專利名稱：利用骨膠原多肽粉對乳酸菌進行高密度培養的方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物的培養方法，具體涉及一種乳酸菌的高密度培養方法。
背景技術：
乳酸菌是能夠發酵乳糖、產物以乳酸為主的一大類細菌的統稱，它們主要分布在人與動物的腸道內，與雙岐桿菌一起控制著人體腸道的菌群平衡，清除腸道內的有毒物質，抵御腸道中的致病菌對其宿主的侵襲，對常見的致病菌(如痢疾桿菌、傷寒桿菌、致病性大腸桿菌、葡萄球菌等)有拮抗作用。此外，乳酸菌還具有防治便秘、下痢與胃腸障礙的功效，其產生大量乳酸，能夠促進腸壁蠕動、幫助消化，在腸道內合成維生素、氨基酸等物質，同時能夠有助于人體對鈣、磷、鐵離子等營養素的吸收，而且還有助于兒童腦及神經系統的發育。因此，以乳酸菌為主要原料的飲料與食品制劑在國內外都有很廣闊的市場。
盡管乳酸菌制品的市場需要量很大，但乳酸菌是一類腸道菌，在離體的情況下，乳酸菌的培養方法依然是本領域技術人員所面臨的一個技術難點，即乳酸菌的單位培養液中乳酸菌數量不高，很難達到109CFU/mL。如果要生產乳酸菌制品，則需要大量的培養空間與時間。目前，國內外都在探討對乳酸菌的高密度培養技術，所采用的方法有進行氣調培養的，有添加氨基酸等生長因子的，也有采用添加低聚糖類或茶多酚類的物質進行培養的。利用上述技術進行培養，具有成本大、操作難等問題，要在食品企業推廣應用則更顯不易。
發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種成本低、操作簡單、能獲得高活性、高濃度乳酸菌的利用骨膠原多肽粉對乳酸菌進行高密度培養的方法。
為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為一種利用骨膠原多肽粉對乳酸菌進行高密度培養的方法，該方法是以乳酸菌(例如清酒乳桿菌Z:fl"(^aa7/^ Sab)為菌種，首先采用乳酸菌基礎培養基對菌種進行活化、擴大培養，再接種(一般按3%的接種量)到發酵培養基中發酵培養12 18h(優選14h)，收集菌體并加入到蛋白保護劑中溶解，最后經真空冷凍(一般情況下真空度〈20Pa，溫度一40'C 一50'C)、干燥獲得成品；所述發酵培養基中添加有骨膠原多肽粉。
上述技術方案中，所述乳酸菌可選用其中的一種清酒乳桿菌作為指示菌種，該清酒乳桿菌可在發酵肉中分離獲得，利用該菌的生長來表示乳酸菌在本發明培養方法中的生長情況，當然也可以選用其他種類的乳酸菌作為指示菌種。上述技術方案中，所述發酵培養基的各組分及其質量分數為骨膠原多肽粉0.5~1.5%，酵母膏0.5%，葡萄糖0.5%， KH2PO40.3%，吐溫80 0.5%，番茄汁5%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸鈉0.2%和余量的水。
上述技術方案中，所述發酵培養基的pH值控制在6.4~6.8，即發酵培養基的初始pH值控制在6.4~6.8，在培養過程中通過流加堿(例如2mol/L的NaOH)作為中和劑以控制發酵液的pH值為6.4~6.8;所述發酵培養時的溫度控制在35~40°C (優選37。C)。
上述技術方案中，所述蛋白保護劑的組分及其質量分數為脫脂乳10%、甘油2%、海藻糖2%和余量的水，所述蛋白保護劑主要用于溶解收集的菌體，所述收集的菌體與溶解菌體的蛋白保護劑的質量比為1 :4。
上述技術方案中，所述乳酸菌基礎培養基由以下質量份數的組分配制而成IO份牛肉蛋白粉、IO份魚肉汁、5份酵母浸出汁粉、20份葡萄糖、5份醋酸鈉、2份檸檬酸二銨、0.1份吐溫80、 0.58份硫酸鎂、0.28份硫酸猛和1000份蒸溜水，所述乳酸菌基礎培養基的pH值控制在6.2 6.4。
上述技術方案中，所述骨膠原多肽粉具體是通過以下方法制得取鮮豬骨洗凈，初碎后用沸水蒸煮，去除蒸煮液表層油脂后將骨塊瀝干并干燥；再將骨塊進行粗粉碎、超微粉碎制成骨粉，加水將骨粉配制成骨泥液，高溫滅菌(85'C溫度下滅菌15min)后冷卻(自然冷卻至50'C以下)并添加Protamex復合蛋白酶進行酶解，滅酶;過濾后取過濾液真空濃縮并冷凍干燥，得到骨膠原多肽粉。在骨膠原多肽粉的制備過程中，沸水蒸煮時骨塊與水的質量比為1 : 1~1 : 2，沸水蒸煮時的溫度控制在110°C~120°C，壓強控制在143kPa~198kPa,時間控制在30~60min。所述Protamex復合蛋白酶的添加量為酶解底物骨粉質量的2~2.596。，所述Protamex復合蛋白酶酶解時的pH值為7.5,溫度控制在55i:,酶解時間為10~15h。對骨塊進行干燥時的溫度控制在80 85'C，且干燥至含水量小于5%;在對骨塊進行粗碎、超微粉碎時，所述骨塊粉碎成骨粉的粒度小于160目；所述骨泥液的質量濃度為10~15%。
與現有技術相比，本發明的優點在于本發明采用骨膠原多肽粉作為添加物，在無需再添加其他物質的情況下，通過本發明的培養方法可以有效延長清酒乳桿菌的對數生長期，獲得高活性、高濃度的菌懸液(其中清酒乳桿菌活菌數達到2xl09~9xl09CFU/mL)，將制得的菌懸液進行離心收集并加入復合保護劑后可以制成干粉型的發酵劑。如果干粉發酵劑中微生物的數量控制為101QCFU/g，則lOmL本發明的發酵培養基即可制備出lg干粉發酵劑。如果采用普通培養法培養乳酸菌，最終發酵液中的微生物數量一般只有為108CFU/mL，而用普通培養方法制備乳酸菌的干粉發酵劑，則需要使用大量的發酵培養液(接近于本發明培養方法培養液用量的10倍)，且需占用較大的發酵空間，生產上還必須使用大容量的發酵罐。可見，
本發明的培養方法通過利用少量的微生物發酵培養液，在小型發酵罐中即可完成乳酸菌的高密度培養，在生產成本上大大減少了營養成分的使用，減少了發酵過程中的熱量消耗，同時能獲得濃度更高的乳酸菌制品，是一種成本小、操作易、效果好的乳酸菌高密度培養方法。
具體實施例方式
實施例1:
一種利用骨膠原多肽粉對乳酸菌進行高密度培養的方法，該方法是以清酒乳桿菌aacto^d//^ Safe)為菌種，首先采用乳酸菌基礎培養基(MRS培養基)對清酒乳桿菌進行活化、擴大培養，再按3%的接種量接種到發酵培養基中，在37'C溫度下發酵培養14小時，發酵培養過程中通過流加2mol/L的NaOH溶液控制pH值為6.8，培養結束后離心收集菌體并加入到蛋白保護劑中溶解(收集的菌體與溶解菌體的蛋白保護劑的質量比為1:4)，最后經真空冷凍、干燥獲得干粉型乳酸菌發酵劑。
上述發酵培養基的組分及質量分數如下骨膠原多肽粉0.5%，酵母膏0.5%，葡萄糖0.5%，KH2PO40.3%，吐溫80 0.5%，番茄汁5%,乙酸鈉0.5%,擰檬酸鈉0.2%和余量的水，調節初始pH值為6.8。
上述用到的MRS培養基的配方如下牛肉蛋白粉10g，魚肉汁10g，酵母浸出汁粉5g，葡萄糖20g，醋酸鈉5g，檸檬酸二銨2g，吐溫80 0.1g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.28g，蒸溜水1000g， pH值控制在6.2~6.4。
上述用到的蛋白保護劑的組分及其質量分數為脫脂乳10%、甘油2%、海藻糖2%和余量的水。
上述用到的骨膠原多肽粉是通過以下方法制備得到取鮮豬骨洗凈后初步破碎，將破碎后的骨塊放入蒸煮容器中，往容器中添加與骨塊等質量的水，在115'C溫度、143kPa壓強下蒸煮40min，然后去除上層油脂，瀝干，斬碎得到3~4cm的骨塊，85。C溫度下干燥7h，干燥后將骨粒經粉碎機粗粉碎，再經超微粉碎機進行超微粉碎，將超微粉碎后的骨粉過160目篩；將過篩后的骨粉加水配制成10%質量濃度的骨泥液裝入容器內，在85'C水浴中滅菌15min,再冷卻至40'C以下，調節pH值至7.5，然后加入酶解底物骨粉質量2.296。的Protamex復合蛋白酶(丹麥諾維信公司生產，標注活力為1.5 AU/g (安森單位/克))，在溫度為55X:、 pH值7.5的條件下酶解12h，然后在85'C水浴中滅酶15min，過濾收集酶解液；使用旋轉蒸發濃縮儀將收集的酶解液濃縮至原體積的1/4，然后將濃縮液置于-3(TC冰箱中凍結，再經冷凍干燥24h，收集骨膠原多肽粉保存于-24'C冰箱中。通過本實施例的培養方法制備得到的干粉發酵劑中清酒乳桿菌活菌數目為2xl01()CFU/g，發酵液中的活菌數目為2.1xl09CFU/mL。
實施例2:
一種利用骨膠原多肽粉對乳酸菌進行高密度培養的方法，該方法是以清酒乳桿菌為菌種，首先采用乳酸菌基礎培養基(MRS培養基)對清酒乳桿菌進行活化、擴大培養，再按3%的接種量接種到發酵培養基中，在37'C溫度下發酵培養12小時，發酵培養過程中通過流加2mol/L的NaOH溶液控制pH值為6.5，培養結束后離心收集菌體并加入到蛋白保護劑中溶解(收集的菌體與溶解菌體的蛋.白保護劑的質量比為1:4)，最后經真空冷凍、干燥獲得干粉型乳酸菌發酵劑。
上述發酵培養基中的組分及質量分數如下:骨膠原多肽粉1%，酵母膏0.5%，葡萄糖0.5%，KH2PO40.3%，吐溫80 0.5%，番茄汁5%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸鈉0.2%和余量的水，調節初始pH值為6.8。上述用到的MRS培養基、蛋白保護劑的配方與實施例1相同，上述用到的骨膠原多肽粉的制備方法與實施例1相同。
通過本實施例的培養方法制備得到的干粉發酵劑中清酒乳桿菌活菌數目為9.0xl01QCFU/g，發酵液中的活菌數目為9.0xl09CFU/mL。
實施例3:
本實施例中僅僅將實施例1中發酵培養基添加的骨膠原多肽粉的質量分數調整為1.5%，其余的工藝步驟及工藝參數與實施例1相同。
通過本實施例的培養方法制備得到的干粉發酵劑中清酒乳桿菌活菌數目為8.8xl01QCFU/g，發酵液中的活菌數目為8.9xl09CFU/mL。
權利要求
1、一種利用骨膠原多肽粉對乳酸菌進行高密度培養的方法，該方法是以乳酸菌為菌種，首先采用乳酸菌基礎培養基對菌種進行活化、擴大培養，再接種到發酵培養基中發酵培養12～18h，收集菌體并加入到蛋白保護劑中溶解，最后經真空冷凍、干燥獲得成品；所述發酵培養基中添加有骨膠原多肽粉。
2、 根據權利要求1所述的利用骨膠原多肽粉對乳酸菌進行高密度培養的方法，其特征在 于所述乳酸菌選用的是清酒乳桿菌aactotoc"/w
3、 根據權利要求1所述的利用骨膠原多肽粉對乳酸菌進行高密度培養的方法，其特征在 于所述發酵培養基的各組分及其質量分數為骨膠原多肽粉0.5~1.5%,酵母膏0.5%，葡萄糖 0.5%， KH2PO40.3%，吐溫80 0.5%，番茄汁5%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸鈉0.2%和余量的水。
4、 根據權利要求1所述的利用骨膠原多肽粉對乳酸菌進行高密度培養的方法，其特征在 于所述發酵培養基的pH值控制在6.4~6.8，發酵培養時的溫度控制在35 40°C 。
5、 根據權利要求1所述的利用骨膠原多肽粉對乳酸菌進行高密度培養的方法，其特征在 于所述蛋白保護劑的組分及其質量分數為脫脂乳10%、甘油2%、海藻糖2%和余量的水； 所述收集的菌體與蛋白保護劑的質量比為1 : 4。
6、 根據權利要求1所述的利用骨膠原多肽粉對乳酸菌進行高密度培養的方法，其特征在 于所述乳酸菌基礎培養基由以下質量份數的組分配制而成IO份牛肉蛋白粉、IO份魚肉汁、 5份酵母浸出汁粉、20份葡萄糖、5份醋酸鈉、2份檸檬酸二銨、0.1份吐溫80、 0.58份硫酸 鎂、0.28份硫酸錳和1000份蒸溜水，所述乳酸菌基礎培養基的pH值控制在6.2 6.4。
7、 根據權利要求1~6中任一項所述的利用骨膠原多肽粉對乳酸菌進行高密度培養的方 法，其特征在于所述骨膠原多肽粉是通過以下步驟制備得到取鮮豬骨洗凈，初碎后用沸水 蒸煮，去除蒸煮液表層油脂后將骨塊瀝干并干燥；再將骨塊進行粗粉碎、超微粉碎制成骨粉， 加水將骨粉配制成骨泥液，高溫滅菌后冷卻并添加Protamex復合蛋白酶進行酶解，滅酶；過 濾后取過濾液真空濃縮并冷凍干燥，得到骨膠原多肽粉。
8、 根據權利要求7所述的利用骨膠原多肽粉對乳酸菌進行高密度培養的方法，其特征在 于所述Protamex復合蛋白酶的添加量為酶解底物骨粉質量的2 2.596。，所述Protamex復合 蛋白酶酶解時的pH值為7.5，溫度控制在55'C，酶解時間為10~15小時。
9、 根據權利要求7所述的利用骨膠原多肽粉對乳酸菌進行高密度培養的方法，其特征在 于所述沸水蒸煮時，骨塊與水的質量比為1 : 1~1 :2，沸水蒸煮時的溫度控制在 110°C~120°C，沸水蒸煮時的壓強控制在143kPa 198kPa，沸水蒸煮的時間控制在30 60min。
全文摘要
本發明公開了一種利用骨膠原多肽粉對乳酸菌進行高密度培養的方法，該方法是以乳酸菌為菌種，首先采用乳酸菌基礎培養基對菌種進行活化、擴大培養，再接種到發酵培養基中發酵培養12～18h，收集菌體并加入到蛋白保護劑中溶解，最后經真空冷凍、干燥獲得成品；所述發酵培養基中添加有骨膠原多肽粉。本發明的培養方法具有成本低、操作簡單等優點，且能獲得高活性、高濃度的乳酸菌成品。
文檔編號C12N1/20GK101475923SQ20091004254
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月19日 優先權日2009年1月19日
發明者珂 李, 李宗軍, 李羅明, 王傳花, 王遠亮, 靜 謝 申請人:湖南農業大學