GCA， GCA， CGG， GCA， GGT， CGC， CCC， GCG， CCG， GTC，
45. EMPII-45:
TGC， TGC， TGG， GCC， ACG， AGG， GCG
46. EMPII-46:
GCC， GGG， GCT， GGC， ATG， ACC， AGG
47.EMPII-47:
TCC， CGC， GCC， TGC， GCT， TTC， GGG
48. EMPII-48:
CCA， GCG， AGC， GCA， CCT， CCT， GGT
49. EMPII-49:
CAA， CCG， GTT， TCA， GGT， CGG， GCG
50. EMPII-50:
CAT, CCA， GCA， TGA， CCA， CCG， CAT
51.EMPII-51:
GCG， ACA， TCG， CCC， CCA， TCG， AGG
52.EMPII-52:
GGG， ACT, TGT， GGG， TGC， CCC， AGG
53.EMPII-53:
GGC， CCC， GCC， TCC， TGG， GTG， TCG
54.EMPII-54:
CCG ， GCC ， CCG ， GGA， TGG， AGT， GGA
55.EMPII-55:
ACC， ACG， CCG， CCG， ACG， GGT， ACG
56.EMPII-56:
GGA， TGC， GCG， CGG， GCT， GGG， TGA
57.EMPII-57:
GGT， TCT， TTC， GCG， GCG， ATC， TCG
ACC， ATG， CGG， CGG， GAC， CGT， CAG， AAG， GGG， ATA， CCT， GGT， CAT,
TCA， GGC， GCG， GGA， GGG， AGT， GCG， GCG， ACA， GAT， CGC， CCT， CGT，
TGA， AGC， CCC， GGC， GCC， GCG， CCA， ACT， GGC， GGG， ACC， AGG， AGG，
CGT， AAC， CGG， TTG， CCA， GCC， GCC， TTG， CAT， GGC， CCC， GAA， AGC，
ACG， GCT， CGC， TGG， ACG， AGG， CGG， GGC， TGG， CGG， ATG， CGG， TGG，
AGG， CGA， TGT， CGC， TGT， GGG， AGC， GGA， TCT， CCC， CGC， CCG， ACC，
CCT， TGC， TGG， ATG， CGC， CGG， GCC， GGA， CAC， TGT， CCT， GGG， GCA，
GCG， GGC， GGG， GCC， CGT， CCA， GGA， GGG， AGC， CGG， CCT， CGA， TGG，
CGC， ACA， AGT， CCC， GGC， AAC， TGA， CCT， TCC， GTT， TCC， ACT， CCA，
GCA， CGG， CGT， GGT， TGC， CGT， CGG， TCT， CGA， TCT， CGA， CAC， CCA，
TGC， CGG， GGC， CGG， TGA， TCA， TGG， ACG， GGA， CAG， TCA， CCC， AGC，
TCC， GAA， AGA， ACC， GCA， GCA， GAT， AAT， GAA， AGC， CGT， ACC， CGT，
GGA， CGC， GCA， TCC， TGA， TCG， AGG， GCA， CGC， GCT， ATT， CCG， ATT，
58.EMPII-58:
CCG， CAT, AGT， CGC， AAT， CGG， AAT
59.EMPII-59:
CGG， CGT， CCC， TCC， GGC， GCG， AAC
60. EMPII-60:
TCG， CTT， CGT， GGA， CCT， CGG， CCG
61.EMPII-61:
CGT， TGG， CCC， CTG， TTC， GGG， TGG
62. EMPII-62:
AAT， AGC， CCG， CAG， GGG， CCT， CCG
63. EMPII-63:
TTC， AAA， CGG， ACG， CGG， TGG， CGG
64. EMPII-64:
CGG， GGC， GCA， CGT， CCG， CCA， CCT
65. EMPII-65:
GCA， CCG， ACG， CAC， GCC， GCG， ACC
66.EMPII-66:
AGC， GGC， GGA， GTG， CTG， GGT， CGA
67. EMPII-67:
ACC， GGA， TGG， TGC， AGC， GGG， TAT
68. EMPII-68:
CGG， CAT， AGA， GCA， GCA， GGG， TAT
69. EMPII 69 :
TGA， TCG， AAC， GCA， TCG， TGA， CAG
70. EMPII-70:
GGC， AGC， GTA， TGC， GCA， GCT， GTT
CTT， GGG， ACG， CCG， GGG， CCA， GCG， CGT， CGT， CGT， CGA， GAT， CGC，
AAG， ACT， ATG， CGG， GCC， AGC， AGG， GTT， GAA， CCC， CGG， CCG， AGG，
CAT， GGG， CCA， ACG， CAA， TAG， GCT， GGA， TGC， CCC， GTT， CGC， GCC，
ATG， ACG， AAG， CGA， CCT， TCT， GGC， CCG， ATC， ACG， CGG， AGG， CCC，
TGA， CCG， TTT， GAA， AGA， ACC， GGG， CGC， GCA， TTT， CCA， CCC， GAA，
TCA， CGG， GCT， ATT， CGC， TGC， GGT， ATG， CGG， GGC， AGG， TGG， CGG，
GCG， CGT， CGG， TGC， CGC， CCG， GCC， CGG， ACA， GCG， CCG， CCA， CCG，
CGC， TGC， GCC， CCG， CCA， TCC， GCG， ATC， ACG， CGA， TCG， ACC， CAG，
ACA， CCA， TCC， GGT， TCA， GCA， GGC， GCA， GGA， AGC， GGT， CGC， GGC，
TGT， TCC， GCC， GCT， GCG， CGA， ACG， ACC， CCC， GCT， ATA， CCC， TGC，
CCC， GTT， CGA， TCA， GTC， CAT， GCG， GCA， TGC， GGT， ATA， CCC， GCT，
GGG， TCT， ATG， CCG， GCC， CGC， TGA， AGG， TGG， CGC， AAC， AGC， TGC，
TGC， GGG， TGC， CAA， CGC， GAA， TGC， CTG， GCT， TGC， CTG， TCA， CGA，
ACG， CAT:
CGT， TTT:
CCG， CCT:
CGG， ATG:
CGA， TCA:
TCG， TGG:
CGG， GCA:
CCG， TTC:
CTA， CGA:
TAG， AAC:
TCG， CAT:
CGA， CGG:
CCA， AAT:
71. EMPII-TTG， GCA， GAA， CGC
72. EMPII-GCG， CCG， CTT， CAT
73. EMPII-AAC， CGC， GCA， GTC
74. EMPII-TTG， TCG， GCC， AGG
75. EMPII-CCT， TGT， GGA， CCA
76. EMPII-CCG， GTT， CTG， ACA
77. EMPII-GAC， TGT， GGA， CAT
78. EMPII-TAG， AAG， AGC， GCT
79. EMPII-GAT， GCC， TTA， CGT
80. EMPII-AAC， TTT， TTG， GGG
81. EMPII-GGA， ACG， CCG， TGA
82. EMPII-AGC， TTG， TCT， CCT
83. EMPII-CCA， GGA， GCT， CAA
-71 :
ccc，
-72 : ATC，
-73 : CAT,
-74 : CGG，
-75 :
CGA，
-76 : TCG，
-77 :
CAT,
-78 : CCC，
-79 :
GCT，
-80 : TCG，
-81 : CCA，
-82 : ACG，
-83 : CCC，
GCA， TAC， GCT， GCC， TGG， CGG， AAC， GAC， CGG， TGC， ATG， AAG， AAA,
ACG， ATG， GCG， GTT， TTG， GCC， GCG， GGC， GAA， TGG， GCG， TTC， ATG，
CGT， GAT， CGG， CGC， TGG， CTT， TGG， CGC， GCA， GGG， CCT， GGC， CAT,
GCC， TCG， ACA， AGG， GTG， GTG， GCG， ATG， TGC， GCG， GAC， TGC， AGG，
GGC， CCG， CGA， CAA， GCC， CGG， CCA， GCG， CGC， CTA， TGT， CAG， CCA，
GTG， ATG， ACA， GTC， GGG， GGC， GCG， TCG， GGG， ACA， TGG， TCC， TGA，
CAC， CGA， AAC， CGG， TGC， GGT， CAA， GGA， GCT， GTG， AGC， GCT， GAA，
GAC， AGC， GGC， ATC， AGC， GTC， ACC， TCG， CGC， GAA， ATG， TCC， TGC，
GTC， GGG， CTT， CTA， TCG， GCT， GTT， GTG， GCC， GGG， CCC， CAA， GTT，
AAA， TGG， CGT， TCC， TGC， TGA， TCG， GGC， TCG， TTC， ACG， TAA， TCG，
TTT， CGA， AAA， GTT， CAA， CCC， GGA， CAA， CCT， GGA， AGG， AGA， CCG，
TAG， GGG， TCC， TGG， TAC， ACG， GGC， TCA， GCG， TGA， TCA， CGG， ATG，
CTA， CGT， CAA， GCT， GGG， CAC， CGT， GGC， CTT， CCT， CAA， GCT， GGG，
TGG， CCC:
CAA， GGA:
TTG， ATG:
CTA， TGC:
TAG， ATC:
CAT， GGT:
ATG， CGG:
GCG， CAC:
CGC， GCG:
CAA， CTA:
TTG， TGC:
GTC， GTT:
GAC， ATC:
84. EMPII-GAA， TTG， AGC， TTG
85. EMPII-GAA， GCT， CCC， CTA
86. EMPII-CCC， ACC， AAG， GTC
87. EMPII-GTA， TCA， GCT， GAT
88. EMPII-TTG， GCG， GAG， CTG
89. EMPII-CGC， CGC， CGC， GCT
90. EMPII-TTG， GCG， GCG， ACC
91. EMPII-CCA， GAT， TAC， CCG
92. EMPII-ATG， TCG， GGC， TCG
93. EMPII-GCG， GTC， TCG， CGA
94. EMPII-CCC， GCG， ATG， ACG
95. EMPII-CCG， CGC， GTT， CGT
96. EMPII-GCG， ATG， GAC， CAG
-84 : TAT，
-85 : TGA，
-86 : AGC，
-87 : GAC，
-88 : AAC，
-89 : CGT，
-90 :
TTC，
-91 :
GAT，
-92 : CCG，
-93 : AAT，
-94 : TCG，
-95 : GCA，
-96 : TCC，
GCC， TCA， AGC， TTC， ATC， AGC， GCG， CCC， GCG， GCC， TTG， AGC， ATT，
GGC， ATA， CAA， TTC， CGT， CCA， TGC， CAA， GGT， CGC， GAC， CTT， CAT,
AGC， GTC， TGA， TAC， GAA， GCG， GCT， TGC， CGC， AGA， TAG， GGG， TCC，
GCT， GCT， GGT， GGG， CGG， GAA， TTA， TTT， CTC， GCA， CAG， CTC， GAT，
CAG， ACG， GCG， GCG， CGC， CGC， GCC， AGC， GCG， TGG， ATC， AGC， GCA，
CTG， GTT， CGC， CAA， CCC， CAA， CAC， CAA， CCA， GCT， GGT， CGC， CCG，
AGC， ATC， ATC， TGG， CCG， CCT， GGG， CGT， TCG， AAC， AGC， GCG， ACC，
GCT， GAA， CGC， CAA， GGT， CGC， CCG， CAT， CGA， GAC， CGA， GCC， CGC，
GTC， ATT， GAC， CGC， CCG， TCC， GCC， AGG， GTG， ACG， CGG， GTA， GTG，
GAC， CGG， CGA， CAT， GGA， CGC， CAG， CAA， CTG， CGA， CGT， CAT， GCA，
CTC， TGC， GCG， CGG， GCC， GTG， TGG， CGC， AAC， AGG， TCG， CGA， TAG,
GAG， CGA， CGC， GGG， ATC， GCT， CCA， CCG， CAA， GCG， CTG， GTC， GAT，
TTC， GCC， GCC， TCG， CCC， AGA， CCG， AAT， TGC， AGC， ACG， AAC， AAC，
15
97.EMPII-97 :CGA， GGC， GGC， GAA
CTA， CAA:，GGA， GCC98.EMPII-98 :TCC， TCG， GCC， AGC
TAG， CCG:，GGG， CCG99.EMPII-99 :ACG， CCC， GGA， GCT
CAC， CAC:，CGA， TCC100.EMPII-100 :AGC， ACG， TAA， GGC
GTG， CAG:，GGC， GAA101. EMPII-101 :CAT， GTC， CAC， GCC
CGA， GAT:，CGA， TTG102.EMPII-102 :GCC， AGG， ATG， CGG
TCG， GCG:，CGG， CTC103.EMPII-103 :CTA， TGC， CGA， CCG
CTT， GGG:，CGC， CAA104.EMPII-104 :GCG， AAT， TCG， GCG
AAG， TTC:，GGG， ATC105. EMPII-105 :TTT， CAC， GGG， CGC
CGC， TTT:，CCC， GGT106. EMPII-106 :TGC， GGC， CGG， AAC
GCG， CTG:，CCG， TGA107.EMPII-107 :ATC， CGC， GTG， GTT
CTA， TCT:，GGT， CGG108.EMPII-108 :ACG， ACG， CCG， GGA
TAG, GGG:，TTG， CGG109.EMPII-109 :GGC， GGA， AAT， TCC
GAT， GCT:，GTC， CGA
GGA， CAT， CGC， GCA， TCA， CAC， CAT， CCT， GTT， CGG， CCC， CGG，
TCC， GGG， CGT， TTG， AAT， ATC， TCG， TTG， ACC， GGC， TCC， TTG，
GGC， CGA， GGA， TTT， CTC， GCG， GTA， TCG， GCA， TTC， GCC， CTG，
GTG， GAC， ATG， CCC， GGA， GCC， GCC， ATG， TCC， GGA， TCG， GTG，
TTA， CGT， GCT， GGG， CGC， GGT， GCC， GCA， TCT， GAG， CCG， CGC，
TCG， GCA， TAG， CGC， GGG， CCC， TCG， ACC， GCC， CAA， TCG， ATC，
CAT， CCT， GGC， ATT， CCT， CCA， GGA， GCG， GCT， GAT， CCC， GAA，
CCC， GTG， AAA， ATG， CGC， GTC， CTG， CTC， AGG， TTG， GCG， CCC，
CGA， ATT， CGC， CAG， TGA， ACT， GAA， CCG， GCA， TCA， CGG， CAG，
CAC， GCG， GAT， TGC， GTC， AGG， ATC， GGC， TCG， ACC， GGG， AAA,
CCG， GCC， GCA， CAA， CCG， CCA， CAA， GAC， GAT， CCG， CAA， CCC，
ATT， TCC， GCC， GGC， GGA， TGG， GTG， GGC， GCG， CCG， ACC， AGA，
CGG， CGT， CGT， GGG， CTC， GGC， CAA， AGC， CAC， GGC， CCA， GGT，
110.EMPII-110 :CCT， CGA， GGT， CAG
ATC， ACC:，TGG， GCC111. EMPII-111 :GAT， CTG， CTC， CTG
TTT， GGC:，ACG， GCG112. EMPII-112 :CAC， CGT， GTC， GTC
AAA, GCT:，TCG， CGA113. EMPII-113 :GGT， ATC， GGC， GAC
GAT， GAC:，GTG， ATC114. EMPII-114 :GTT， CAC， CGC， CTC
ATC， CGC:，GTC， CCG115. EMPII-115 :AGA， AGG， CCG， GAG
CGT， GCC:，GAC， ACG116. EMPII-116 :GGG， CCG， CGT， CAC
ACG， CAG:，GCC， GTC117. EMPII-117 :GAC， GGT， CCG， GTG
AGG， CAT:，GAT， TTC118. EMPII-118 :CGC， AAA， GCC， TTC
CCT， GCG:，CGC， CAC119. EMPII-119 :GAC， CTG， ATC， GAA
AGG， CTG:，GAT， GAC120. EMPII-120 :GGC， GAG， GAT， ATG
CCT， GCG:，ATA， GTC121. EMPII-121 :CAC， GTC， GCG， CAT
CGC， GAC:，CAT, CTT122.EMPII-122 :CTG， GAA， CGC， CAG
GCG， CAC:，GCC， CAT
GAG， CAG， ATC， GCT， CAT， GCC， CTC， GCC， AAG， TCG， GAC， AGC，
ACC， TCG， AGG， GAA， GCG， ATC， ACC， CAA， GGG， TCG， CGA， AGC，
GCC， GAT， ACC， CGG， CGG， CAT， CAG， CTT， CCG， CGC， CGT， GCC，
GAC， ACG， GTG， ATG， CTC， TAT， GCC， TGG， TGC， CGG， GAC， GCG，
CGG， CCT， TCT， GCC， CAC， CGC， CTG， ACC， GTC， GAT， CAC， GTC，
GCG， GTG， AAC， GAG， GAA， CAG， GCG， CGG， CTG， GAC， GGC， CTG，
CGG， ACC， GTC， GCC， CTG， CAC， CGC， CGC， CAG， CGT， GTC， GGC，
ACG， CGG， CCC， TTT， GCG， GCC， CTG， CGC， GCG， GTG， GCG， CGC，
GAT， CAG， GTC， CAT， GGG， CCA， GGG， CTG， CCC， GAA， ATC， ATG，
GGC， TTT， GCG， ATT， GAT， GAA， GAG， GCG， CGC， GAC， TAT， CGC，
CGC， GAC， GTG， ATA， GGA， ATT， TTC， CAG， CAC， GTC， ATC， CAG，
ATC， CTC， GCC， GTG， ATG， ATG， GCC， CGC， GTG， ATG， GGC， GTG，
GGG， CAG， GTC， GCA， GGG， CCG， GTC， CAG， GAC， AAG， ATG， GTC，
123.EMPII-123 :GAC， CTG， CCC， CTG
GAC， TAT:，GCC， CGC124. EMPII-124 :GTG， GTC， CAG， CCA
GTC， GAT:，CAC， GTC125. EMPII-125 :CCG， GGG， GAC， TGG
GCC， TCA:，CCC， GAA126. EMPII-126 :TTC， CGC， GGC， ATC
GGC， CAC:，CGG， CCC127.EMPII-127 :CGG， CTG， CTG， GAT
CTG， GCG:，GAT， CTG128. EMPII-128 :CCG， AAA， CGC， GGC
CAG， ACG:，GAC， GGG129. EMPII-129 :AAC， ATC， CGG， GCC
GGC， AAG:，GGC， CCG130. EMPII-130 :GCC， CTT， GGA， CGT
GCC， GAT:，GGG， CAG131. EMPII-131 :CCG， ATC， AGC， ACG
CCC， TGG:，GAT， GTC132.EMPII-132 :CTG， CCG， TGA， CAC GGG， GCC:，GTT， GCG133.EMPII-133 :CCG， TCG， GGC， GTG
TAG, GCG:，CGC， GCG134. EMPII-134 :GGA， AAT， TGA， GGC
CTA， GCC:，GTG， ATG135. EMPII-135 :TCC， AGC， ACA， GCC
ATC， CCA:，TTC， AGC
GCG， TTC， CAG， CTG， ACC， CAC， ATC， GCG， CGC， GAC， GTG， ATC，
GTC， CCC， CGG， CAG， ATA， GCA， CGG， CGG， GAT， GCG， GGC， ATA，
CTG， GAC， CAC， GCG， GGC， GCG， CGG， GTC， CAC， GGG， CCG， GTG，
CAG， CAG， CCG， CAG， GAT， CAC， GGT， GTA， CAG， TTC， GGG， TGA，
GCC， GCG， GAA， GGC， TAT， TAC， CCG， TCC， GCG， CCC， GTC， CGT，
CCG， GAT， GTT， CCA， GGC， GCA， GCG， AGG， CGG， CAG， ATC， CGC，
GCG， TTT， CGG， ATC， TAT， CGC， GGG， ATC， CCG， CTG， CCC， ATC，
GCT， GAT， CGG， TTG， GCG， ATA， GGC， CTC， CGG， CGG， GCC， CTT，
TCC， AAG， GGC， GCC， AAA， ATC， GCT， CTG， CTC， CGC， AAC， GGC，
GCC， CGA， CGG， CCG， GCA， GGC， GTG， ATC， GGC， GAC， ATC， CCA，
TCA， CGG， CAG， GAC， TCC， TGG， ACG， GGC， CCG， CAT， CAC， GGC，
TGT， GCT， GGA， ACC， CGC， GTT， GCC， TTA， CGG， CGC， GCG， CGC，
TCA， ATT， TCC， GGA， GGG， TGA， AGG， CGC， TTG， CTG， GGC， ACC，
136.EMPII-136 :GCA， GAA， AGT， GTG
GAT， GGT:，GCC， CAG137.EMPII-137 :TAC， TGG， CCG， CAC
CAC， GCG:，CCG， GAC138. EMPII-138 :GGC， GGC， GCT， GGG
GTG， GCG:，AGG， GGT139. EMPII-139 :GTA， TCC， TTG， CCC
TCA， TAG:，GAC， TGA140. EMPII-140 :CCA， GAT， GCT， TGA
TGA， CGA:，CCT， GCT141. EMPII-141 :CGG， CGA， AAA， TCA
ATC， ACG:，GCC， AGC142. EMPII-142 :CCT， GAG， GAC， CGG
GAT， CAA:，AGA， GGT143. EMPII-143 :AAC， AAC， ACG， CCG
TTC， TTG:，TCC， GCA144.EMPII-144 :GCC， GCA， GCG， CCT
GAA， CGG:，CGC， GGG145. EMPII-145 :CCG， GCG， CAC， AGG
AGC， TGC:，GCC， CGC146. EMPII-146 :GTG， GCT， GCT， GGC
GCT， GGT:，GCG， GAT147. EMPII-147 :CGC， GCA， CCG， GCC
AGC， AGC:，ACG， GCG148. EMPII-148 :CGG， CCA， GCT， GGC
GCT， TGG:，CAT, CGC
CGG， CCA， GTA， TGA， GGC， CAG， CCG， CGG， GCA， GCT， GAA， TGG，
ACT， TTC， TGC， AGG， TCT， GAC， ACG， GCG， AGA， ACC， CCT， CGC，
CAA， GGA， TAC， GGG， TCG， CGA， TGC， GGC， TTG， GTC， CGG， CGC，
AGC， GCC， GCC， TGG， TCG， CCC， AGA， ACT， TCC， AGC， AGG， TCG，
TTT， TCG， CCG， TCA， GCT， GGG， CCG， GGT， GTT， TCA， GTC， CTA，
AGC， ATC， TGG， ATC， TGC， TTC， TCG， GCG， TCG， ACC， TCT， TTG，
CGT， GTT， GTT， CAT， CGA， GGG， ACT， GAA， GAT， GCT， GGC， CGT，
GTC， CTC， AGG， TCC， TGT， TCC， TGG， TCG， ACC， CCC， GCG， CCG，
GTG， CGC， CGG， CCA， GGA， CCT， GGA， CTT， GCA， TGC， GGA， CAA，
CGC， TGC， GGC， CCC， AGG， GAC， CGC， GAC， TGG， ATC， CGC， ACC，
CGG， TGC， GCG， CGG， CGC， GTC， GGG， CAC， GGT， GCG， GGC， GCA，
AGC， AGC， CAC， ATC， GCC， TCG， GTG， ATC， AAA， GCG， ATG， CCA，
GAC， CCA， TCT， GGC， GCA， TGT， CGA， TAG， CCT， CGC， CGT， GCT，
149.EMPII-149 :AGA， TGG， GTC， GCC
CCC， AGG:，TCG， TCG150. EMPII-150 :TTG， CGC， CCT， CGA
GGG， CTG:，CAT， GCA151. EMPII-151 :TGC， ACA， ATC， TCG
GGG， CCC:，GAA， GCC152.EMPII-152 :CAA， GCG， TCC， CCG
CCC， GGT:，CTG， CTA153.EMPII-153 :AGC， ATG， CCG， CGG
CCA， AGC:，GGC， TGC154. EMPII-154 :CAG， AAT， TGA， GGA
TGG， CGC:，CGC， TTT155. EMPII-155 :TGG， CGG， ATC， TCC
TTG， ACG:，TCT， CGT156. EMPII-156 :AAC， GCC， AGG， TCA
CAA， GGC:，GAT， CCA157.EMPII-157 :CTT， GGG， TTC， TGA
AGA， CGG:，TCA， TCC158. EMPII-158 :ATC， GGC， GTG， AAC
TCT， GCC:，CGA， TAC159. EMPII-159 :GTT， AGA， ACG， GTT
CTT， CGC:，GCG， GCT160.EMPII-160 :ACC， ATC， GGC， GTG
AAG， GCG:，CGT， CGT161. EMPII-161 :GCG， CGG， GTG， AAT
GTG， CCG:，GTC， CAC
AGC， TGG， CCG， CCG， CGC， AGG， GCG， GCA， TCG， TGC， ATG， CAG，
GAT， TGT， GCA， TGC， CGC， ATC， GCT， GAT， CGT， CGA， CGA， CCT，
AGG， GCG， CAA， GCC， GCG， TCG， ACG， ATC， GTG， TAG， CAG， ACC，
CGG， CAT， GCT， GAT， GCT， GCT， TGC， GGG， CGA， GGC， TTC， GGG，
GGA， CGC， TTG， CGG， GAG， GAC， AGC， GCC， GCC， AAA， GCG， GCG，
GAT， CCG， CCA， GCC， ATT， CGG， TGC， TGC， GTT， GCA， GCC， GCT，
TCA， ATT， CTG， GTC， TGC， GGA， AGG， GTG， GCG， TGG， ATC， GCC，
GAA， CCC， AAG， CGC， GAA， GGC， ACT， GAT， GAG， ACG， AGA， CGT，
CCT， GGC， GTT， ATG， GCC， TGG， CCC， GCC， GTG， GTA， TCG， GGC，
CGT， TCT， AAC， ATC， CGG， ACT， GTT， GAC， GGT， GGA， TGA， CCG，
CAC， GCC， GAT， TGC， CGA， CCC， AAT， TCG， ACG， ACG， ACG， CGC，
CCG， GTC， CAC， TGA， CTT， TGT， TGG， ACA， AAT， AGC， CGC， GCG，
CCG， GCC， AAG， GAT， GCA， TGA， CTG， CCC， GCA， ACC， ATC， GGC，
利用PCR進行蝦青素操縱子全長擴增，在100 ii 1反應體系中，EMPII-2-EMPI 1-160 共159個擴增引物的添加量為2ng， 2個外側引物EMPII-1和EMPII-161添加量為30ng。擴 增條件依次為94t:預熱lmin ;94°C 30秒，50°C 30秒，72°C 10min，共25個循環。擴增所使 用的Taq DNA聚合酶為KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)。 PCR結束后，用0. 8% (w/v)瓊脂糖膠回收，取10 直接與T/A克隆載體相連(寶 生物工程(大連)有限公司)，4t:連接過夜。之后高效轉化入大腸桿菌DH5a感受態中，獲 得陽性克隆。 實施例6蝦青素合成操縱子在大腸桿菌中表達并合成蝦青素
挑取實施例4中呈橘黃色的大腸桿菌菌落于20ml LB液體培養基(5g/L酵母提取 物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH7.5)中，37。C振蕩培養12小時。培養液在 5， 000g重力加速度下離心5min，無菌水清洗1次。所得的細胞沉淀用2mL濃度為1M磷酸 緩沖液(113g/L K2HP04，47g/LKH2P04)重懸浮，然后將其轉移到微量離心管中，以12， 000g再 次離心5min。沉淀用濃度為5ml/g的甲醇重懸浮后，以12， 000g再次離心5min，去除上清 液于鋁箔中保存。再用甲醇抽提四次，每次的上清液分別裝入試管中保存。對每個樣品測 定其在470nm下的吸光值。將各部分收集到一起混勻，0. 22 y m膜過濾滅菌，測定混合液在 470nm下的吸光值(根據蝦青素吸收光譜確定，見圖3)。根據標準曲線計算樣品中蝦青素 含量為每克濕重細胞含有蝦青素182 ii g。g朋ttgactgcaggaactggcagcgccgatccacgactggagcatccccacgaccgcgtc60gctgcgcgcc3C3gCgCCg3tgEltggggCgggaccgggttctgaccgggtcgggcgggct120gcgtcacggg朋gg3C3CCgcgaaatccatccgcgatggcgcggacctcgtggggcaagc180ggcgcgcgctttgcccgccgcgggccacagcgccttggccctgttcgatcacctgtccca240cgtcgtgaggcagctgcgcatggccatgtectgcaccggatccgccgaccttgcggcgct300gcgcagcgcgccggtgctggtgccacggcctggtggcc朋tggtcgca朋g雄ggggElt360ggaccccggcgccgcgggactgtectctgcgccgatcgcgactccggggg3C朋g3tg3g420cgcacatgccctgcccaaggcagttctgaccgccacaagcctgatcgtctcg朋cggcat■caacgccgcatggcttgcaatgcatgtgcatgcgctgtggtttctggacgcggcggccca540tggcatcctgccggtcgcgggtcacctggccctggcctggctgttggtcggattgttcat600catcgcgcatggcgcgatgcacgggtcggacgtgccggcgcgtgcgcgcggcaatgcgcc660
21
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一種副球菌蝦青素合成操縱子，序列為SEQ ID No1。
2. 根據權利要求l所述的副球菌蝦青素合成操縱子，其特征在于所述的SEQ ID No 1含有P胡蘿卜素酮酶基因；13胡蘿卜素羥化酶基因；番茄紅素|3環化酶基因；八氫番茄紅 素去飽和酶基因；八氫番茄紅素合成酶基因以及櫳牛兒基焦磷酸合成酶基因。
3. 根據權利要求1或2所述的副球菌蝦青素合成操縱子，在生物合成蝦青素中的應用。
4. 根據權利要求1或2所述的副球菌蝦青素合成操縱子，在利用原核生物合成蝦青素 中的應用。
5. 根據權利要求4所述的副球菌蝦青素合成操縱子，在大腸桿菌合成蝦青素中的應用。
6. —種包含權利要求1所述副球菌蝦青素合成操縱子的表達載體。
7. 根據權利要求6所述的含有副球菌蝦青素合成操縱子的表達載體，其特征在于所述 表達載體為T/A載體，其通過與SEQ ID No :1序列直接連接形成。
8. 根據權利要求6所述的含有副球菌蝦青素合成操縱子的表達載體，在生物合成蝦青 素中的應用。
9. 根據權利要求7所述的含有副球菌蝦青素合成操縱子的表達載體，在大腸桿菌合成 蝦青素中的應用。
全文摘要
一種副球菌蝦青素合成操縱子，全長6352bp。通過培養、提取總DNA和PCR擴增后得到操縱子的序列為SEQ ID No1。由于該操縱子源自于副球菌屬微生物，具有安全、非致病性核對環境污染很小等特點，該序列及其表達載體可以應用于蝦青素的生產。
文檔編號C12N15/63GK101768593SQ20091004494
公開日2010年7月7日 申請日期2009年1月6日 優先權日2009年1月6日
發明者付曉燕, 姚泉洪, 孫廣東, 彭日荷, 熊愛生, 田永生, 薛永, 趙偉, 金曉芬, 高峰 申請人:上海市農業科學院