專利名稱：一種用于檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及病毒檢測領域，具體涉及一種利用環介導等溫擴增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技術檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的試劑盒及其檢測方法。
技術背景傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)是世界各地養殖和野生對蝦的重要病毒性病原之一。該病毒的感染宿主范圍廣、危 害非常嚴重，對細角濱對蝦(Lit叩enaeusstylirostris)有很髙的致病性，能造成其幼體和仔蝦 高達90%的死亡率；也會導致凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)慢性矮小殘缺綜合癥 (Runt-deformity syndrome, RDS)，使養殖凡納濱對蝦規格參差不齊，產量下降，造成高達 50%的經濟損失。因此，國際獸疫局(O正)將IHHNV引起的疾病列為必須報告的重要的水 生動物病毒性疫病之一。目前對IHHNV引起的對蝦病害尚無有效的治療方法，只能以預防為主；而這又主要依賴 于早期快速的診斷和篩査。近年來基于臨床組織病理學、免疫學以及PCR技術等的各種診斷 方法已被用于IHHNV的檢測。但是現有的這些方法都存在一定的不足，例如基于組織病理 學的方法不僅操作繁瑣、費時，而且靈敏度較低；基于免疫學的方法雖然具有敏感性高、檢 測快速等特點，可用于大批標本的檢測，但對新鮮樣品進行檢測時出現的假陽性問題在一定 程度上還限制著該方法的廣泛應用；而PCR方法敏感、準確、快速，可替代病原學檢測，但 由f需要昂貴的儀器設備、較高檢測費用以及對檢測人員較高的技術要求而使其不適用于現 場快速檢測及基層普及應用。LAMP是一種新型的核酸等溫擴增技術，該技術針對耙基因的6個區域設計4條特異引物， 利用一種鏈置換DNA聚合酶(5W DNA polymerase)在恒溫條件下即可完成核酸擴增反應， 擴增出LAMP特征性梯狀條帶。LAMP技術在保持PCR技術優點的基礎上，進一步增強了反 應的特異性和縮短了檢測時間；特別是它不需使用昂貴的熱循環儀，在等溫條件下就能完成 反應，且擴增產物用肉眼能觀察，可用于病原微生物的現場快速檢測。但是在實際應用中， 由于特異性引物設ii和其檢測試劑盒研制的復雜性，導致LAMP技術還未能推廣于醫療衛生、 食品等領域；在水產動物病原的檢測方面更是未能見到有LAMP診斷試劑盒的推出和應用。 發明內容本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種用于檢測IHHNV的試劑盒。該試劑盒 特異性強，敏感性高，準確快速。
本發明另一目的在于提供一種利用上述試劑盒檢測IHHNV的方法。該方法方便、靈敏，
增強了反應的特異性并縮短了檢測時間。
本發明上述目的通過以下技術方案予以實現 本發明用于檢測IHHNV的試劑盒包括如下組分-
(1) 組織樣品的基因組DNA提取液；
(2) LAMP預反應液；
(3) 勘,DNA聚合酶；
(4) LAMP反應穩定液；
(5) LAMP反應顯色液；
(6) 陽性對照DNA;
(7) 陰性對照DNA。
其中，所述組分(1)包括組織裂解液和DNA吸附液；組織裂解液為含有4 6M異硫 氰酸胍(GTC)、 20 25mM檸檬酸鈉、0.5%十二烷基肌氨酸鈉和0.1 0.2M/3-巰基乙醇；DNA 吸附液為含50%磁珠的懸浮液。
所述組分(2)包括20 25mMpH為8.8的Tris-HCl、 2~4mM硫酸鎂、10~12mM氯化鉀、 10 12mM硫酸銨、l~1.25%TritonX-100、 400 500/iM dNTP、 0.8 1.2M甜菜堿、0.8 1^M序 列如SEQ ID NO.l所示的引物IHHNV-FIP、 0.8~1//M序列如SEQ ID N0.2所示的引物 IHHNV-BIP、 0.2~0.4)tiM序列如SEQ ID N0.3所示的引物IHHNV-F3、 0.2 0.4/iM序列如SEQ ID NO.4所示的引物IHHNV-B3 。
所述組分(3)為每微升含8個活性單位的SWDNA聚合酶。
所述組分(4)由礦物油或液體石蠟油組成。
所述組分(5)為含有10。/。SYBRGreenl的熒光染料。
所述組分(6)為含有提取的IHHNV病毒基因組DNA。
所述組分(7)為含有提取的健康對蝦基因組DNA。
本發明試劑盒的主要原理為①設計一組能特異識別靶DNA的六個不同序列的兩個內弓I 物(t游內引物和下游內引物)和兩個外引物(上游外引物和F游外引物)，內引物包含靶 DNA的正義鏈和反義鏈；②其中一個內引物首先與靶DNA雜交，隨后的鏈置換DNA合成，在 具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下，由一個外引物啟動，釋放出單鏈DNA，并作為由雜交到耙的另一端的一個內引物和一個外引物啟動的DNA合成的模板，產生一個原始的莖 環DNA;③內引物以原始的莖環DNA為模板，啟動鏈置換DNA的合成，產生一個原始的莖環 DNA和一個新的有兩倍莖長度的莖環DNA;④在等溫條件下，內引物以莖環DNA為模板，通 過鏈置換形成多個含有靶DNA反復重復序列的莖環DNA，在一小時內該循環反應可使靶DNA 累積到109拷貝，最后通過加入熒光染料來觀察擴增結果。 利用本發明試劑盒檢測IHHNV的方法包括如下步驟-
(1) 待檢樣品DNA的提取
A. 取待檢樣品置于離心管中，加入組織裂解液，搗爛，室溫裂解；
B. 離心取上清，置于離心管中；
C. 加入DNA吸附液，室溫放置，期間搖勻；
D. 離心，棄上清液，加入70%乙醇，上下顛倒混勻，使沉淀充分重懸起來；
E. 離心，棄上清液，將沉淀放置于恒溫金屬浴中烘干，離心管蓋打開；
F. 加入ddH20，使用移液器上f吹打混勻，55'C放置，離心，上清液即為待檢樣品的DNA;
(2) 傳染性皮下及造血組織壞死病毒的LAMP擴增
A. 根據待檢測樣品的數目，設置所需LAMP反應管數；
B. 吸取LAMP預反應液，加入一潔凈的離心管中，然后加入&fDNA聚合酶，混合均勻， 離心，得到混合液；
C. 向反應管中分別加入上述混合液，然后在每個反應管中再分別加入LAMP反應穩定 液，離心；
D. 向上述反應管內按順序依次分別加入陰性對照DNA、待檢模板DNA和陽性對照DNA;
E. 置恒溫金屬浴中于64。C恒溫反應；
(3) 顯色檢測
取出LAMP反應管，冷卻至室溫，離心，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依 次分別加入顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。 利用本發明試劑盒檢測IHHNV的方法優選為 (1)待檢樣品的DNA提取
A. 取待檢樣品25 30mg置于1.5 ml離心管中，加入200pL組織裂解液，搗爛，室溫裂解 30分鐘；
B. 12000轉/分離心3 5分鐘，取上清，置于1.5ml離心管中；
C. 加入15aiLDNA吸附液B，室溫放置5分鐘，期間搖勻3次；D. 10000轉/分離心20秒，棄上清液，加入200;uL 70%乙醇，上下顛倒混勻，使沉淀充分 重懸起來；
E. 10000轉/分離心30秒，棄上清液，將沉淀放置于6(TC的恒溫金屬浴中烘干3 5分鐘；
R加入2(^LddH20，使用移液器上下吹打混勻，55'C放置5分鐘，然后10000轉/分離心30 秒，上清液即為待檢樣品的DNA:
(2) 傳染性皮下及造血組織壞死病毒的LAMP擴增
A. 根據待檢測樣品的數目，設置所需LAMP反應管數N， N=樣品數+l管陽性對照+l管 陰性對照；
B. 吸取LAMP預反應液的體積為Nx23/zL，加入一潔凈的1.5mL離心管中，然后加入N 5wDNA聚合酶，混合均勻，1500 2000轉/分鐘離心10秒；
C. 向設定的N個反應管中分別加入24/xL上述混合液，然后在t述每個反應管中再分別 加入3(^L LAMP反應穩定液，2000轉/分鐘離心5秒；
D. 向上述N個PCR反應管內按順序依次分別加入陰性對照DNA、待檢模板DNA和陽性對 照DNA各l/zL，蓋緊管蓋并做好標記；
E. 置恒溫金屬浴中于64。C恒溫反應60分鐘；
(3) 顯色檢測
取出LAMP反應管，冷卻至室溫，2000轉/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性 對照的順序依次分別加入lpL顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
本發明試劑盒特異性強，可廣泛應用于科研，特別是養殖現場的IHHNV的檢測。本發 明檢測方法快速靈敏，較PCR方法有更高的靈敏度，但不需昂貴的PCR儀，降低了成本， 結果檢測方法簡單直觀。
具體實施例方式
以下就實施例來具體解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何限定。 實施例l待檢樣品的DNA提取
(1) 取待檢樣品30mg置于1.5 ml離心管中，加入200/iL組織裂解液，搗爛；室溫裂解30
分鐘；
(2) 用臺式離心機12000轉/分離心5分鐘，取上清，置于1.5ml離心管中；
(3) 加入15pL DNA吸附液(內含白色物質，用前充分搖勻)，室溫放置5分鐘，期間搖 勻3次；(4) 用臺式離心機10000轉/分離心20秒，棄上清液，加入200mL 70%乙醇，上下顛倒混 勻，使沉淀充分重懸起來；
(5) 用臺式離心機10000轉/分離心30秒，棄上清液，將沉淀放置于6(TC的恒溫金屬浴中 烘干5分鐘，離心管蓋打開；
(6) 加入20MLddH20，使用移液器上下吹打混勻，55'C放置5分鐘，然后10000轉/分 離心30秒，上清液即為待檢樣品的DNA。
實施例2傳染性皮下及造血組織壞死病毒的LAMP擴增
(1) 根據待檢測樣品的數目，設置所需LAMP反應管數N， N=樣品數+l管陽性對照+l 管陰性對照；
(2) 吸取LAMP預反應液C的體積為Nx23/zL，加入一潔凈的1.5mL離心管中，然后加入 N/iL5^DNA聚合酶，混合均勻，1500 2000轉/分鐘離心10秒；
(3) 向設定的N個反應管中分別加入24/iL上述混合液，然后在上述每個反應管中再分 別加入30/xL LAMP反應穩定液，2000轉/分鐘離心5秒；
(4) 向上述N個PCR反應管內按順序依次分別加入陰性對照、待檢模板DNA和陽性對照 各l/zL，蓋緊管蓋并做好標記；
(5) 置恒溫金屬浴中于64。C恒溫反應60分鐘。 實施例3顯色檢測
取出LAMP反應管，冷卻至室溫，2000轉/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性 對照的順序依次分別加入lpL顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化；建議在黑色背 景下觀察。 實施例4結果判斷
在陰性對照反應管液體為橙色，陽性對照反應管液體呈綠色的條件下若待檢樣品反應 管液體呈綠色，該樣品結果為IHHNV陽性；若待檢樣品反應管液體呈橙色則表明該樣品
IHHNV檢驗結果為陰性；若陰陽性對照反應管結果與上述情況不符，則本次檢測結果無效，
應重新檢測。一種用于檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的試劑盒及其檢測方法 SEQUENCE LISTING
<110〉中國科學院南海海洋研究所
<120> —種用于檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的試劑盒及其檢測方法
<130〉
<160〉 4
〈170> Patentln version 3. 2
<210〉 1
〈211〉 45
<212> 腿
<213> 人工序列
<柳〉1
gctctctcct ccatcggtag gtttttcgac gacatcagga aagcg 45
<210〉 2
〈211〉 44
<212> DNA
<213〉 人工序列
<210〉 3
<211〉 19
〈212〉 DNA <213〉人工序列
〈400> 3
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<210〉 4
〈211〉 19
〈212〉 腿
〈213〉 人工序列
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〈400〉 4
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權利要求
1.一種用于檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括如下組分(1)組織樣品的基因組DNA提取液；(2)LAMP預反應液；(3)BstDNA聚合酶；(4)LAMP反應穩定液；(5)LAMP反應顯色液；(6)陽性對照DNA；(7)陰性對照DNA。
2. 如權利要求1所述用于檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的試劑盒，其特征在 于所述組分(1)包括組織裂解液和DNA吸附液。
3. 如權利要求1所述用于檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的試劑盒，其特征在 于所述組分(2)包括20 25mMpH為8.8的Tris-HCl、 2 4mM硫酸鎂、10 12mM氯化鉀、 10 12mM硫酸銨、l 1.25%TritonX-100、 400 500#M dNTP、 0.8-L2M甜菜堿、0.8 1//M序 列如SEQ ID NO.l所示的引物IHHNV-FIP、 0.8 lgM序列如SEQ ID N0.2所示的引物 IHHNV-BIP、 0.2~0. M序列如SEQ ID N0.3所示的引物IHHNV-F2、 0.2~0.4/uM序列如SEQ ID N0.4所示的引物IHHNV-B3。
4. 如權利要求1所述用于檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的試劑盒，其特征在 于所述組分(3)為每微升含8個活性單位的SWDNA聚合酶。
5. 如權利要求l所述用于檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的試劑盒，其特征在 于所述組分(4)由礦物油或液體石蠟油組成。
6. 如權利要求l所述用于檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的試劑盒，其特征在 于所述組分(5)為含有10%SYBRGreenI的熒光染料。
7. 如權利要求1所述用于檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的試劑盒，其特征在 于所述組分(6)為含有提取的對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒基因組DNA。
8. 如權利要求1所述用于檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的試劑盒，其特征在 于所述組分(7)為含有提取的健康對蝦基因組DNA。
9. 一種使用權利要求1所述試劑盒檢測IHHNV的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)待檢樣品DNA的提取A. 取待檢樣品置于離心管中，加入組織裂解液，搗爛，室溫裂解；B. 離心取上清，置于離心管中；C. 加入DNA吸附液，室溫放置，期間搖勻；D. 離心，棄上清液，加入70%乙醇，上下顛倒混勻，使沉淀充分重懸起來；E. 離心，棄上清液，將沉淀放置于恒溫金屬浴中烘干，離心管蓋打開；F. 加入ddH20，使用移液器上下吹打混勻，55'C放置，離心，上清液即為待檢樣品的DNA;(2) 傳染性皮下及造血組織壞死病毒的LAMP擴增A. 根據待檢測樣品的數目，設置所需LAMP反應管數；B. 吸取LAMP預反應液，加入一潔凈的離心管中，然后加入勘fDNA聚合酶，混合均勻， 離心，得到混合液；C. 向反應管中分別加入上述混合液，然后在每個反應管中再分別加入LAMP反應穩定 液，離心；D. 向上述反應管內按順序依次分別加入陰性對照DNA、待檢模板DNA和陽性對照DNA;E. 置恒溫金屬浴中于64°C恒溫反應；(3) 顯色檢測取出LAMP反應管，冷卻至室溫，離心，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依 次分別加入顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。
10.如權利要求9所述的檢測方法，其特征在于包括如下步驟 (1)待檢樣品的DNA提取A. 取待檢樣品25 30mg置于1.5 ml離心管中，加入200)wL組織裂解液，搗爛，室溫裂解30分鐘；B. 12000轉/分離心3 5分鐘，取上清，置于1.5ml離心管屮；C. 加入15pLDNA吸附液B，室溫放置5分鐘，期間搖勻3次；D. 10000轉/分離心20秒，棄上清液，加入200/xL 70%乙醇，上下顛倒混勻，使沉淀充分 重懸起來；E. 10000轉/分離心30秒，棄上清液，將沉淀放置于6(TC的恒溫金屬浴中烘千3 5分鐘， 離心管蓋打開；F. 加入20MLddH2(D,使用移液器上下吹打混勻，55'C放置5分鐘，然后10000轉/分離心30 秒，上清液即為待檢樣品的DNA;(2 )傳染性皮下及造血組織壞死病毒的LAMP擴增A. 根據待檢測樣品的數目，設置所需LAMP反應管數N， N=樣品數+l管陽性對照+l管 陰性對照；B. 吸取LAMP預反應液的體積為Nx23pL，加入一潔凈的1.5mL離心管中，然后加入NjuL BWDNA聚合酶，混合均勻，1500 2000轉/分鐘離心10秒；C. 向設定的N個反應管中分別加入24/xL上述混合液，然后在上述每個反應管中再分別 加入30mL LAMP反應穩定液，2000轉/分鐘離心5秒；D. 向上述N個PCR反應管內按順序依次分別加入陰性對照DNA、待檢模板DNA和陽性對 照DNA各l/xL，蓋緊管蓋并做好標記；E. 置恒溫金屬浴中于64。C恒溫反應60分鐘； (3)顯色檢測取出LAMP反應管，冷卻至室溫，2000轉/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性 對照的順序依次分別加入lpL顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。
全文摘要
本發明公開了一種用于檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)的試劑盒。該試劑盒包括待檢樣品DNA提取試劑、LAMP預反應液、Bst DNA聚合酶、LAMP反應穩定液、顯色液、陽性對照DNA和陰性對照DNA。本發明還公開了一種利用上述試劑盒檢測IHHNV的方法。本發明試劑盒特異性強，可廣泛應用于科研，特別是養殖現場的IHHNV的檢測。本發明檢測方法快速靈敏，成本低，不需要PCR儀和電泳儀，可直接用肉眼判定檢測結果。
文檔編號C12Q1/70GK101643793SQ20091004220
公開日2010年2月10日 申請日期2009年8月27日 優先權日2009年8月27日
發明者任春華, 張呂平, 曉 江, 鵬 羅, 胡超群, 哲 趙 申請人:中國科學院南海海洋研究所