專利名稱：鼠李糖乳桿菌m8、鼠李糖乳桿菌slp及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種鼠李糖乳桿菌菌株，還涉及鼠李糖乳桿菌的一種工程菌及其制備方法。
背景技術：
目前，利用表層蛋白(即S-層蛋白)在人體腸道中定植這一特性，國外巳有部分研究和 報道，有些已應用于臨床治療，比如幽門螺桿菌感染所引起的嬰兒嚴重腹瀉等，其效果非常 顯著。然而，我國在益生菌定植培養方面的研究， 一直進展緩慢，僅在醫學方面對病原微生 物的定植能力有過相關的研究。近年來，對于功能性益生菌在食品上的應用得到國內學者和 大眾的肯定，在該領域方面的功能性食品也層出不窮，如何提高這些功能性食品在人體消化 道內的積極功效，便逐漸引起國內學者的關注。
乳酸菌便是一種存在于人類體內的益生菌，是發酵糖類主要產物為乳酸的一類無芽孢、 革蘭氏染色陽性細菌的總稱，其因能夠將碳水化合物發酵成乳酸而得名；絕大部分的乳酸菌 都是人體內必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其廣泛存在于人體的腸道中，能夠幫助 消化，有助人體腸臟的健康，因此乳酸菌常被視為健康食品添加在酸奶之內。鼠李糖乳桿菌 是乳酸菌中一種，其可順利通過胃酸、膽鹽直接進入腸道，支持良好消化功能，能快速建立 腸道優勢益生菌群落。鼠李糖乳桿菌對輪狀病毒引起的急性胃腸炎具有改善效果，可預防及 減短幼童腹瀉時間，調節人體腸道，具有改善胃腸健康之功效。鼠李糖乳桿菌已應用于膠囊、 錠劑及粉末類之營養補給食品。鼠李糖乳桿菌也可添加到酸奶、奶粉及乳酸菌飲料等功能性 訴求的食品中。然而，由于鼠李糖乳桿菌腸道黏附能力較差，因而限制了其在功能性食品中 的應用。
乳酸菌表層蛋白在腸道中不會被各種消化酶所消化，并且能耐膽汁的作用，因此可考慮 將含S-層蛋白的乳酸菌開發成益生菌或是作為抗原抗體的載體。更重要的是，已有的大量研 究和實驗均己經證實，S-層蛋白還能夠用于益生菌(尤其是乳酸菌)在腸道中的定植，能大 大提高益生菌在腸道中的粘附能力。然而，目前已知的含有S-層蛋白的乳酸菌并不多， GENBANK中收錄的也不超過20種，而且對于這些乳酸菌產生的S-層蛋白的功能及機理的 研究也很不透徹。由于這些乳酸菌的黏附能力強弱不一，因此嚴重制約了乳酸菌在功能性食 品中的應用。
發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一株鼠李糖乳桿菌(Zacto6fld/ks r/ww"w附)菌株，并提供由該菌株通過一種簡單、低成本的方法制備得到的一株鼠李糖乳桿菌SLP，該鼠李糖乳桿菌SLP在人體腸道中黏附能力大大增強，能夠有效強化鼠李糖乳桿菌 在人體消化道中的積極功效。
為解決上述技術問題，本發明的基本思路就是從不同分離源中篩選到富含S-層蛋白的乳 酸菌株，再對S-層蛋白進行提純和定量分析，并將S-層蛋白編碼基因克隆到不含S-層蛋白的 益生性乳酸菌(例如鼠李糖乳桿菌)中使其高效表達。為此，本發明首先提供了一株鼠李糖 乳桿菌M8，其特征在于所述鼠李糖乳桿菌M8是保存于中國微生物菌種^f^管,員會普通微生 物中心且f繊號為CGMCC Na3002的菌株。該菌株是從發酵肉中分離獲得，艦平戯嘰分離純 化得到，經16SrRNA鑒定為鼠李糖乳桿菌。該菌株的保藏單位為中國微生物菌種,管理委員會 普通微生物中心CGMCC，保藏單位地址位于北京市朝陽區大屯路的中國科學院微生物研究所， 保藏日期為2009年4月7日，該菌株被命名為鼠李糖乳桿菌M8 a/:MS)。
上述提供的鼠李糖乳桿菌M8可用于進一步制備本發明的工程菌~~鼠李糖乳桿菌SLP，所 述鼠李糖乳桿菌SLP是在權利要求1所述鼠李糖乳桿菌CGMCC No.3002中,有乳酸菌表層 蛋白基因的工程菌。上述的鼠李糖乳桿菌SLP中，所述乳酸菌S-層蛋白優選是指瑞士乳桿菌 aa"oMd//M/7e/ve"cw)表層蛋白，該i^t乳桿菌菌株分離自日常食用泡菜，M31平板劃線分離 純化得到，經16SrRNA鑒定為g乳桿菌。經過我們的反復實驗，發現選用優選的瑞士乳桿菌 S-層蛋白能夠穩定地導入到本發明上述的鼠報乳桿菌M8中，并且能穩定地得到本發明的鼠李 糖乳桿菌SLP，且本發明選用的瑞士乳桿菌S-層蛋白對宿主菌體無毒性，其基因資源也能夠 簡單、方便地取得。
上述的鼠李糖乳桿菌SLP中，所述瑞士乳桿菌表層蛋白占所述鼠李糖乳桿菌SLP菌體蛋 白的30%~60%。現有的鼠李糖乳桿菌并不分泌S-層蛋白，但本發明提供的鼠李糖乳桿菌SLP 的S-層蛋白分泌量較野生型鼠李糖乳桿菌大大增加，相比瑞士乳桿菌分泌量也有較大提高。
本發明還^i共一種上述鼠李糖乳桿菌SLP的制備方法，包括以下步驟以鼠李糖乳桿菌 CGMCC No.3002為宿主，將S-層蛋白基因通過電轉化方法導入該宿主中，經溫育后所述S-層 蛋白基因在該宿主中成功表達，得到鼠李糖乳桿菌SLP。
上述鼠李糖乳桿菌SLP的制備方法中，所述S-層蛋白基因優選是以瑞士乳桿菌表層蛋白 基因為模板設計一對引物，通過PCR擴增后得到，所述引物的全長基因序列如下 slp5F (5'-3') CG GGATCC ATGAAGAAAAATTTAAG BamHI slp5R (5'-3') GG GGTACC TTATTCAAAGTTAGCAA Kpnl 。 上述鼠李糖乳桿菌SLP的制備方法中，所述PCR擴增反應條件優選為94'C~95°C預 變性3min 5min; 95。C變性lmin; 60。C 5(TC退火30s lmin; 72。C延伸2min; 10個循環； 95。C變性lmin; 50。C退火1 min; 72。C延伸2min; 25個循環；72。C延7min。上述鼠李糖乳桿菌SLP的制備方法中，通過我們的實驗及對后續檢測結果的對比，所述 電轉化的操作條件優選包括電壓1500V 1800V，電擊時間為3ms 8ms。電轉化的具體操作 程序可直接按照電轉化儀器的操作規程進行。
上述鼠李糖乳桿菌SLP的制備方法中，所述溫育時的溫度優選為37'C左右，溫育時間優 選為3h左右。
上述鼠李糖乳桿菌SLP的制備方法中，所述溫育過程中以及制備完成后對制得的鼠李糖 乳桿菌SLP進行轉化后培養過程中均用到轉化后培養基，該轉化后培養基包括以下質量分數 的組分骨膠原多肽0.5%~1.5%、酵母膏0.5%、葡萄糖0.5%、 KH2PO40.3%、吐溫80 0.5%、 西紅柿汁5%、乙酸鈉0.5%和檸檬酸鈉0.2%;培養溫度為37t:，培養基初始pH值6.0，轉 速150r/min，培養時間48小時。該轉化后培養基是我們針對鼠李糖乳桿菌的特性自行配制的， 其培養效果更好。
采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法對上述培養后的鼠李糖乳桿菌SLP進行檢測，結果顯示有大 量S-層蛋白得到表達。
與現有技術相比，本發明的優點在于通過轉基因技術，將乳酸菌S-層蛋白成功表達在 鼠李糖乳桿菌上，使乳酸菌S-層蛋白成功應用于鼠李糖乳桿菌的定植培養。用本發明方法生 產制備的鼠李糖乳桿菌SLP，其表面特異性表達有大量的S-層蛋白，其在腸道中的定植時間 得到大大延長。在以該鼠李糖乳桿菌SLP作為發酵劑的制品中，因為鼠李糖乳桿菌SLP獲得 了相關吸附特性，有利于該益生菌體在人體內腸道內定植，使益生菌占據腸道表面，排斥病 原菌對人體腸道表面細胞的侵蝕和攻擊，保護人體健康。利用表達有S-層蛋白的鼠李糖乳桿 菌SLP做成功能性食品不僅可以促進腸道有益微生物的生長，提高人體健康，而且可以獲得 較好的社會經濟效益。此外，本發明提供的鼠李糖乳桿菌SLP的制備方法簡單，可以降低生 產成本，提高鼠李糖乳桿菌SLP的效價。
一種鼠李糖乳桿菌菌株(Ia"o6od//us rtomwosus M8)，其保藏單位為中國微生物菌種皿管 理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC),保藏號為CGMCC No.3002，保藏日期為2009年4 月7曰。
圖1為利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術對本實施例結果進行檢測的電泳圖，圖中泳道1表 示蛋白Marker,泳道2表示誘導前菌液，泳道3表示誘導后菌液，泳道4表示超聲處理后上 清液，泳道5表示超聲處理后沉淀，泳道6表示GHC1處理上清液，泳道7表示GHC1處理 沉淀，泳道8表示野生型瑞士乳桿菌表層蛋白。
具體實施方式
實施例
本發明的一種優選實施方式如下。 步驟l、準備以下原料和設備 步驟1.1準備培養基
步驟l丄l準備新鮮的MRS瓊脂板和MRS液體培養基，主要用于單菌落的分離、菌種 活化和稀釋。
步驟1丄2準備轉化后培養基，其組分包括(質量百分數)骨膠原多肽0.5%~1.5%、酵 母膏0.5%、葡萄糖0.5%、 KH2PO40.3%，吐溫80 0.5%、西紅柿汁5%、乙酸鈉0.5%和檸檬酸 鈉0.2%; pH值為6.0。
步驟1.2準備緩沖液0.5mol/L庶糖，7mmol/LKH2P04和k2hp04， lmmol/L MgCl2， pH7.4。
步驟1.3準備電轉化設備高壓脈沖電擊轉化儀。
步驟1.4獲取SLP蛋白基因
步驟1.4.1設計引物以瑞士乳桿菌(ATCC 15009)表層蛋白基因(Genebank登錄號-AJ388559)為模板設計引物，擴增表層蛋白全長基因，如下
slp5F (5'-3') CG GGATCC ATGAAGAAAAATTTAAG BamHI slp5R (5'-3') GG GGTACC TTATTCAAAGTTAGCAA Kpn I
粗體部分為酶切位點。
步驟1.4.2按如下反應方案進行PCR擴增反應 10xBuffer 5pL dNTPs (10mM) lpL primer (20uM) 1^L 模板(100ng/pL) lnL Taq DN A polymerase 1 jjL
超純水 加至總量為50 pL
95°C預變性5min; 95°C變性1 min; 60。C 50。C退火1 min; 72。C延伸2min; 10個循 環；95。C變性lmin; 5CTC退火1 min; 72。C延伸2min; 25個循環；72°C延伸7min。
通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成， 確定PCR擴增后得到瑞士乳桿菌表層蛋白基因(S-層蛋白全長基因)。
將上述所得S-層蛋白全長基因與質粒pQE30連接得到質粒DNA,測序確認構建無誤后 導入大腸桿菌JM109中，檢測表達情況，確認能表達后將該質粒DNA留待備用。
6步驟2、利用上述原料和設備制備本發明的鼠李糖乳桿菌SLP
步驟2.1從上述MRS瓊脂板上挑取一個鼠李糖乳桿菌CGMCCNo3002單菌落，接種于上 述的MRS液體培養基中，37'C培養過夜。 步驟2.2感受態細胞的培養
將步驟2.1中的過夜培養物進行系列稀釋102~106倍，再接種于含2%甘氨酸并預熱的上 述MRS液體培養基中，37。C靜置過夜培養至對數生長期使OD600達到0.8~1 。再將5 mL的 該過夜培養物接種于100mL含2%甘氨酸并預熱的上述MRS液體培養基中，37。C靜置培養至 對數早期OD600達到0.2-0.3，加入10嗎氨芐青霉素鈉(Ampicillin), 37'C繼續靜置培養至 OD600達至!j0.4 0.5。
步驟2.3離心洗滌與細胞重懸
將步驟2.2中得到的培養液轉移至離心管中，在室溫下6000Xg離心10 mim棄上清， 用與該培養液等體積的上述緩沖液洗滌細胞兩次。再用該培養液體積1/100的上述緩沖液重 懸細胞，放置冰上得到感受態細胞懸液。
步驟2.4吸取10(^L上述制備的感受態細胞懸液到0.5mL冰冷的微量無菌離心管中，冰 浴5min。加入4nL 5pL待轉化的上述制備得到的質粒DNA (DNA濃度為lOOng/^L),冰浴 5min。將感受態細胞懸液與質粒DNA的混合液加入冰冷的2mm電擊轉化杯中，輕擊電擊杯 以確保混合液位于電擊杯底部，并不得產生泡沫。擦干電擊槽外的冷凝水和霧水，將電擊杯 放入電擊儀。
步驟2.5高壓脈沖電擊轉化
調節電擊儀，使電脈沖為25pF、電壓1.7kV、電阻200ft，電擊時間5ms。 步驟2.6轉化子復蘇
電脈沖結束后，快速從電擊槽中取出電擊杯，加入5mL預冷的轉化后培養基中；混勻后 轉移至37-C溫度下進行溫育，靜置溫育3 h，使鼠李糖乳桿菌復蘇并表達質粒編碼的抗生素 (Ampicillin)標記基因。
步驟2.7轉化子培養與篩選
分別取電擊轉化后的細胞原液和用轉化后培養基稀釋后的電擊轉化細胞液100 nL，鋪在 含有lOOpg Ampicillin的轉化后培養基平板中，37'C厭氧條件下倒置培養；24h 72h內出現菌
落，初步確定為是鼠李糖乳桿菌的一種工程菌菌落。 步驟3、分析檢測結果 步驟3.1誘導表達
挑取上述步驟2.7中平板上的單個菌落，經BamHI和Kpnl雙酶切及測序確認構建無誤后進行誘導表達。
步驟3丄1挑取轉化后的菌落接種于4mL含100ng/mL Ampicillin的轉化后培養基中， 37°C，靜置培養過夜；
步驟3.1.2取2.5mL過夜培養后的菌液接種于2x50mL轉化后培養基(含100ng/mL Ampicillin)中，37°C， 300 rpm培養至OD600達0.5~0.7;
步驟3.1.3誘導前取出lmL菌液(noninduced control),離心，將沉淀重懸于50pL 1 xSDS-PAGE loading buffer中，-20"保存備用得到誘導前菌液；
步驟3丄4加入異丙基-(3-D硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度lmM;
步驟3丄5繼續培養4h 5h，取lmL培養后的菌液，離心，再將沉淀重懸于 100nLl xSDS-PAGE loading buffer中，-20°。保存備用得到誘導后菌液；
步驟3.1.6以4000xg離心10 min收集菌體。
步驟3.2超聲處理
步驟3.2.1將步驟3丄6中的收集的菌體重懸于5mL無菌水中；
步驟3.2.2加入一定量溶菌酶使終濃度為lmg/mL，冰上放置30min;
步驟3.2.3 200W 300W超聲波處理6個10s,每次間隔10s，整個操作都在冰上進行；
步驟3.2.4在4°C、 10000xg條件下離心20min~30 min，小心倒出上清(crude extract A，
soluble protein),放置冰上保存得到超聲處理后上清液；
步驟3.2.5將超聲處理后沉淀重懸于5mL無菌水，即為不溶物質的懸浮液(crude extract
B， insoluble protein )。
步驟3.3表層蛋白的粗提
將步驟3丄6中收集的菌體重懸于3 mL 5M GHCl中，室溫處理30min。 13000xg離心 lOmin，使可溶解蛋白質與細菌細胞表面分離。將GHCl處理上清液轉入一個新的玻璃瓶中(用 透析膜封口)，或轉入透析袋中，用5L蒸餾水或50mMTris-HCl緩沖液在4'C下透析24h，其 間約12h換水一次，透析袋中所得就是表層蛋白粗提液。
步驟3.4利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術進行分析
利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術對誘導前菌液、誘導后菌液、超聲處理后上清液、超聲處 理后沉淀、GHC1處理上清液、GHC1處理沉淀進行分析，并將分析結果與蛋白Marker和野 生型瑞士乳桿菌表層蛋白進行對比，結果如圖1所示。
由圖1可見，野生型瑞士乳桿菌表層蛋白(見泳道8)的分子量為48kDa，在圖1中泳 道3、 4和6的相應位置上也出現了蛋白表達，而在泳道5相應位置未發現有蛋白表達，說明 外源基因得到了表達，并分泌到胞外。泳道2和3表明S-層蛋白在鼠李糖乳桿菌表面得到表
8達；泳道4和5說明表達的S-層蛋白為可溶性蛋白，而非包涵體；泳道6和7說明S-層蛋白
正確表達到了鼠李糖乳桿菌表面，而非分泌到液相中。從圖1中我們可以看出，本實施例制備
的鼠李糖乳桿菌SLP中，瑞士乳桿菌表層蛋白的表達量約占到鼠李糖乳桿菌SLP菌體蛋白的 50%。〈110〉 湖南農業大學
〈120> 鼠李糖乳桿菌M8、鼠李糖乳桿菌SLP及其制備方法
<160〉 2
〈210〉 1
<211> 25bp
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
<220>
〈223〉 引物 <400>
cggga tccat gaaga aaaat ttaag 25
〈210〉 2
〈211〉 25bp
〈212〉 DNA
<213> 人工序列
〈220〉
<223> 引物 〈400〉
ggggt acctt attca aagtt agcaa 25
10
權利要求
1、一株鼠李糖乳桿菌M8，其特征在于所述鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)M8是保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心且保藏號為CGMCC No.3002的菌株。
2、 一株鼠李糖乳桿菌SLP，其特征在于所述鼠李糖乳桿菌SLP是在權利要求1所述鼠 李糖乳桿菌M8中表達有乳酸菌表層蛋白基因的工程菌。
3、 根據權利要求2所述的鼠李糖乳桿菌SLP，其特征在于所述乳酸菌表層蛋白是指瑞士乳 桿菌(丄ac/o6acz7/ws/2e/ve//cw<y)表層蛋白。
4、 根據權利要求3所述的鼠李糖乳桿菌SLP，其特征在于所述瑞士乳桿菌表層蛋白占所 述鼠李糖乳桿菌SLP菌體蛋白的30% 60%。
5、 一種如權利要求2所述的鼠李糖乳桿菌SLP的制備方法，包括以下步驟以權利要求l 所述鼠李糖乳桿菌M8為宿主，將乳酸菌表層蛋白基因通過電轉化方法導入該宿主中，經溫育 后所述乳酸菌表層蛋白基因在該宿主中成功表達，得到鼠李糖乳桿菌SLP。
6、 根據權利要求5所述的鼠李糖乳桿菌SLP的制備方法，其特征在于所述乳酸菌表 層蛋白基因是以瑞士乳桿菌表層蛋白基因為模板設計引物，通過PCR擴增后得到，所述引物 的全長基因序列如下slp5F (5'-3') CG GGATCC ATGAAGAAAAATTTAAG BamHI slp5R (5'-3') GG GGTACC TTATTCAAAGTTAGCAA Kpnl。
7、 根據權利要求6所述的鼠李糖乳桿菌SLP的制備方法，其特征在于所述PCR擴增 反應的條件為94°C~95°C預變性3min 5min; 95°C變性lmin; 6(TC 50。C退火30s lmin; 72。C延伸2min; IO個循環;95'C變性lmin; 50。C退火1 min; 72。C延伸2min; 25個循環; 72。C延7min。
8、 根據權利要求5或6或7所述的鼠李糖乳桿菌SLP的制備方法，其特征在于，所述 電轉化的操作條件包括電壓1500V-1800V,電擊時間為3ms 8ms。
9、 根據權利要求5或6或7所述的鼠李糖乳桿菌SLP的制備方法，其特征在于所述 溫育時的溫度為37'C，溫育的時間3h。
10、 根據權利要求5或6或7所述的鼠李糖乳桿菌SLP的制備方法，其特征在于，所述 溫育過程中用到的轉化后培養基包括以下質量分數的組分骨膠原多肽0.5%~1.5%、酵母膏 0.5%、葡萄糖0.5%、 KH2PO40.3%、吐溫80 0.5%、西紅柿汁5%、乙酸鈉0.5%和檸檬酸鈉0.2%。
全文摘要
本發明公開了一株鼠李糖乳桿菌M8菌株，并公開了由該菌株制備得到的一株鼠李糖乳桿菌SLP，其制備方法是以鼠李糖乳桿菌M8為宿主，將乳酸菌表層蛋白基因通過電轉化方法導入該宿主中，經溫育后乳酸菌表層蛋白基因在該宿主中成功表達。該鼠李糖乳桿菌SLP在人體腸道中黏附能力大大增強，能夠有效強化鼠李糖乳桿菌在人體消化道中的積極功效。
文檔編號C12N1/21GK101671634SQ20091004446
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月30日 優先權日2009年9月30日
發明者李宗軍, 王遠亮 申請人:湖南農業大學