專利名稱：：軍團菌選擇性分離培養基的制作方法
技術領域：
：這種發明涉及一種培養基，具體是一種適合對環境和臨床標本中軍團菌的分離培養，可減少雜菌污染、提高軍團菌分離培養陽性率的軍團菌選擇性分離培養基。
背景技術：
：目前，國內外公認的軍團菌分離培養基是法國生物梅里埃(bioM6rieux)、英國OXOID、美國BD、DIFCO公司等生產的BCYEot-CCVC、BCYEa-GVPC和BCYEa-GPVA等[1，這些培養基大多價格昂貴(1825元/1個平皿)，在醫院臨床和衛生防疫部門大量應用時，檢測成本高。且對軍團菌分離培養陽性率由一般為35.1%—5.0%[2.3],陽性率比較低。因此現有的軍團菌分離培養基不利于臨床和衛生防疫部門推廣應用。
發明內容本發明的目的是針對以上所述軍團菌分離培養基存在的不足，提供一種成本低、分離培養陽性率偏高的軍團菌選擇性分離培養基。本發明是這樣實現的軍團菌選擇性分離培養基，其包括的組份重量份數如下基礎液:^母粉瓊脂碳粉ACESa-酮戊二酸焦磷酸鐵蛋白液L-半胱氨酸白蛋白8~1310151.5~2.58130.5~1.50.150,302.5~3.50.30.80.05~0.15染料液溴甲酚紫溴酚蘭0.005~0.020.0050.02抗生素液萬古霉素多粘菌素B放線菌酮0.006~0.0100.006^0.0100細5~0.002制備步驟如下(1)基礎液中的酵母粉、瓊脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份數稱量放置容器中，加水9001000份，用KOH將pH值調至6.85;煮沸1分鐘，然后再12rC高溫滅菌15分鐘;將焦磷酸鐵溶于8~12份水中，過濾滅菌；將12rC高溫滅菌后的酵母粉、瓊脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸冷卻至55'C后加入過濾滅菌的焦磷酸鐵溶液混勻；(2)將甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份數稱量放置容器中加入2731份水進行溶解；(3)、將溴甲酚紫和溴酚蘭按上述重量份數稱量放置容器中加入812份乙醇中進行溶解；(4)將萬古霉素、多粘菌素B和放線菌酮按上述重量份數稱量放置容器中加入0.81.2份水中進行溶解；(5)將(1)步驟的溶液加入(2)步驟得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步驟得到的溶液中，最后將所得到的混合液加入(4)步驟所得到的溶液中混勻。本發明在包括以酵母粉、活性炭、瓊脂、ACES(N-2-乙酰氨基-2-氨基乙烷磺酸)緩沖劑、a-酮戊二酸、可溶性焦磷酸鐵以及L-半胱氨酸等軍團菌生長所必需的營養成分的基礎配方上，添加染料溴麝香草酚蘭和溴甲酚紫，在對軍團菌進行選擇性分離培養的同時可以使菌落顯色，根據菌落形態和顏色鑒定和區分軍團菌目標菌；添加選擇性抗生素可抑制非軍團菌屬細菌如革蘭陽性球菌、革蘭陰性桿菌和霉菌類生長，從而提高軍團菌分離培養陽性率。與現有技術相比，本發明軍團菌選擇性分離培養基有益效果是(l)添加的染料使軍團菌生長過程中產生色素，根據菌落形態和顏色有利于鑒定和區分軍團菌目標菌；(2)添加和調整選擇性抗生素濃度，提高對非軍團菌屬及雜菌類的抑制能力，降低對軍團菌種的抑制性，從而提高了對軍團菌屬分離培養陽性率；(3)降低檢測成本、經濟實用，便于臨床和衛生防疫部門推廣應用。圖l是空白培養基的圖。圖2是四區劃線法接種軍團菌ATCC33153標準菌株，培養72小時后的圖片。具體實施例方式以下結合實施例對本發明的具體實施例進行詳細的說明。實施例l軍團菌選擇性分離培養基，其包括的組份重量份數如下基礎液酵母粉瓊脂碳粉ACESa-酮戊二酸焦磷酸鐵蛋白液甘氨酸L-半胱氨酸白蛋白染料液溴甲酚紫溴酚蘭抗生素液9~1112~141.5~2.39~110.8~1.20.22-0.272.8~3.20.4~0.60.08~0.120.008^0.0120.008~0.012萬古霉素0.0008~0.0012多粘菌素B0.007~0.009放線菌酮0.007M).009制備步驟如下(1)基礎液中的酵母粉、瓊脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份數稱量放置容器中，加水930980份，用KOH將pH值調至6.85;煮沸1分鐘，然后再121'C高溫滅菌15分鐘；將焦磷酸鐵溶于911份水中，過濾滅菌；將。rC高溫滅菌后的酵母粉、瓊脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸冷卻至55-C后加入過濾滅菌的焦磷酸鐵溶液混勻；(2)將甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份數稱量放置容器中加入2830份水進行溶解；(3)、將溴甲酚紫和溴酚蘭按上述重量份數稱量放置容器中加入9ll份乙醇中進行溶解；(4)將萬古霉素、多粘菌素B和放線菌酮按上述重量份數稱量放置容器中加入0.91.1份水中進行溶解；(5)將(1)步驟的溶液加入(2)步驟得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步驟得到的溶液中，最后將所得到的混合液加入(4)步驟所得到的溶液中混勻。實施例2軍團菌選擇性分離培養基(BCYEa+DGVPC)，包括的組份重量份數如下:基礎液酵母粉10瓊脂13碳粉2.0ACES10a-酮戊二酸1.0焦磷酸鐵0.25蛋白液甘氨酸3.0L-半胱氨酸0.5白蛋白0.1染料液溴甲酚紫0.01溴酚蘭0.01抗生素液萬古霉素0.001多粘菌素B0.008放線菌酮0.008制備步驟如下(1)基礎液中的酵母粉、瓊脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份數稱量放置容器中，加水950份的水，用KOH將pH值調至6.85;煮沸l分鐘，然后再12rC高壓滅菌(15磅)15分鐘；將焦磷酸鐵溶于10份水中，過濾滅菌；將高壓滅菌后的酵母粉、瓊脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸，冷卻至55'C后加入過濾滅菌的焦磷酸鐵溶液混勻；(2)、將甘氨酸、L-半胱氨酸、白蛋白按上述重量份數稱量放置容器中加入29份的水進行溶解；(3)、將溴甲酚紫、溴酚蘭按上述重量份數稱量放置容器中加入10份的乙醇中進行溶解；(4)將萬古霉素、多粘菌素B、放線菌酮按上述重量份數稱量放置容器中加入1份水中進行溶解；(5)將(1)步驟的溶液加入(2)步驟得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步驟得到的溶液中，最后將所得到的混合液加入(4)步驟所得到的溶液中混勻。實施例3軍團菌選擇性分離培養基，其包括的組份重量份數如下基礎液酵母粉8瓊脂10碳粉1.5ACES8a-酮戊二酸0.5焦磷酸鐵0.15蛋白液甘氨酸2.5L-半胱氨酸0.3白蛋白0.05染料液溴甲酚紫0.005溴酚蘭0.005抗生素液萬古霉素0.0005多粘菌素B0.006放線菌酮0,006制備步驟如下(1)基礎液中的酵母粉、瓊脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份數稱量放置容器中，加水卯0份，用KOH將pH值調至6.85;煮沸1分鐘，然后再12rC高溫滅菌15分鐘；將焦磷酸鐵溶于8份水中，過濾滅菌；將12rC高溫滅菌后的酵母粉、瓊脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸冷卻至55。C后加入過濾滅菌的焦磷酸鐵溶液混勻；(2)將甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份數稱量放置容器中加入27份水進行溶解；(3)、將溴甲酚紫和溴酚蘭按上述重量份數稱量放置容器中加入8份乙醇中進行溶解；(4)將萬古霉素、多粘菌素B和放線菌酮按上述重量份數稱量放置容器中加入0.8份水中進行溶解；(5)將(1)步驟的溶液加入(2)步驟得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步驟得到的溶液中，最后將所得到的混合液加入(4)步驟所得到的溶液中混勻。實施例4軍團菌選擇性分離培養基，其包括的組份重量份數如下:基礎液酵母粉13瓊脂15碳粉2.5ACES13a-酮戊二酸1.5焦磷酸鐵0.30蛋白液甘氨酸3.5L-半胱氨酸0.8白蛋白0.15染料液溴甲酚紫0.02溴酚蘭0.02抗生素液萬古霉素0.002多粘菌素B0.010放線菌酮0.010制備步驟如下(1)基礎液中的酵母粉、瓊脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份數稱量放置容器中，加水1000份，用KOH將pH值調至6.85;煮沸l分鐘，然后再12rC高溫滅菌15分鐘；將焦磷酸鐵溶于12份水中，過濾滅菌；將12rC高溫滅菌后的酵母粉、瓊脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸冷卻至55'C后加入過濾滅菌的焦磷酸鐵溶液混勻；(2)將甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份數稱量放置容器中加入31份水進行溶解(3)、將溴甲酚紫和溴酚蘭按上述重量份數稱量放置容器中加入12份乙醇中進行溶解；(4)將萬古霉素、多粘菌素B和放線菌酮按上述重量份數稱量放置容器中加入1.2份水中進行溶解；(5)將(1)步驟的溶液加入(2)步驟得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步驟得到的溶液中，最后將所得到的混合液加入(4)步驟所得到的溶液中混勻。本發明在軍團菌選擇性基礎培養基的配方體系中，添加溴麝香草酚蘭和溴甲酚紫燃料液和選擇性抗生素。溴麝香草酚蘭和溴甲酚紫在對軍團菌進行選擇性分離培養的同時可以使菌落顯色，根據菌落形態和顏色鑒定和區分軍團菌目標菌。選擇性抗生素可抑制非軍團菌屬細菌如革蘭陽性球菌、革蘭陰性桿菌和霉菌類生長，從而提高軍團菌分離培養陽性率。其中甘氨酸(glycine)對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為1280ng/ml和160^ig/ml;對痢疾桿菌的最低抑菌濃度為640嗎/ml;對傷寒桿菌的最低抑菌濃度為128(Hig/ml和640ng/ml;對大腸桿菌的最低抑菌濃度為1280ng/ml;萬古霉素(vancomycin)對金黃色葡萄球菌具有較強的抑制作用；多粘菌素B(polymixhiB)對綠膿桿菌和其他革蘭陰性桿菌有明顯抑制作用；放線菌酮(Cycloheximide)對霉菌類有明顯抑制作用。臨床檢測試驗將檢測軍團菌標本經過處理后，接種在本發明培養基中，于36°C,5。/。C02孵箱中，培養23天，一般情況下軍團菌的生長明顯，如圖l和圖2所示，圖2可以明顯看到軍團菌的生長情況；也可能培養至l周方可觀察到軍團菌。該選擇性培養基的特點是進行選擇性分離培養的同時，可以使菌落顯色，根據菌落形態和顏色鑒定和區分軍團菌目標菌；此外，調整了抗生素濃度，增強了對其它非軍團菌屬的抑制能力，降低對軍團菌種的抑制性，從而提高了對軍團菌屬細菌分離培養的陽性率。通過本發明對本地區釆集的206份環境水樣進行軍團菌分離并和一些常用的培養基進行對比試驗，如下表所示，軍團菌分離培養陽性率由35.1%~65.0%[2'31提高到50%~80%，并且降低成本3-5倍(3~556/1個平皿)。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>本發明的培養基一方面，既可以當作普通BCYEci-基礎培養基使用，防止培養過程中，其他細菌的污染；另一方面，利于通過菌落形態和顏色鑒定軍團菌，可以抑制雜菌生長，大大提高軍團菌分離培養檢出陽性率。權利要求1、軍團菌選擇性分離培養基，其特征在于其包括的組份重量份數如下基礎液酵母粉8～13瓊脂10～15碳粉1.5～2.5ACES8～13a-酮戊二酸0.5～1.5焦磷酸鐵0.15～0.30蛋白液甘氨酸2.5～3.5L-半胱氨酸0.3～0.8白蛋白0.05～0.15染料液溴甲酚紫0.005～0.02溴酚蘭0.005～0.02抗生素液萬古霉素0.0005～0.002多粘菌素B0.006～0.010放線菌酮0.006～0.010制備步驟如下(1)基礎液中的酵母粉、瓊脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份數稱量放置容器中，加水900～1000份，用KOH將pH值調至6.85；煮沸1分鐘，然后再121℃高溫滅菌15分鐘；將焦磷酸鐵溶于8～12份水中，過濾滅菌；將121℃高溫滅菌后的酵母粉、瓊脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸冷卻至55℃后加入過濾滅菌的焦磷酸鐵溶液混勻；(2)將甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份數稱量放置容器中加入27～31份水進行溶解；(3)、將溴甲酚紫和溴酚蘭按上述重量份數稱量放置容器中加入8～12份乙醇中進行溶解；(4)將萬古霉素、多粘菌素B和放線菌酮按上述重量份數稱量放置容器中加入0.8～1.2份水中進行溶解；(5)將(1)步驟的溶液加入(2)步驟得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步驟得到的溶液中，最后將所得到的混合液加入(4)步驟所得到的溶液中混勻。2、如權利要求1所述的軍團菌選擇性分離培養基，其特征在于包括的組份重量份數如下基礎液酵母粉瓊脂碳粉ACESa-酮戊二酸焦磷酸鐵蛋白液甘氨酸L-半胱氨酸白蛋白染料瓶溴甲酚紫溴酚蘭抗生素液萬古霉素多粘菌素B放線菌酮制備步驟如下(1)基礎液中的酵母粉、瓊脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份數稱量放置容器中，加水930^訴0份，用KOH將pH值調至6.85;煮沸1分鐘，然后再121"C高溫滅菌15分鐘；將焦磷酸鐵溶于911份水中，過濾滅菌；將121'C高溫滅菌后的酵母粉、瓊脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸冷卻至55'C后加入過濾滅菌的焦磷酸鐵溶液混勻；(2)將甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份數稱量放置容器中加入2830份水進行溶解；(3)、將溴甲酚紫和溴酚蘭按上述重量份數稱量放置容器中加入911份乙醇中進行溶解；(4)將萬古霉素、多粘菌素B和放線菌酮按上述重量份數稱量放置容器中加入0.91.1份水中進行溶解；(5)將(1)步驟的溶液加入(2)步驟得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步驟得到的溶液中，最后將所得到的混合液加入(4)步驟所得到的溶液中混勻。3、如權利要求2所述的軍團菌選擇性分離培養基，其特征在于包括的組份重量份數如下基礎液酵母粉10瓊脂13碳粉2.0ACES10a-酮戊二酸1.0焦磷酸鐵0.25蛋白液甘氨酸3.0L-半胱氨酸0.5白蛋白0.1染料液溴甲酚紫0.01溴酚蘭0.01抗生素液萬古霉素0.001多粘菌素B0.008放線菌酮0.008制備步驟如下(1)基礎液中的酵母粉、瓊脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份數稱量放置容器中，加水950份的水，用KOH將pH值調至6.85;煮沸l分鐘，然后再12rC高溫滅菌15分鐘；將焦磷酸鐵溶于10份水中，過濾滅菌；將12rC高溫滅菌后的酵母粉、瓊脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸，冷卻至55'C后加入過濾滅菌的焦磷酸鐵溶液混勻；(2)、將甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份數稱量放置容器中加入29份的水進行溶解；(3)、將溴甲酚紫和溴酚蘭按上述重量份數稱量放置容器中加入10份的乙醇中進行溶解；(4)將萬古霉素、多粘菌素B和放線菌酮按上述重量份數稱量放置容器中加入1份水中進行溶解；(5)將(1)步驟的溶液加入(2)步驟得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步驟得到的溶液中，最后將所得到的混合液加入(4)步驟所得到的溶液中混勻。全文摘要本發明公開一種軍團菌選擇性分離培養基，其是在軍團菌BCYEα-基礎培養基基礎配方上添加染料溴麝香草酚蘭和溴甲酚紫；又添加了軍團菌選擇抗生素甘氨酸、萬古霉素、多粘菌素B和放線菌酮。本發的有益效果是(1)添加的染料使軍團菌生長過程中產生色素，根據菌落形態和顏色有利于鑒定和區分軍團菌目標菌；(2)添加和調整選擇性抗生素濃度，提高對非軍團菌屬及雜菌類的抑制能力，降低對軍團菌種的抑制性，從而提高了對軍團菌屬分離培養陽性率；(3)降低檢測成本、經濟實用，便于臨床和衛生防疫部門推廣應用。文檔編號C12N1/20GK101643713SQ20091004028公開日2010年2月10日申請日期2009年6月16日優先權日2009年6月16日發明者張遠志,朱慶義,娟王,胡朝暉,詹曉勇申請人:廣州金域醫學檢驗中心有限公司