專利名稱：一種用于檢測對蝦白斑綜合癥病毒的試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及病毒檢測領域，具體涉及一種利用環介導等溫擴增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技術檢測對蝦白斑綜合癥病毒的試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
對蟲下白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV)是迄今為止危害最為嚴重的一種對蝦病毒，能導致養殖對蝦大規模的暴發性死亡；其感染的宿主范圍非常廣，包括凡納濱對蝦、斑節對蝦、中國對蝦、日本對蝦以及長毛對蝦等多種養殖品種，給養蝦業造成了巨大的經濟損失。由于其強烈的傳染性和極高的致死率，使得人們在應對它時，必須側重于早期的防控；國際獸醫局(OIE)、聯合國糧農組織(FAO)及亞太地區水產養殖發展網絡中心(NACA)規定需要報告的重要水生動物疾病病原之一。雖然目前已對WSSV的病原學、分子生物學以及致病機理開展了深入研究，但是對其所引起疾病尚無有效的治療方法，只能以預防為主，而這又主要依賴于早期快速的診斷和篩查。
目前對于WSSV的檢測方法主要包括臨床組織病理學方法、電子顯微觀察技術、生物指示法、酶聯免疫吸附等免疫學方法以及應用PCR技術等分子生物學方法。但是現有的這些方法都存在一定的不足，有些對技術條件要求高、檢測時間長；有些所需要的材料制備麻煩，費用高；有些靈敏度不高、特異性不強；PCR技術雖然敏感、準確、快速，但由于需要昂貴的儀器設備、較高檢測費用以及對檢測人員較高的技術要求而使其不適用于現場快速檢測及基層普及應用。 LAMP是一種新型的核酸等溫擴增技術。該技術針對靶基因的6個區域設計4條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件下即可完成核酸擴增反應，擴增出LAMP特征性梯狀條帶。LAMP技術在保持PCR技術優點的基礎上，進一步增強了反應的特異性和縮短了檢測時間；特別是它不需使用昂貴的熱循環儀，在等溫條件下就能完成反應，且擴增產物用肉眼能觀察，可用于病原微生物的現場快速檢測。但是在實際應用中，由于特異性引物設計和其檢測試劑盒研制的復雜性，導致LAMP技術還未能推廣于醫療衛生、食品等領域。
發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種用于檢測WSSV的試劑盒。該試劑盒特異性強，敏感性高，準確快速。 本發明另一 目的在于提供一種利用上述試劑盒檢測WSSV的方法。該方法方便靈敏快速，增強了反應的特異性。 本發明上述目的通過以下技術方案予以實現
本發明用于檢測WSSV的試劑盒包括如下組分[OOO9] (1)組織樣品的基因組DNA提取液；
(2)LAMP預反應液；
(3)Bst DNA聚合酶；
(4)LAMP反應穩定液；
(5)LAMP反應顯色液；
(6)陽性對照DNA
(7)陰性對照DNA。 其中，所述組分(1)包括組織裂解液和DNA吸附液；組織裂解液為含有4 6M 異硫氰酸胍(GTC)、 20 25mM檸檬酸鈉、0.5 %十二烷基肌氨酸鈉和0.1 0.2MP -巰 基乙醇；DNA吸附液為含50%磁珠的懸浮液。所述組分(2)包括20 25mM pH為8.8的Tris-HCl、 2 4mM硫酸鎂、10
12mM氯化鉀、10 12mM硫酸銨、1 1.25% TritonX-lOO、 400 500 ii M dNTP、 0.8
1.2M甜菜堿、0.8 liiM序列如SEQIDNO.l所示的引物WSSV-FIP、 0.8 1 y M序列
如SEQ ID N0.2所示的引物WSSV-BIP、 0.2 0.4y M序列如SEQ ID N0.3所示的引物
WSSV-F3、 0.2 0.4 ii M序列如SEQ ID N0.4所示的引物WSSV-B3。 所述組分(3)為每微升含8個活性單位的Bst DNA聚合酶。 所述組分(4)由礦物油或液體石蠟油組成。所述組分(5)為含有10 % SYBR Green I的熒光染料。 所述組分(6)為含有提取的WSSV病毒基因組DNA。 所述組分(7)為含有提取的健康對蝦基因組DNA。 本發明試劑盒的主要原理為①設計一組能特異識別靶DNA的六個不同序列的 兩個內引物(上游內引物和下游內引物)和兩個外引物(上游外弓I物和下游外引物)，內引 物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；②其中一個內引物首先與靶DNA雜交，隨后的鏈置 換DNA合成，在具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下，由一個外引物啟動，釋 放出單鏈DNA，并作為由雜交到靶的另一端的一個內引物和一個外引物啟動的DNA合成 的模板，產生一個原始的莖環DNA;③內引物以原始的莖環DNA為模板，啟動鏈置換 DNA的合成，產生一個原始的莖環DNA和一個新的有兩倍莖長度的莖環DNA; 在等 溫條件下，內引物以莖環DNA為模板，通過鏈置換形成多個含有靶DNA反復重復序列 的莖環DNA，在一小時內該循環反應可使靶DNA累積到l()g拷貝，最后通過加入熒光染 料來觀察擴增結果。 利用本發明試劑盒檢測WSSV的方法包括如下步驟
(1)待檢樣品DNA的提取 A.取待檢樣品置于離心管中，加入組織裂解液，搗爛，室溫裂解； B.離心取上清，置于離心管中； C.加入DNA吸附液，室溫放置，期間搖勻； D.離心，棄上清液，加入70%乙醇，上下顛倒混勻，使沉淀充分重懸起來； E.離心，棄上清液，將沉淀放置于恒溫金屬浴中烘干，離心管蓋打開； FjBAddH20，使用移液器上下吹打混勻，55t:放置，離心，上清液即為待檢樣
品的DNA; (2)對蝦白斑綜合癥病毒的LAMP擴增 A.根據待檢測樣品的數目，設置所需LAMP反應管數；
B.吸取LAMP預反應液，加入一潔凈的離心管中，然后加入Bst DNA聚合酶， 混合均勻，離心，得到混合液； C.向反應管中分別加入上述混合液，然后在每個反應管中再分別加入LAMP反 應穩定液，離心； D.向上述反應管內按順序依次分別加入陰性對照DNA、待檢模板DNA和陽性對 照DNA ; E.置恒溫金屬浴中于6rC恒溫反應；
(3)顯色檢測 取出LAMP反應管，冷卻至室溫，離心，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照 的順序依次分別加入顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。
利用本發明試劑盒檢測WSSV的方法優選為
(1)待檢樣品的DNA提取 A.取待檢樣品25 30mg置于1.5mL離心管中，加入200 y L組織裂解液，搗 爛，室溫裂解30分鐘； B.12000轉/分離心3 5分鐘，取上清，置于1.5mL離心管中； C.加入15 ii L DNA吸附液B，室溫放置5分鐘，期間搖勻3次； D.10000轉/分離心20秒，棄上清液，加入200 ii L 70%乙醇，上下顛倒混勻，
使沉淀充分重懸起來； E.10000轉/分離心30秒，棄上清液，將沉淀放置于60°C的恒溫金屬浴中烘干 3 5分鐘，離心管蓋打開； R加入20 ii L ddH20，使用移液器上下吹打混勻，55"放置5分鐘，然后10000 轉/分離心30秒，上清液即為待檢樣品的DNA;
(2)對蝦白斑綜合癥病毒的LAMP擴增 A.根據待檢測樣品的數目，設置所需LAMP反應管數N， N二樣品數+l管陽性 對照+l管陰性對照；B.吸取LAMP預反應液的體積為NX23iiL，加入一潔凈的1.5mL離心管中，然 后加入Nii L Bst DNA聚合酶，混合均勻，1500 2000轉/分鐘離心10秒；
C.向設定的N個反應管中分別加入24iiL上述混合液，然后在上述每個反應管 中再分別加入30 ii L LAMP反應穩定液，2000轉/分鐘離心5秒； D.向上述N個PCR反應管內按順序依次分別加入陰性對照DNA、待檢模板DNA 和陽性對照DNA各1 y L，蓋緊管蓋并做好標記；
E.置恒溫金屬浴中于6rC恒溫反應60分鐘；
(3)顯色檢測 取出LAMP反應管，冷卻至室溫，2000轉/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待 檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入1 P L顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變 化。 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果 本發明試劑盒特異性強，可廣泛應用于科研，特別是養殖現場的WSSV的檢 測。本發明檢測方法快速靈敏，較PCR方法有更高的靈敏度，但不需昂貴的PCR儀，降
6低了成本，結果檢測方法簡單直觀。
具體實施例方式以下就實施例來具體解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何限定。
實施例1待檢樣品的DNA提取 (1)取待檢樣品30mg置于1.5mL離心管中，加入200 y L組織裂解液，搗爛；室 溫裂解30分鐘； (2)用臺式離心機12000轉/分離心5分鐘，取上清，置于1.5mL離心管中；
(3)加入15iiLDNA吸附液(內含白色物質，用前充分搖勻)，室溫放置5分鐘， 期間搖勻3次； (4)用臺式離心機10000轉/分離心20秒，棄上清液，加入200 ii L 70%乙醇， 上下顛倒混勻，使沉淀充分重懸起來； (5)用臺式離心機10000轉/分離心30秒，棄上清液，將沉淀放置于60°C的恒溫 金屬浴中烘干5分鐘，離心管蓋打開； (6)加入20iiLddH20，使用移液器上下吹打混勻，55。C放置5分鐘，然后10000 轉/分離心30秒，上清液即為待檢樣品的DNA。
實施例2對蟲下白斑綜合癥病毒的LAMP擴增 (l)根據待檢測樣品的數目，設置所需LAMP反應管數N， N二樣品數+l管陽 性對照+l管陰性對照； (2)吸取LAMP預反應液的體積為NX 23 ii L，加入一潔凈的1.5mL離心管中， 然后加入NiiLBstDNA聚合酶，混合均勻，1500 2000轉/分鐘離心10秒；
(3)向設定的N個反應管中分別加入24 ii L上述混合液，然后在上述每個反應管 中再分別加入30 ii L LAMP反應穩定液，2000轉/分鐘離心5秒； (4)向上述N個PCR反應管內按順序依次分別加入陰性對照DNA、待檢模板 DNA和陽性對照DNA各1 y L，蓋緊管蓋并做好標記；
(5)置恒溫金屬浴中于6rC恒溫反應60分鐘。
實施例3顯色檢測 取出LAMP反應管，冷卻至室溫，2000轉/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待 檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入1 P L顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變 化；建議在黑色背景下觀察。
實施例4結果判斷 在陰性對照反應管液體為橙色，陽性對照反應管液體呈綠色的條件下若待檢 樣品反應管液體呈綠色，該樣品結果為WSSV陽性；若待檢樣品反應管液體呈橙色則表 明該樣品WSSV檢驗結果為陰性；若陰陽性對照反應管結果與上述情況不符，則本次檢 測結果無效，應重新檢測。 —種用于檢測對蝦白斑綜合癥病毒的試劑盒及其檢測方法 SEQUENCE LISTING <110>中國科學院南海海洋研究所 <120> —種用于檢測對蟲下白斑綜合癥病毒的試劑盒及其檢測方法
7
<130><160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>1tcagcgtcag ttttgcgtgt tttccctcta ccagaataag tec 43
<210>2<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>2cgtttcgcaa taatgggaga ggttttgaaa gtatccctac gaccac
<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>3cgttggctgt tttacacc18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>4tatggcggtt aacaccac18
權利要求
一種用于檢測對蝦白斑綜合癥病毒的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括如下組分(1)組織樣品的基因組DNA提取液；(2)LAMP預反應液；(3)Bst DNA聚合酶；(4)LAMP反應穩定液；(5)LAMP反應顯色液；(6)陽性對照DNA；(7)陰性對照DNA。
2. 如權利要求1所述用于檢測對蝦白斑綜合癥病毒的試劑盒，其特征在于所述組分(1) 包括組織裂解液和DNA吸附液。
3. 如權利要求1所述用于檢測對蝦白斑綜合癥病毒的試劑盒，其特征在于所述組分(2) 包括20 25mMpH為8.8的Tris-HCl、 2 4mM硫酸鎂、10 12mM氯化鉀、10 12mM硫酸銨、1 1.25% TritonX-lOO、 400 500 y M dNTP、 0.8 1.2M甜菜堿、0.8 1 y M序列如SEQ ID NO.l所示的引物WSSV-FIP、 0.8 1 y M序列如SEQ ID N0.2所示的引物WSSV-BIP、 0.2 0.4iiM序列如SEQ ID N0.3所示的引物WSSV-F3、 0.2 0.4 ii M序列如SEQ ID N0.4所示的引物WSSV-B3。
4. 如權利要求1所述用于檢測對蝦白斑綜合癥病毒的試劑盒，其特征在于所述組分(3) 為每微升含8個活性單位的Bst DNA聚合酶。
5. 如權利要求1所述用于檢測對蝦白斑綜合癥病毒的試劑盒，其特征在于所述組分(4) 由礦物油或液體石蠟油組成。
6. 如權利要求1所述用于檢測對蝦白斑綜合癥病毒的試劑盒，其特征在于所述組分(5) 為含有10% SYBR Green I的熒光染料。
7. 如權利要求1所述用于檢測對蝦白斑綜合癥病毒的試劑盒，其特征在于所述組分(6) 為含有提取的對蝦白斑綜合癥病毒基因組DNA。
8. 如權利要求1所述用于檢測對蝦白斑綜合癥病毒的試劑盒，其特征在于所述組分(7) 為含有提取的健康對蝦基因組DNA。
9. 一種使用權利要求1所述試劑盒檢測對蝦白斑綜合癥病毒的方法，其特征在于包括如下步驟(1) 待檢樣品DNA的提取A. 取待檢樣品置于離心管中，加入組織裂解液，搗爛，室溫裂解；B. 離心取上清，置于離心管中；C. 加入DNA吸附液，室溫放置，期間搖勻；D. 離心，棄上清液，加入70%乙醇，上下顛倒混勻，使沉淀充分重懸起來；E. 離心，棄上清液，將沉淀放置于恒溫金屬浴中烘干，離心管蓋打開；FjnAddH20，使用移液器上下吹打混勻，55t:放置，離心，上清液即為待檢樣品的DNA ;(2) 對蝦白斑綜合癥病毒的LAMP擴增A.根據待檢測樣品的數目，設置所需LAMP反應管數；B. 吸取LAMP預反應液，加入一潔凈的離心管中，然后加入BstDNA聚合酶，混合均勻，離心，得到混合液；C. 向反應管中分別加入上述混合液，然后在每個反應管中再分別加入LAMP反應穩定液，離心；D. 向上述反應管內按順序依次分別加入陰性對照DNA、待檢模板DNA和陽性對照DNA ;e.置恒溫金屬浴中于6rc恒溫反應；(3)顯色檢測取出LAMP反應管，冷卻至室溫，離心，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。
10.如權利要求9所述的檢測方法，其特征在于包括如下步驟(1) 待檢樣品的DNA提取A. 取待檢樣品25 30mg置于1.5ml離心管中，加入200 y L組織裂解液，搗爛，室溫裂解30分鐘；B. 12000轉/分離心3 5分鐘，取上清，置于1.5ml離心管中；C. 加入15 ii L DNA吸附液B，室溫放置5分鐘，期間搖勻3次；D. 10000轉/分離心20秒，棄上清液，加入200iiL 70%乙醇，上下顛倒混勻，使沉淀充分重懸起來；E. 10000轉/分離心30秒，棄上清液，將沉淀放置于6(TC的恒溫金屬浴中烘干3 5分鐘，離心管蓋打開；F. 加入20 ii L ddH20，使用移液器上下吹打混勻，55t:放置5分鐘，然后10000轉/分離心30秒，上清液即為待檢樣品的DNA;(2) 對蝦白斑綜合癥病毒的LAMP擴增A. 根據待檢測樣品的數目，設置所需LAMP反應管數N， N二樣品數+l管陽性對照+1管陰性對照；B. 吸取LAMP預反應液的體積為NX23iiL，加入一潔凈的1.5mL離心管中，然后加入N y L Bst DNA聚合酶，混合均勻，1500 2000轉/分鐘離心10秒；C. 向設定的N個反應管中分別加入24iiL上述混合液，然后在上述每個反應管中再分別加入30 ii L LAMP反應穩定液，2000轉/分鐘離心5秒；D. 向上述N個PCR反應管內按順序依次分別加入陰性對照DNA、待檢模板DNA和陽性對照DNA各1 y L，蓋緊管蓋并做好標記；E. 置恒溫金屬浴中于6rC恒溫反應60分鐘；(3) 顯色檢測取出LAMP反應管，冷卻至室溫，2000轉/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入1 p L顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。
全文摘要
本發明公開了一種用于檢測對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的試劑盒。該試劑盒包括待檢樣品DNA提取試劑、LAMP預反應液、Bst DNA聚合酶、LAMP反應穩定液、顯色液、陽性對照DNA和陰性對照DNA。本發明還公開了一種利用上述試劑盒檢測WSSV的方法。本發明試劑盒特異性強，可廣泛應用于科研及養殖現場的WSSV的檢測。本發明檢測方法成本低，快速靈敏，可直接用肉眼判定檢測結果。
文檔編號C12Q1/68GK101691615SQ20091004220
公開日2010年4月7日 申請日期2009年8月27日 優先權日2009年8月27日
發明者任春華, 張呂平, 江曉, 羅鵬, 胡超群, 趙哲 申請人:中國科學院南海海洋研究所