有毒甲藻規模化生產的采收方法

專利名稱：有毒甲藻規模化生產的采收方法
技術領域：
本發明涉及藻類采收領域，具體涉及一種有毒甲藻規模化生產的采收方法。
背景技術：
海洋甲藻(dinoflagellate)，又稱海洋雙鞭藻，是主要的海洋赤潮生物之 一，甲藻產生的有毒次生代謝產物，又稱甲藻毒素。研究表明，甲藻毒素在開 發抗癌、鎮痛、麻醉、抗病毒、抗菌等各種治療藥以及作為癌癥等藥理研究工 具藥方面有著非常廣闊的應用前景。
由于自然環境中有毒甲藻的細胞密度非常低，因而毒素原材料的來源困難 制約了毒素的進一步深入研究和應用，目前國際市場上毒素種類較少，價格昂 貴。甲藻毒素的分子量往往較大，很難進行仿生有機合成，因此從天然環境中 分離有毒甲藻獲得純系進行高密度高毒性的規模化培養，收集有毒甲藻藻泥用 于分離提取各種毒素成為目前最為常用的途徑。
在有毒甲藻的規模化生產過程中，安全高效完整地采收甲藻細胞，防止 細胞破裂造成內容物外泄，是分離提取各種毒素的前提和保證。
有毒甲藻為單細胞，個體大小通常在幾十微米，最小的只有幾微米，絕大 多數種類具有由許多小甲片組成的細胞壁，其生活方式為游動的單細胞或由單 細胞連成各種形狀的群體。海洋中能產生毒素的甲藻約有45-60種，但迄今能 夠實現人工規模化培養的只有寥寥數種。甲藻的種類不同，生活方式不同，采 收方法也不同。中國專利200510034502提供了一種單細胞藻類的采收方法，該方法是收 集單細胞藻類的培養原液并進行粗濾，利用超濾濃縮設備循環過濾，得到所需 濃度的單細胞藻類濃縮劑，濃縮后液再進行常規處理，該方法雖然可以實現單 細胞藻類的采收，但是過濾步驟復雜，對多個工藝條件需要控制，而且采收過 程中需要過濾器等儀器，還需要清洗過濾器。
本發明人之前申請的中國專利03146858給出單細胞有毒甲藻的一個種類 "^4wp/2z^m^m A:/eZw7的純禾中分離途徑，其中提到用對」wp/2zViz>7/ww Hefo"的 采集方法是先向藻液中加入濃度為0.2~0.35質量％。的絮凝劑 [KA1(S04)2 12H20],甲藻細胞沉淀后通過逐級濃縮再用濾膜過濾多余水分 收集藻泥。
本發明通過繼續研究發現，雖然上述利用絮凝劑沉淀單細胞生活的有毒甲 藻，用濾膜過濾收集得到藻泥用于提取各種毒素，不失為一種有效的方法，但 由于有毒甲藻不同的種類細胞大小不同，活動能力不同，所需的絮凝劑用量也 不同，若絮凝劑用量過小則甲藻細胞不能沉淀或不能完全沉淀，而用量過大則 容易造成細胞破裂內容物外泄，既污染環境又達不到提取毒素的目的；而且， 逐級濃縮后濾膜過濾收集藻泥只適用于水體較小的室內養殖，當養殖規模較大 時濾膜容易堵塞，需要經常收集清理就顯得既費時費力又麻煩。

發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種適合于大規模產業化生 產的，可用于采收多種單細胞甲藻種類，且規模化生產過程中能保證安全、高 效、無細胞破損的有毒甲藻的采收方法。
本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的本發明人通過對有毒甲藻規模化生產的采收方法進行試驗摸索，結果發現 將絮凝劑的使用和離心方法結合起來，可實現發明目的，絮凝劑的加入能夠沉 淀單細胞生活的有毒甲藻細胞，然后再采用離心方法則可以獲得藻泥。絮凝劑 和離心方法的結合既可以避免單獨使用絮凝劑易導致用量過大，細胞破裂造成 內容物甲藻毒素外泄的問題，又解決了規模化生產中單獨使用離心法收集的高 投資高能耗問題，而且離心方法的運用實現了規模化生產時大批量的采收。
本發明的有毒甲藻規模化生產的采收方法，其包括如下步驟
(1) 向有毒甲藻藻液中加入絮凝劑KA1(S04)2 '12H20至KA1(S04)2 '121120 的終濃度為0.2~0.35%。；
(2) 靜置1 2小時后，除去上清水體，收集沉淀液；
(3) 將上述沉淀液離心后，棄去上清液，底部沉淀即為所需藻泥，收集該 藻泥保存即可。
上述步驟(1)中，有毒甲藻的收集一般選擇在甲藻生長至收獲期時進行。
上述步驟(1)中，向藻液中加入絮凝劑的時候，可以邊加邊攪拌，使藻 細胞充分絮凝沉淀。
上述步驟(2)中，將加有絮凝劑的有毒甲藻藻液靜置，在靜置過程中可 用顯微鏡鏡檢上層水體，當上層水體中基本無甲藻細胞檢出時，排去上清水體， 收集沉淀液；如有必要還可以重復步驟(2)。
上述步驟(3)中，離心的作用是對沉淀液的純化，實際操作時可采用 2000 3000r/min的轉速，離心10~15分鐘，離心后收集底部的沉淀物，即有 毒甲藻的細胞，將沉淀物放入冰箱凍存備用。
本發明中對絮凝劑終濃度采用％。單位表示，該單位是"質量體積千分比濃度"，即每1000ml水體中含KA1(S04)2 12H20的質量數，如0.2%0的KA1(S 04)2 12H20，就表示1000 ml水體中含0.2g的KA1(S04)2 12H20。
本發明人針對不同的有毒甲藻種類的細胞大小不同，活動能力不同，對絮 凝劑的要求用量也不同的問題，還進一步地針對有毒甲藻常見的幾個種類進行 了絮凝劑用量的研究，在上述絮凝劑KA1(S04)2 12H20的0.2~0.35%。的用量 范圍內，提供更有針對性的用量，從而使得有毒甲藻取得更好的采收效果。
當有毒甲藻為單庫里亞藻(Coo//a mo朋泡)時，KA1(S04)2 12H20的 用量為0.3 0.35%。；
當有毒甲藻為利瑪原甲藻(praracewrWm //ma)時，KA1(S04)2 12H20 的用量為0.2~0.25%。；
當有毒甲藻為慢原甲藻(尸rarace"fram r/w^ym"w)時，KA1(S04)2 '121120 的用量為0.2~0.25%。；
當有毒甲藻為卡氏前溝藻(也可以稱為強壯前溝藻，p/zWm^m caWerae)時，KA1(S04)2 12H20的用量為0.25 0.3%。；
當有毒甲藻為克氏前溝藻"m;^Wm'ww A:/eZw7)時，KA1(S04)2 12H20 的用量為0.2~0.25%。。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
1. 本發明采用絮凝劑和離心兩種方法的結合，不但解決了現有技術無法 規模化生產的問題，而且能夠實現安全、高效、無細胞破碎；
2. 有毒甲藻種類不同，其細胞大小不同，活動能力不同，本發明針對不 同種類有毒甲藻，提供恰當合適的絮凝劑用量沉淀甲藻細胞，從而避免了絮凝 劑用量過多細胞會破裂，其內容物甲藻毒素外泄，污染環境的問題，而且也不會出現絮凝劑用量過少，甲藻細胞沉淀不下來的問題；
3. 本發明采用絮凝劑和離心相結合的方法，既可以避免單獨使用絮凝劑易
導致用量過大，細胞破裂造成內容物甲藻毒素外泄的問題，又解決了規模化生
產中單獨使用離心法收集的高投資高能耗問題，節約成本；
4. 采用本發明的方法可獲得充足的藻泥作為原材料制取甲藻毒素；
5. 本發明只需要通過簡單加入絮凝劑就可以實現藻類細胞的沉淀，無需大 型儀器和繁復的工藝控制，成本低廉，操作簡單；
6. 本發明在絮凝劑沉淀藻類細胞后，選擇離心的方法來進一步純化得到藻 泥，離心能提高大規模生產時的純化速度，而且能實現大規模生產時對大量沉 淀液的純化，而這兩點是過濾方法無法實現的，絮凝劑和離心兩種方法的結合 最終得到大量且細胞完整無破損的藻泥，從而達到提取活性次生代謝產物(甲 藻毒素)的目的。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步的描述，但具體實施例并不對本發
明做任何限定。
實施例1 有毒甲藻Ow//a m朋d's的采收 本實施例有毒甲藻Coo/z'a mo"o^的采收，其具體步驟如下 (1 )待培養水體中有毒甲藻Coo/z'amo"o他生長至收獲期，在藻液中加入
絮凝劑KA1(S04)2 12H20至KA1(S04)2 12H20的終濃度為0.3質量％。，邊
加邊攪拌，使藻細胞大量沉淀；
(2)靜置2小時，顯微鏡鏡檢，上層水體基本無甲藻細胞檢出，排去上清
水體，收集沉淀液；(3) 將上述沉淀液以轉速2000r/min的離心速度，離心15分鐘，棄去上 清液，底部沉淀即為本實施例所需藻泥，收集藻泥置冰箱冷凍備用。
(4) 對比試驗KA1(S04)2 12H20的終濃度低于0.3%。時，顯微鏡下可在 上層水體中檢出零星細胞，終濃度為0.3 0.35%。時基本無細胞檢出，KAl(SO 4)2 *12H20的終濃度為1.0%。時有變形細胞，終濃度至2.5%。時發現有細胞破碎， 基于成本節約、絮凝劑水體殘留最低以及細胞完整度等綜合因素考慮，選擇O. 3 0.35%。為KA1(S04)2 12H20的終濃度。
甲藻細胞具有細胞壁，為定形細胞，細胞變形意味著內容物有外泄，細 胞是否變形、破裂在顯微鏡下可直接觀察到，由此可判斷收集的藻泥其細胞是 否完整無破裂。
實施例2 有毒甲藻7Vwvce"加'Mm //iwa的采收 本實施例有毒甲藻尸rorace"化/wm //ma的采收，其具體步驟如下
(1) 待培養水體中有毒甲藻/Vorace"Wwm /z7wa生長至收獲期，在藻液中 加入絮凝劑KA1(S04)2 12H20至KA1(S04)2 12H20的終濃度為0.2%。，邊加 邊攪拌，使藻細胞大量沉淀；
(2) 靜置1小時，顯微鏡鏡檢，上層水體基本無甲藻細胞檢出，排去上清 水體，收集沉淀液；
(3) 將上述沉淀液以轉速2000r/min的離心速度，離心10分鐘，棄去上 清液，底部沉淀即為本實施例所需藻泥，收集藻泥置冰箱冷凍備用。
(4) 對比試驗KA1(S04)2 12H20的終濃度低于0.2%。時，顯微鏡下可在 上層水體中檢出零星細胞，終濃度為0.2 0.25%。時基本無細胞檢出， KA1(S04)2 12H20的終濃度為0.8%。時有變形細胞，終濃度為1.5%。時發現有細胞破碎，基于成本節約、絮凝劑水體殘留最低以及細胞完整度等綜合因素考
慮，選擇0.2 0.25%。為KA1(S04)2 12H20的終濃度。
實施例3 有毒甲藻戶/wvce"fr"附尸/rfl幼戸"附的采收
本實施例有毒甲藻尸rarace^n/m Aaf/^mwm的采收，其具體步驟如下
(1) 待培養水體中有毒甲藻尸rarace^n/w Aa^ymwm生長至收獲期，在藻 液中加入絮凝劑KA1(S04)2 12H20至KA1(S04)2 12H20的終濃度為0.25%。， 邊加邊攪拌，使藻細胞大量沉淀；
(2) 靜置2小時，顯微鏡鏡檢，上層水體基本無甲藻細胞檢出，排去上清 水體，收集沉淀液；
(3) 將上述沉淀液以轉速2000r/min的離心速度，離心15分鐘，棄去上 清液，底部沉淀即為本實施例所需藻泥，收集藻泥置冰箱冷凍備用。
(4) 對比試驗KA1(S04)2 12H20的終濃度低于0.20%。時，顯微鏡下可 在上層水體中檢出零星細胞，終濃度為0.20 0.25%。時基本無細胞檢出， KA1(S04)2 12H20的終濃度為0.8%。時有變形細胞，終濃度為1.5%。時發現有 細胞破碎，基于成本節約、絮凝劑水體殘留最低以及細胞完整度等綜合因素考 慮，選擇0.2 0.25%。為KA1(S04)2 12H20的終濃度。
實施例4 有毒甲藻Jm/;/wV/i'"/ m cflWeme的采收 本實施例有毒甲藻Jwp/z^m'wm 的采收，其具體步驟如下
(1) 待培養水體中有毒甲藻4w/ /7^z'm'ww caWerae生長至收獲期，在藻液 中加入絮凝劑KA1(S04)2 12H20至KA1(S04)2 12H20的終濃度為0.3質量 %。，邊加邊攪拌，使藻細胞大量沉淀；
(2) 靜置1小時，顯微鏡鏡檢，上層水體基本無甲藻細胞檢出，排去上清水體，收集沉淀液；
(3) 將上述沉淀液以轉速3000r/min的離心速度，離心15分鐘，棄去上 清液，底部沉淀即為本實施例所需藻泥，收集藻泥置冰箱冷凍備用。
(4) 對比試驗KA1(S04)2 12H20的終濃度低于0.3%。時，顯微鏡下可在 上層水體中檢出零星細胞，終濃度為0.3 0.35%。時基本無細胞檢出， KA1(S04)2 12H20的終濃度為1.2%。時有變形細胞，終濃度為2.5%。時發現有 細胞破碎，基于成本節約、絮凝劑水體殘留最低以及細胞完整度等綜合因素考 慮，選擇0.3 0.35%。為KA1(S04)2 12H20的終濃度。
實施例5 有毒甲藻Xm/7/t/力'"/"m A/e6w7的采收 本實施例有毒甲藻^m/ /z^m'Mm Wefoz7的采收，其具體步驟如下
(1) 待培養水體中有毒甲藻^附; /2^"/"附^^^7生長至收獲期，在藻液中 加入絮凝劑KA1(S04)2 12H20至KA1(S04)2 12H20的終濃度為0.2質量％。， 邊加邊攪拌，使藻細胞大量沉淀；
(2) 靜置2小時，顯微鏡鏡檢，上層水體基本無甲藻細胞檢出，排去上清 水體，收集沉淀液；
(3) 將上述沉淀液以轉速3000r/min的離心速度，離心10分鐘，棄去上 清液，底部沉淀即為本實施例所需藻泥，收集藻泥置冰箱冷凍備用。
(4) 對比試驗KA1(S04)2 12H20的終濃度低于0.2%。時，顯微鏡下可在 上層水體中檢出零星細胞，終濃度為0.2 0.25%。時基本無細胞檢出， KA1(S04)2 12H20的終濃度為1.0%。時有變形細胞，終濃度為2.0%。時發現有 細胞破碎，基于成本節約、絮凝劑水體殘留最低以及細胞完整度等綜合因素考 慮，選擇0.2 0.25%。為KA1(S04)2 12H20的終濃度。實施例6收集方法對比試驗
本實施例針對兩種收集方法進行比較， 一種是絮凝劑+過濾，另一種是絮
凝劑+離心，其具體步驟如下
(1) 絮凝劑+過濾
a. 在藻液中加入KA1(S04)2 12H20至終濃度為0.2%。，邊加邊攪拌；
b. 用膠管抽去上清水體，收集沉淀于器皿中并逐級濃縮； C.把沉淀的部份倒入分液漏斗中靜置；
d. 放出分液漏斗中的下層沉淀至孔徑為400目的篩絹濾網上，濾去多余 的水分；
e. 用藥勺刮取篩絹上的藻泥至收集瓶中放置冰箱中凍存。
(2) 絮凝劑+離心
a. 在藻液中加入KA1(S04)2 12H20至終濃度為0.2%。，邊加邊攪拌；
b. 靜置2小時，顯微鏡鏡檢，上層水體基本無甲藻細胞檢出，排去上清 水體，收集沉淀液；
c. 將上述沉淀液以轉速2000r / min的離心速度，離心10分鐘，棄去上清 液，收集底部沉淀藻泥置冰箱冷凍備用。
從上述兩個方法的步驟可以看出，"絮凝劑+過濾"方法與"絮凝劑+離心" 方法相比，操作繁瑣，費時費力， 一是使用篩絹過濾速度慢，二是篩絹網孔容 易堵塞，難以濾清大量水分，三是篩絹上藻泥不易刮取干凈，四是過濾過程中 篩絹需經常清洗，因此不適合用于大規模生產。
權利要求
1、一種有毒甲藻規模化生產的采收方法，其特征在于該方法采用絮凝劑KA1(SO4)2·12H2O沉淀有毒甲藻細胞，對沉淀液進行離心，收集離心沉淀物即得到有毒甲藻藻體。
2、 根據權利要求1所述方法，其特征在于所述絮凝劑KA1(S04)2 12H20 的用量為每1000ml水體中含0.2~0.35g的KA1(S04)2 12H20。
3、 根據權利要求2所述方法，其特征在于，當有毒甲藻為單庫里亞藻時， 絮凝劑KA1(S04)2 12H20的用量為每lOOOml水體中含0.3~0.35g的 KA1(S04)2 12H20。
4、 根據權利要求2所述方法，其特征在于，當有毒甲藻為利瑪原甲藻時， 其絮凝劑KA1(S04)2 12H20的用量為每lOOOml水體中含0.2 0.25g的 KA1(S04)2 12H20。
5、 根據權利要求2所述方法，其特征在于，當有毒甲藻為慢原甲藻時， 其絮凝劑KA1(S04)2 12H20的用量為每lOOOml水體中含0.2~0.25g的 KA1(S04)2 12H20。
6、 根據權利要求2所述方法，其特征在于，當有毒甲藻為卡氏前溝藻時， 其絮凝劑KA1(S04)2 12H20的用量為每lOOOml水體中含0.25 0.3g的 KA1(S04)2 12H2。。
7、 根據權利要求2所述方法，其特征在于，當有毒甲藻為克氏前溝藻時， 其絮凝劑KA1(S04)2 12H20的用量為每lOOOml水體中含0.2~0.25g的 KA1(S04)2 12H20。
8、 根據權利要求1所述方法，其特征在于該方法包括如下歩驟(1)向有毒甲藻藻液中加入絮凝劑KA1(S04)2 12H20;(2) 靜置1 2小時后，除去上清水體，收集沉淀液；(3) 將上述沉淀液離心后，棄去上清液，收集底部沉淀物。
9、根據權利要求8所述方法，其特征在于，所述步驟(3)中離心的轉速 為200(K3000r / min，時間為10 15分鐘。
全文摘要
本發明公開一種有毒甲藻規模化生產的采收方法，該方法采用絮凝劑KAl(SO₄)₂·12H₂O沉淀有毒甲藻細胞，通過離心收集得到有毒甲藻藻體。本發明對不同種類有毒甲藻提供恰當合適的絮凝劑用量，并結合離心方法，可避免絮凝劑用量過大，細胞破裂內容物毒素外泄，也可避免絮凝劑用量過少細胞沉淀不下來，還可以避免單獨使用離心法收集的高投資高能耗問題。本發明采用絮凝劑沉淀甲藻細胞后，選擇離心的方法來進一步純化得到藻泥，離心能提高大規模生產時候的純化速度，而且能實現大規模生產時對大量沉淀液的純化。本發明方法可實現安全、高效、大量且細胞完整無破損地采收有毒甲藻，從而達到提取活性次生代謝產物甲藻毒素的目的。
文檔編號C12N1/12GK101586079SQ200910040408
公開日2009年11月25日 申請日期2009年6月19日 優先權日2009年6月19日
發明者何偉宏, 軍 吳, 偲 張, 李慶欣, 梁計林, 龍麗娟 申請人:中國科學院南海海洋研究所