直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法

專利名稱：直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法
技術領域：
本發明涉及乳酸菌凍干粉的制備，具體是指一種直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉 及其制備方法。
技術背景傳統的商業發酵劑所含活菌量少，約為107-108個&，不能直接用于生產，需經過活化、擴增才能用于乳品生產，這種發酵劑用量大，制作過程繁雜，質量不易控制，容易污染雜 菌和噬菌體，菌種隨著傳代數增加而改變，導致發酵產品質量不穩定，可重復性差。直投 式乳酸菌發酵劑指不需要經過活化、擴增而直接應用于生產的一類新型發酵劑，該種發酵 劑的關鍵是要活菌數要高，以保證接種量少，接種后可快速復水，可在比較短的時間內完 成發酵過程。制備這種發酵劑的關鍵在于增菌培養條件、保護劑和真空干燥條件的選擇，因為干酪 乳桿菌鼠李糖亞種在發酵過程中會產生乳酸，乳酸積累到一定程度會抑制乳酸菌自身的生長；該菌的收獲時間也非常關鍵，微生物生長分成延遲期、對數生長期、穩定期和衰退期， 收獲采用離心和冷凍干燥，離心和冷凍干燥對不同菌齡的細胞損傷不一樣，因此收獲的菌 齡非常重要；收獲后的菌體細胞需要加入保護劑進行懸浮，菌體細胞懸浮密度對凍干后的 存活率有影響；細菌在冷凍干燥過程中非常容易受到損傷，因此需要加入合適的保護劑， 而保護劑又分成滲透性和非滲透性，只有滲透性保護劑不僅存在細胞表面，而且還可以滲 透到細胞內部，從而有效阻止細胞內外的冷凍損傷，另外保護劑的持水性對細胞的冷凍損 傷也有非常重要的影響；預凍溫度、預凍時間和預凍速率對細菌細胞的存活率和復水性影 響也很大，因此在預凍過程中盡量生成小冰晶，有利于冷凍干燥后發酵劑的復水。劉冬梅等人于《華南理工大學學報(自然科學版)》2006年第五期發表的"潛在益生 菌鼠李糖乳桿菌在大豆奶酪中的穩定性"中報道了Za"o6"d〃w;ysubsp, 7'/^m"cww;y 6013 在MRS基礎培養基的培養上清液對S. flww^有很好的抑菌作用。申請號為200610123898.7 的中國發明公開了 "一種即食含活益生菌的泡菜及其制備方法"，其干酪乳桿菌鼠李糖亞 種6013可用于泡菜的發酵并在24h完成發酵。劉冬梅等人于《華南理工大學學報(自然科 學版)》2008年第七期發表的"丄flcto6ac/〃w caw/ subsp. LCR719抑制泡菜中的 亞硝酸鹽"中報道了該菌在泡菜發酵過程中能抑制亞硝酸鹽的產生。吳暉等人于《食品工 業科技》2008年第四期發表的"鼠李糖乳桿菌發酵生產L-乳酸培養基的優化"中報道了該 菌能發酵產生L-乳酸的產量高達143.6g/L。為了使該菌能在工業上大量生產和應用，對其進行增菌培養，以獲得能直接用于生產的高密度發酵劑。乳酸(Lactic acid)的學名為2-羥基丙酸，結構式為CH3CHOHCOOH，相對分子質量 為90.0S,由于分子內含有一個不對稱碳原子，因此具有旋光異構現象，可區分為L-乳酸和 D-乳酸，當兩者以等比例混合時，即成為內消旋的DL-乳酸。由于人體只有代謝L-乳酸的 L-乳酸脫氫酶，世界衛生組織提倡在食品及醫藥行業中使用L-乳酸取代目前普遍使用的 DL-乳酸，WHO明確規定，人體每天攝取D-乳酸的量限制在100mg/kg體重以下，而對L-乳酸不加限制。研究含L-乳酸的食品以替代含D-乳酸和DL-乳酸的食品具有重要意義。申請號為200710048203.8的中國發明公開了一種"高活性泡菜直投式菌劑的制備技 術"，是將植物乳桿菌、短乳桿菌、腸膜明串珠菌、酵母菌按一定的比例混合的復合菌劑。 但是沒有公開菌粉中各個菌的活菌數量，沒有用到干酪乳桿菌鼠李糖亞種，用于泡菜發酵 時耗時為48h,也沒有涉及發酵后泡菜中亞硝酸鹽的情況，同時也沒有明確凍干粉的包裝 方式和包裝條件。專利號為200610010517.4的中國發明公開了 "直投式酸奶發酵菌劑的生產方法"，是將 嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種等菌進行分別培養，沒有用到干酪乳桿菌鼠李糖亞 種，該菌劑也是復合菌劑且只用于酸奶發酵，其中的活菌數量為104-101()個&，同時也沒有 明確凍干粉的包裝方式和包裝條件。專利號為02144963.5的中國發明專利公開了 "直投式酸奶發酵劑的制作方法"，是將嗜 熱鏈球菌和保加利亞桿菌進行混合培養，經一系列工序制成的復合菌劑。但是沒有公開菌 劑中各個菌的活菌數量，沒有用到干酪乳桿菌鼠李糖亞種，該菌劑只用于酸奶發酵。用了 充氮包裝，但沒有明確包裝過程中氣流濕度和環境濕度。專利號為200410088476.1 (授權公告號CN 1285292C)的中國發明專利公開了 "一種 用于生產泡菜的直投式復合菌粉產品及其生產方法"，是復合菌劑，菌粉的活菌數量為 108~109個&，擴大培養過程中沒有進行在線控制pH，所以無法實現高密度培養，該菌劑用 于泡菜發酵耗時36 50h，也沒有涉及發酵后泡菜中亞硝酸鹽的情況，同時也沒有明確凍干 粉的包裝方式。上述現有技術由于沒有采用在線調控發酵pH值，并且所選擇的增菌培養基、收獲菌 齡、保護劑、預凍的條件和包裝條件等不合適，普遍存在活菌數量不高、用于生產時發酵 時間長、復水速率差等缺點，而且沒有考慮凍干粉中含有乳糖、葡萄糖等糖類，在貯存過 程中會吸潮的問題。5發明內容本發明的目的是為了解決上述現有技術存在的不足，提供一種活菌數含量為10u~1012 cfb/g、用于生產時發酵時間短、復水性好的直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉及其制備 方法。該直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉可用于發酵生產醬腌菜(含泡菜)、香腸、 酸奶、L-乳酸、玉米粉、豆粕、花生粕和用作益生菌制劑等。本發明的目的通過如下技術方案實現一種直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，包括如下步驟和工藝條件-第一步將干酪乳桿菌鼠李糖亞種aactotoc/〃w owe/ subsp. 7'/ww"asw;y 6013 ，簡稱LCR 6013)的凍干粉置于MRS (由de Man， Rogosa和Sharp在1960年發明，簡稱MRS)培養基 中，于28~30 。C靜止培養24 h~36 h，制成母發酵劑；以重量份數計，所述MRS培養基配方 為蛋白胨0.8 1.0份，酵母抽提物0.5 0.7份，葡萄糖1.5 2.0份，檸檬酸二銨0.1 0.2份，硫 酸鎂0.048 0.058份，牛肉膏0.5 1.0份，磷酸氫二鉀0.1 0.2份，硫酸錳0.015 0.025份，乙酸 鈉0.4 0.5份，吐溫80 0.1~0.3份，蒸餾水94.0 96.0份；攪拌溶解均勻后用0.08 0.10 MPa滅 菌15~20 min，冷卻至28~30 。C備用；第二步以體積比為2 5: IOO的比例，將母發酵劑接入工作發酵劑培養基中，于28~30 。C靜止培養24h 36h，制成工作發酵劑；以重量份數計，所述工作發酵劑培養基配方為-蛋白胨0.8 1.0份，酵母抽提物0.5 0.7份，葡萄糖1.5 2.0份，檸檬酸二銨0.1 0.2份，硫酸鎂 0.048~0.058份，牛肉膏0.5 1.0份，磷酸氫二鉀0.1 0,2份，硫酸錳0.015 0.025份，乙酸鈉 0.4~0.5份，吐溫80 0.1~0.3份，番茄汁6.0 8.0份，胡蘿卜汁4.5 6.0份，抗壞血酸0.02~0.04 份和蒸餾水79.8 85.4份；攪拌溶解均勻后用0.08 0.10 MPa滅菌15 20 min ，冷卻至28~30 。C 備用；第三步以體積比為2 5: IOO的比例，將工作發酵劑接入生產培養基中，于35~37 。C 下的發酵罐中進行培養，在培養過程用NaOH溶液調整pH為6.0 6.8，攪拌轉速為100 150 rpm，培養16 24h后收集，得發酵菌懸液；以重量份數計，所述生產培養基配方組成為-蛋白胨2.5 3.0份，酵母抽提物0.5 0.7份，葡萄糖1.5 2.0份，檸檬酸二銨0.1 0,2份，硫酸鎂 0.048 0.058份，牛肉膏0.5 1.0份，磷酸氫二鉀0.1 0.2份，硫酸錳0.015 0.025份，乙酸鈉 0.4~0.5份，吐溫80 0.1~0.3份，番茄汁6.0 8.0份，胡蘿卜汁4.5 6.0份，抗壞血酸0.02~0.04 份，蒸餾水78.0 83.7份；攪拌溶解均勻后用0.08 0.10MPa滅菌15 20min，冷卻至35 37。C 備用；第四步將發酵菌懸液于5000 8000 rpm，離心20~25 min，舍棄上清液，收集菌泥； 第五步在菌泥中，按復合保護劑溶液的生理鹽水溶液與菌泥的體積比為3 5: l加入復合保護劑溶液，混合均勻為保護劑懸浮液；以重量份數計，所述的復合保護劑溶液配方 組成為海藻糖5~10份，脫脂奶粉5~10份，氯化鈉0.9份，蒸餾水79.1~89.1份，溶解后 攪拌均勻，用0.08 0.10MPa滅菌15 20min，冷卻至常溫備用；第六步將保護劑懸浮液置于淺盤中，在于-40 °C~-65 。C下預凍0.5 h~2.0 h,使保護劑 懸浮液厚度為5 15 mm;第七步將第六步所得的保護劑懸浮液置于真空冷凍干燥機中，于冷阱溫度為-40 。C -65。C，真空度為1.3 13.0Pa，干燥18 20h，得凍干粉，凍干粉水分重量含量低于3 %， 活菌數達到1011 1012 cfii/g;第八步用濕度為50~60 %的恒濕空氣將凍干粉的溫度恢復到常溫，在濕度為50~60 % 的環境中，用氣流包裝機進行鋁塑包裝，氣流分裝機所用的無菌干燥空氣的濕度不應高于 20 %。為進一步實現本發明目的，第三步工作發酵劑與生產培養基的體積比優選為3: 100， NaOH溶液的濃度優選為l 2mol/L， pH優選為6.8，發酵溫度優選為37。C。所述第五步中海藻糖優選為10份，脫脂奶粉優選為10份，氯化鈉優選為0.9份。 第一步或第二步的發酵溫度優選為30 。C，培養時間優選為24 h。 第六歩的淺盤厚度為40-50 mm。 本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果(1) 本發明的工作發酵劑用兩種培養基依次培養，使干酪乳桿菌鼠李糖亞種盡量活 化，并處同步生長狀態。(2) 本發明所用的生產培養基，采用番茄汁、胡蘿卜汁和抗壞血酸能保證菌體生長 過程中所需要的生長因子，促進菌體大量生長。(3) 本發明所用的凍干保護劑為5~10%海藻糖和5~10%脫脂奶粉的生理鹽水溶液， 確保了凍干粉的活菌數達到10" l(^cfu/g。所用的培養基全部為可食用的，保護劑脫脂奶 粉及海藻糖也為可食用的食品配料，急性毒理試驗表明該菌種是無毒可使用的，該菌株也 是中國工業微生物菌種保藏中心保藏菌種。(4) 本發明凍干粉用于L-乳酸的生產時，于37 。C發酵96-120 h，控制其中的pH為 6.5，可使總乳酸的產量達到150g/L，其中L-乳酸的含量為9"/。以上；直接用于益生菌泡 菜(醬腌菜)的發酵生產時，發酵時間為24 30h，該菌能抑制發酵過程中亞硝酸鹽的產 生，發酵終止后L-乳酸含量為92.3 %;用于發酵香腸時，在15-20 。C下發酵120-240 h， 可使發酵香腸的pH為5.2~5.8， L-乳酸相對含量為91.2%，發酵過程中可不使用亞硝酸鹽； 用于發酵豆粕(花生粕)時，加入原料同等量的水，在25 37。C下發酵24 72h，可提使7發酵豆粕(花生粕)的pH為5.0 6.0，其中L-乳酸相對含量為91.5。/。，蛋白質含量可提高 5.5~10.5%，并使大分子的蛋白質降解為24kDa以下；用于發酵玉米粉時，加入原料同等 量的水，在25~37 。C下發酵24~72 h，可使發酵玉米的pH為4.0~5.0，其中L-乳酸的相對 含量為93.0%;用于發酵酸奶的生產時，于41 。C發酵4.5~5.5 h，發酵酸奶酸味純正，濃 厚，發酵終止后其中含有91。/。以上的L-乳酸；因此可用于發酵生產L-乳酸、益生菌泡菜、 香腸、豆粕、花生粕、玉米和酸奶等，并使L-乳酸相對含量為91。/。以上。(5) 本發明制備的凍干粉活菌數高，不易結塊、復水性很好。(6) 保存方便，易于用于工藝生產，減少接種、擴培環節而減少了污染，保證了產 品質量的穩定性，縮短了發酵周期，解決了生產的食品安全問題，符合規模化生產的需要。


圖1為干酪乳桿菌鼠李糖亞種在基礎MRS和實施例1改良MRS培養基的生長曲線； 圖2為實施例4用的LCR6013凍干粉發酵生產L-乳酸和用傳統方法擴培的LCR6013發酵生產L-乳酸的變化曲線；圖3為實施例5中用手性柱Chirex 3126的高效液相法檢測L-乳酸的含量圖；圖4a為實施例8對照樣的乳酸球菌發酵48 h的玉米粉的L-乳酸含量高效液相色譜圖；圖4b為實施例8用凍干粉LCR 6013發酵48 h的玉米粉的L-乳酸高效液相色譜圖。
具體實施方式
為更好理解本發明，下面結合實施例對本發明做進一步地詳細說明，但是本發明要求 保護的范圍并不局限于實施例表示的范圍。凍干粉的制備實施例1第一步將干酪乳桿菌鼠李糖亞種(編號CICC 6013，丄arfo6a"7/z^ ca"z' subsp. Aammw^ 6013，中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏，地址北京市朝陽區霄云路32 號，郵編100027)的凍干粉置于MRS培養基中，于30。C靜止培養24h，制成母發酵劑； MRS培養基的配制蛋白胨10g，酵母抽提物5.0g，葡萄糖20.0g，檸檬酸二銨2.0g，硫酸 鎂0.58g，牛肉膏10.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸錳0.25g，乙酸鈉5.0 g，吐溫80 1mL,蒸 餾水944.0g，于0.08 MPa滅菌20 min，冷卻至30。C備用。第二步以體積比為3: IOO的比例，將母發酵劑接入工作發酵劑培養基中，于30 。C靜 止培養24h，制成工作發酵劑。工作發酵劑培養基的配制蛋白胨10g，酵母抽提物5.0g， 葡萄糖20.0g，檸檬酸二銨2.0g，硫酸鎂0.58g，牛肉膏10.0g，磷酸氫二鉀2.0 g,硫酸錳 0,25 g，乙酸鈉5.0g，吐溫80 1mL，番茄汁80mL，胡蘿卜汁60mL，抗壞血酸0.4g，用蒸餾水804.0g，于0.08 MPa滅菌20 min，冷卻至30 。C即得到工作發酵劑培養基。番茄汁或胡蘿卜汁的制作將番茄或胡蘿卜用打漿機榨汁，將搾出的汁于8000 rpm, 離心20min，收集上清液，即得到番茄汁或胡蘿卜汁。第三步以體積比為2: IOO的比例，將工作發酵劑接入生產培養基中，于37 。C下的發 酵罐中進行培養，在培養過程用濃度為2 mol/L的NaOH溶液保持pH為6.8，攪拌轉速為150 rpm;培養20h后收集發酵菌懸液；生產培養基的配制蛋白胨30g，酵母抽提物5.0 g，葡 萄糖20.0g，檸檬酸二銨2.0g，硫酸鎂0.58g，牛肉膏10.0g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸錳0.25 g，乙酸鈉5.0g，吐溫80 1mL，番茄汁80mL,胡蘿卜汁60mL，的抗壞血酸0.4 g，蒸餾水 790,0 g，于0.08 MPa滅菌20 min，冷卻至37 。C即得到生產培養基。第四步將發酵菌懸液于8000 rpm，離心20 min，舍棄上清液，收集菌泥； 第五步在菌泥中，按復合保護劑溶液與菌泥體積比為3: l加入復合保護劑溶液，混合 均勻為保護劑懸浮液；以重量份數計，所述的復合保護劑溶液配方組成為海藻糖IO g， 脫脂奶粉10g，氯化鈉0.9g，蒸餾水79.1g，溶解后攪拌均勻，用0.08 MPa滅菌20 min，冷 卻至常溫備用；第六步將保護劑懸浮液置于厚度為40mm淺盤中，于-65 。C下預凍0.5 h，使其在容器 壁上的厚度約為10mm;第七步將鋪上菌體的淺盤置于真空冷凍干燥機中，于冷阱溫度為-65。C，真空度為1.3 Pa，干燥18h，凍干粉的水分含量為2.0%，活菌數達到10"cfu/g。第八步用濕度為50 %的恒濕空氣將凍干粉的溫度恢復到常溫，在濕度為50 %的環境 中，用氣流包裝機進行鋁塑包裝，氣流分裝機所用的無菌干燥空氣的濕度為15%，保證了 凍干粉不吸潮。通過對干酪乳桿菌鼠李糖亞種aa"o6ac/〃^ ca e/ subsp. r/^附wwws 6013)培養條件的 深入研究，嚴格控制發酵劑的發酵培養條件、發酵時間、凍干保護劑和真空干燥條件，選 擇兩次擴大發酵培養，盡量使所有的細胞處于同步生長時期，再在改良MRS培養基中進 行擴大培養，在線控制發酵pH和嚴格控制收獲時間，活細胞數達到1011 cfu/g，并保證了 該菌齡細胞免受離心和冷凍干燥凍干的損傷。以發酵時間對干酪乳桿菌鼠李糖亞種 aa"o6ac/〃^a^/subsp./'/7amwmw6013)活菌數的對數值作曲線如圖1，從圖1可以看 出，在MRS基礎培養基中，20h菌數達到最高值時，活菌數僅為4.50xl()Scfu/mL，而在 優化的增菌培養基中經過較短的遲滯期后即進入對數生長期，在12h左右進入對數生長期 末期，16h菌數可達1.67xl09cfu/mL，比MRS基礎培養基的提高了近4倍。與MRS基礎 培養基的相比較，在改良的MRS基礎培養基中生長時，pH下降較為緩慢，這說明氮源的增加可以中和生長后期菌體代謝的有機酸，從而有利于菌體繁殖。LCR6013在改良培養基 中約16h左右菌數達到最高，約為1.67xl09cfU/mL， 16 28h處于穩定期，活菌數基本保 持不變。因此，最佳菌體收獲時間為16 24h之間。10% (質量)的海藻糖可使細胞存活 率達85.8%，添加15% (質量)的海藻糖可使其成活率達到91.9%，海藻糖比其它任何糖 對保護干的生物材料更有效。而選用大分子保護劑脫脂奶粉作為干燥介質，因為(1) 脫脂奶粉可以通過穩定細胞膜的組成來防止細胞損傷；(2)在冷凍干燥過程中產生多孔 結構，使得脫水更加容易；(3)脫脂奶粉本身含有蛋白質可為細胞提供一個保護層的作 用。不同MnS04濃度對菌體存活率有著較大的影響，適當的濃度可以提高菌體的存活率。 而現有的技術當中由于選擇的發酵培養基不合適，沒有經過兩次的擴大培養后再進行發酵 生產，沒有在線嚴格控制發酵pH，沒有嚴格控制收獲菌齡，凍干保護劑的選擇比較單一， 最后得到的活菌數都普遍較低。 實施例2第一步將干酪乳桿菌鼠李糖亞種(編號CICC 6013，丄""o6""7/w m e/ subsp. Aammw^ 6013，中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏，地址北京市朝陽區霄云路32 號，郵編100027)的凍干粉置于MRS培養基中，于28。C靜止培養36h，制成母發酵劑； MRS培養基的配制蛋白胨8.0g，酵母抽提物7.0g，葡萄糖15.0g，檸檬酸二銨l.O g，硫 酸鎂0.48g，牛肉膏5.0g，磷酸氫二鉀1.0g，硫酸錳0.15g，乙酸鈉4.0g，吐溫80 3mL,蒸 餾水960g，于0.10MPa滅菌15min，冷卻至28。C備用。第二步以體積比為5: IOO的比例，將母發酵劑接入工作發酵劑培養基中，于28 。C靜 止培養36h，制成工作發酵劑。工作發酵劑培養基的配制蛋白胨8.0g，酵母抽提物7.0g， 葡萄糖15.0g，檸檬酸二銨1.0g，硫酸鎂0,48g，牛肉膏5.0g，磷酸氫二鉀1.0g，硫酸錳0.15 g，乙酸鈉4,0g，吐溫80 3mL，番茄汁60mL，胡蘿卜汁45mL，抗壞血酸0,2g，蒸餾水850.0 g，于0.1MPa滅菌15min，冷卻至28 。C即得到工作發酵劑培養基。番茄汁或胡蘿卜汁的制作將番茄和胡蘿卜用打漿機搾汁，將搾出的汁于8000 rpm， 離心20min，收集上清液，即得到番茄汁或胡蘿卜汁。第三步以體積比為5: IOO的比例，將工作發酵劑接入生產培養基中，于35 。C下的發 酵罐中進行培養，在培養過程用l mol/L的NaOH溶液保持pH為6.5，攪拌轉速為IOO rpm， 培養24 h后收集，為發酵菌懸液；生產培養基的配制蛋白胨25 g，酵母抽提物7.0 g，葡 萄糖15.0g，檸檬酸二銨1.0g，硫酸鎂0.48g，牛肉膏5.0g，磷酸氫二鉀1.0g，硫酸錳0.15g， 乙酸鈉4,0g，吐溫80 3mL，番茄汁60mL，胡蘿卜汁45mL，抗壞血酸0.2 g，蒸餾水835.0 g， 于O.IO MPa滅菌15 min，冷卻至35 。C即得到生產培養基。第四步將發酵菌懸液于6500 rpm，離心22 min，舍棄上清液，收集菌泥；
第五步在菌泥中，按復合保護劑的溶液與菌泥體積比為5: l加入復合保護劑溶液，混 合均勻為保護劑懸浮液；復合保護劑的配制海藻糖5.0g，脫脂奶粉5.0g，氯化鈉0.9g, 蒸餾水89.1g，溶解后攪拌均勻，用0.1MPa滅菌15min，冷卻至常溫備用；
第六步將保護劑懸浮液置于厚度為50mm淺盤中，在于-40 。C下預凍2.0 h，使其在容 器壁上的厚度為15mm;
第七步將鋪上菌體的淺盤置于真空冷凍干燥機中，于冷阱溫度為-40。C，真空度為13 Pa，干燥20h，凍干粉的水分含量為3.0%，活菌數達到l(^cfU/g。
第八步用濕度為60 %的恒濕空氣將凍干粉的溫度恢復到常溫，在濕度為60 %的環境 中，用氣流包裝機進行鋁塑包裝，氣流分裝機所用的無菌干燥空氣的濕度為20%，保證了 凍干粉不吸潮。 實施例3
第一步將干酪乳桿菌鼠李糖亞種(編號CICC 6013， ￡acto6ad〃ra c"w/ subsp, 6013，中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏，地址北京市朝陽區霄云路32 號；郵編100027)的凍干粉置于MRS培養基中，于29。C靜止培養30h，制成母發酵劑； MRS培養基的配制蛋白胨9.0g，酵母抽提物6.0g，葡萄糖17.5g，檸檬酸二銨1。5 g，硫 酸鎂0.53g，牛肉膏7.5g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸錳0.20g，乙酸鈉4.5 g，吐溫80 2mL，蒸 餾水950.0g,于0.09MPa滅菌18min，冷卻至29。C備用。
第二步以體積比為2: IOO的比例，將母發酵劑接入工作發酵劑培養基中，于29 。C靜 止培養30h，制成工作發酵劑。工作發酵劑培養基的配制蛋白胨9.0g，酵母抽提物6.0g， 葡萄糖17.5g，檸檬酸二銨1.5g，硫酸鎂0.53g，牛肉膏7.5g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸錳0.20 g，乙酸鈉4.5g，吐溫80 2mL，番茄汁70mL，胡蘿卜汁53mL，抗壞血酸0.3g，蒸餾水828。0 g，于0.09MPa滅菌18min，冷卻至29 。C即得到工作發酵劑培養基。
番茄汁或胡蘿卜汁的制作將番茄和胡蘿卜用打漿機搾汁，將搾出的汁于8000 rpm， 離心20min，收集上清液，即得到番茄汁或胡蘿卜汁。
第三步以體積比為3.5: IOO的比例，將工作發酵劑接入生產培養基中，于36。C下的發 酵罐中進行培養，在培養過程用l mol/L的NaOH溶液保持pH為6.0,攪拌轉速為120 rpm， 培養16h后收集發酵菌懸液；生產培養基的配制蛋白胨27.5g，酵母抽提物6.0g，葡萄糖 17.5 g，檸檬酸二銨1.5g，硫酸鎂0.53g，牛肉膏7.5g，磷酸氫二鉀L5 g，硫酸錳0.20 g, 乙酸鈉4.5g，吐溫80 2mL，番茄汁70 mL，胡蘿卜汁55mL，抗壞血酸0.3 g，蒸餾水807,0 g， 于0.09 MPa滅菌18 min，冷卻至36 。C即得到生產培養基。
11第四步將發酵菌懸液于5000 rpm，離心25 min，舍棄上清液，收集菌泥； 第五步在菌泥中，按復合保護劑溶液與菌泥體積比為4: l加入復合保護劑溶液，混合 均勻為保護劑懸浮液；復合保護劑溶液的配制海藻糖7.5g，脫脂奶粉7.5g，氯化鈉0.9g， 蒸餾水84.1g，溶解后攪拌均勻，用0.09MPa滅菌18min，冷卻至常溫備用；
第六步將保護劑懸浮液置于厚度為45mm淺盤中，在于-50 。C下預凍l h，使其在容器 壁上的厚度為5mm;
第七步將鋪上菌體的淺盤置于真空冷凍干燥機中，于冷阱溫度為-50。C，真空度為7.5 Pa，干燥19h，凍干粉的水分含量為2.5 %，活菌數達到10^cfii/g。
第八步用濕度為55 %的恒濕空氣將凍干粉的溫度恢復到常溫，在濕度為55 %的環境 中，用氣流包裝機進行鋁塑包裝，氣流分裝機所用的無菌干燥空氣的濕度為15%，保證了 凍干粉不吸潮。
凍干粉的應用
實施例4 L-乳酸的發酵生產
將實施例l制備的凍干粉于種子培養基中，37。C培養24h，得到種子液，以5%(體 積)的接種量將種子液接種到發酵培養基中，37 。C培養110h (可為108 h-120 h)，用2-4 mol/L的NaOH溶液控制pH為6.5，攪拌轉速為120 rpm (可為100-150 rpm)，得到L-乳酸的產量達150 g/L，如圖2所示，用手性柱Chirex3126的高效液相法檢測發酵過程中 的L-乳酸的含量，分析儀器高效液相色譜儀系統，配備Waters 600泵多通道輸送系統； Waters 717自動進樣器；Waters 2996 PDA 二極管陣列檢測器；色譜柱手性柱Chirex 3126 (D)-peiiicillami， 4.6 mm IDX250 mm L。分析條件流動相為0.002 moL/L的硫酸銅溶液 溶劑為5% (質量)的異丙醇溶液，使用前經0.45 pm濾膜過濾，超聲脫氣；流動相流速 為0.7mL/min;柱溫30。C; 二極管陣列Waters 2996，檢測波長為254nm;標準和樣品溶 液用前均經過0.45 pm濾膜過濾后超聲脫氣；進樣量為2 ^L;用Empower積分軟件積分， 進行峰面積法外標定量。從圖2可以看出，用高密度的LCR6013凍干粉進行L-乳酸發酵， 在發酵108小時后L-乳酸達到150 g/L，而傳統方法擴培的LCR 6013在發酵130 h后才達 到86g/L。
乳酸分子內含有一個不對稱碳原子，因此具有旋光異構現象，區分為L(+)-乳酸(簡稱 L-乳酸)和D(-)-乳酸(簡稱D-乳酸)。由于人體只有可代謝L-乳酸的L-乳酸脫氫酶，世界 衛生組織提倡在食品及醫藥行業中使用L-乳酸取代目前普遍使用的DL-乳酸。因此研究能 多發酵生產L-乳酸的工藝顯得非常必要。其中種子培養基和發酵培養基配制如下
種子培養基配制葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，乙酸鈉2 g/L，擰檬酸銨2 g/L，吐溫80 1 mL/L， MgS04.7H20 0.2 g/L， K2HP04 2 g/L， MnS04 *H20 0.05 g/L，用蒸餾水定容至1000 mL， pH 6.5，于0.10 MPa滅菌20 min，即得到L-乳酸生
產種子培養基。
發酵培養基配制葡萄糖200g/L (或相當數量的玉米粉的酶解液)，酵母粉5g/L，蛋 白胨10 g/L(或相當數量的豆粕的酶解液)，牛肉膏15 g/L，吐溫80 1 ml/L，番茄汁50 ml/L， 白菜汁50ml/L，用生產用飲用水定容至1000 mL， pH 6.5，于0.10 MPa滅菌20 min，即 得到L-乳酸生產發酵培養基配制。
番茄汁或白菜汁的制備將番茄或白菜用榨汁機榨汁，將榨出的汁于5000-8000rpm, 離心20min，收集上清液，即得到番茄汁或白菜汁。
實施例5:益生菌泡菜
選擇沒有爛葉的芥菜或大白菜，清洗干凈后，瀝干表面水分，切成一定的大小并用開 水燙漂，在無菌環境下冷卻至37 °C，按菜質量百分比接入5 %的將實施例1制備的凍干粉， 輕輕攪拌均勻，用滅菌水密封，于37。C發酵120h，瀝干水分進行真空包裝。泡菜制作過 程中要有充足的泡漬液浸沒蔬菜，使菜不得浮出液面，以滿足乳酸菌厭氧生長和發酵，整 個制作過程中盡可能在潔凈環境下進行。經檢測，本實施例生產的益生菌泡菜的亞硝酸鹽 變化情況如表1所示，不含亞硝酸鹽。亞硝酸鹽是一種潛在的致癌物，亞硝酸鹽在適宜的 條件下，可與食品中蛋白質的分解產物胺反應，生成N-亞硝基化合物。亞硝酸鹽的急性中 毒作用是導致高鐵血紅蛋白癥，即把人體血液中攜氧能力的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅 蛋白，而失去攜氧能力，因而引起組織缺氧中毒，并且活體和離體試驗表明有致突變和致 癌的作用。測定用LCR 6013凍干粉發酵和不加菌的傳統發酵的不同發酵時間的泡菜榨出 的汁中亞硝酸鹽的含量(GB/T5009.33-2003的鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽法)如表1所 示，從表1可看出，新鮮芥菜中的亞硝酸鹽的含量為2.87mg/L，接種LCR6013凍干粉的 泡菜在發酵24h后降為1.35mg/L，到48 h后檢測不到亞硝酸鹽。而未接種的對照樣中的 亞硝酸鹽的含量呈現先升高，后降低的趨勢，在第48 h出現亞硝酸鹽的峰值45.300 mg/。 可見，添加凍干粉LCR 6013對抑制泡菜中亞硝酸鹽的異常積累非常有效。用高效液相法 測定LCR60D凍干粉用于泡菜發酵過程中的L-乳酸的含量，如圖3所示，圖中保留時間 為9.214min的為L-乳酸，占總乳酸的含量為92.3 % (檢測方法同圖1的檢測)。此外，本 實施例利用實施例1制備的凍干粉制作出來的泡菜制作時間短為24小時，而傳統方法需 要168小時，加入LCR6013凍干粉的泡菜中，LCR 6013是優勢菌群，能快速生長及快速 產酸，使得泡菜經過24h發酵即達到了發酵終點，pH為3.50，顏色好和風味好。表1 泡菜發酵過程中亞硝酸鹽的變化規律
發酵時間(h)024487296120
LCR6013凍干粉發酵(mg/L)2.871.350.000.000.000.00
自然發酵(mg/L)2.872.8745.3024.5010.3010.50
實施例6:發酵香腸
將原料肉剔骨后，切碎并斬拌，以重量計，加入3.0%的蔗糖、2.0%的食鹽和1.5%的 料酒，混合均勻后接種實施例2制備的凍干粉，使以重量計活菌數達107個/§，混合均勻 后灌腸，捆扎好在20。C、相對濕度為95 %的環境下進行發酵，當發酵至pH5.0時終止發 酵，放入15。C，相對濕度為80%的環境下進行后熟發酵7天，入壇腌制成各種風味。由 于活菌含量高，進行優勢菌群發酵，無需添加亞硝酸鹽，生產出的發酵香腸滋氣味非常純 正，顏色自然，絕不含亞硝酸鹽。
實施例7 發酵豆粕和花生粕的生產
以重量計，將l:l的豆粕(還可是花生粕)與水混合，在0.10MPa滅菌20min，冷卻 至37。C接入實施例2的凍干粉，使以重量計活菌數達107個/§，于30。C密閉環境下發酵 36 h，發酵結束后pH為5.0-6.0，將發酵產物進行熱風氣流干燥，干燥進風溫度控制250 。C， 混合溫度控制150。C，出料溫度控制75。C。 L-乳酸的相對含量在91.5。/。，蛋白質的含量可 提高5.5%，干燥物料水分控制12%以下，使大分子的蛋白質降解為24kDa以下。由于使 用了高活菌數的凍干粉，所以大大縮短了發酵時間，提高了發酵效率并提高了蛋白質含量、 降低了蛋白質的分子量和有利于消化吸收。
實施例8 發酵玉米的生產
以重量計，將l:l玉米粉與水混合，冷卻至37。C左右接入實施例3的凍干粉，使以重 量計活菌數達l(T個/g，于30。C密閉環境下發酵48h，發酵結束后pH為4.0 5.0，將發酵 產物進行熱風氣流干燥，干燥進風溫度控制280。C，混合溫度控制18(TC，出料溫度控制 80 。C。如圖4b所示(檢測方法同圖2的檢測)，用凍干粉LCR6013發酵48 h的玉米粉的 L-乳酸高效液相色譜圖，從圖4b中可看出L-乳酸占總乳酸的含量為93.0y。，圖4a為對照 樣的乳酸球菌的玉米發酵的L-乳酸含量，從圖4a可看出(檢測方法同圖2的檢測)，L-乳 酸占總乳酸的含量僅為18.80%。干燥物料水分控制12%以下。
實施例9 發酵酸奶的生產
按重量計，全脂奶粉12.5%、白糖8.5%、酸奶穩定劑0.3%，用生產用飲料水定容至
14刻度，均勻混合后，預熱至60 °C進行均質，冷卻至41 °C，按每噸奶中接入30 g的凍干粉， 于41 °C發酵5.0 h，發酵結束后酸奶的酸度達到65 °T, L-乳酸占總乳酸的含量達到91.5%。 凍干粉用氣流分裝機立即進行鋁塑包裝。用濕度為50 %的恒濕空氣將凍干粉的溫度恢 復到常溫，在濕度為50~60%的環境中，用氣流包裝機進行鋁塑包裝，氣流分裝機所用的 無菌干燥空氣的濕度不應高于20%，保證了凍干粉不吸潮。根據本發明制備的凍干粉活菌 數高，不易結塊、復水性很好。
權利要求
1、一種直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，其特征在于包括如下步驟和工藝條件第一步 將干酪乳桿菌鼠李糖亞種的凍干粉置于MRS培養基中，于28～30℃靜止培養24h～36h，制成母發酵劑；以重量份數計，所述MRS培養基配方為蛋白胨0.8～1.0份，酵母抽提物0.5～0.7份，葡萄糖1.5～2.0份，檸檬酸二銨0.1～0.2份，硫酸鎂0.048～0.058份，牛肉膏0.5～1.0份，磷酸氫二鉀0.1～0.2份，硫酸錳0.015～0.025份，乙酸鈉0.4～0.5份，吐溫800.1～0.3份，蒸餾水94.0～96.0份；攪拌溶解均勻后用0.08～0.10MPa滅菌15～20min，冷卻至28～30℃備用；第二步 以體積比為2～5∶100的比例，將母發酵劑接入工作發酵劑培養基中，于28～30℃靜止培養24h～36h，制成工作發酵劑；以重量份數計，所述工作發酵劑培養基配方為蛋白胨0.8～1.0份，酵母抽提物0.5～0.7份，葡萄糖1.5～2.0份，檸檬酸二銨0.1～0.2份，硫酸鎂0.048～0.058份，牛肉膏0.5～1.0份，磷酸氫二鉀0.1～0.2份，硫酸錳0.015～0.025份，乙酸鈉0.4～0.5份，吐溫800.1～0.3份，番茄汁6.0～8.0份，胡蘿卜汁4.5～6.0份，抗壞血酸0.02～0.04份和蒸餾水79.8～85.4份；攪拌溶解均勻后用0.08～0.10MPa滅菌15～20min，冷卻至28～30℃備用；第三步 以體積比為2～5∶100的比例，將工作發酵劑接入生產培養基中，于35～37℃下的發酵罐中進行培養，在培養過程用NaOH溶液調整pH為6.0～6.8，攪拌轉速為100～150rpm，培養16～24h后收集，得發酵菌懸液；以重量份數計，所述生產培養基配方組成為蛋白胨2.5～3.0份，酵母抽提物0.5～0.7份，葡萄糖1.5～2.0份，檸檬酸二銨0.1～0.2份，硫酸鎂0.048～0.058份，牛肉膏0.5～1.0份，磷酸氫二鉀0.1～0.2份，硫酸錳0.015～0.025份，乙酸鈉0.4～0.5份，吐溫800.1～0.3份，番茄汁6.0～8.0份，胡蘿卜汁4.5～6.0份，抗壞血酸0.02～0.04份，蒸餾水78.0～83.7份；攪拌溶解均勻后用0.08～0.10MPa滅菌15～20min，冷卻至35～37℃備用；第四步 將發酵菌懸液于5000～8000rpm，離心20～25min，舍棄上清液，收集菌泥；第五步 在菌泥中，按復合保護劑溶液的生理鹽水溶液與菌泥的體積比為3～5∶1加入復合保護劑溶液，混合均勻為保護劑懸浮液；以重量份數計，所述的復合保護劑溶液配方組成為海藻糖5～10份，脫脂奶粉5～10份，氯化鈉0.9份，蒸餾水79.1～89.1份，溶解后攪拌均勻，用0.08～0.10MPa滅菌15～20min，冷卻至常溫備用；第六步 將保護劑懸浮液置于淺盤中，在于-40℃～-65℃下預凍0.5h～2.0h，使保護劑懸浮液厚度為5～15mm；第七步 將第六步所得的保護劑懸浮液置于真空冷凍干燥機中，于冷阱溫度為-40℃～-65℃，真空度為1.3～13.0Pa，干燥18～20h，得凍干粉，凍干粉水分重量含量低于3％，活菌數達到1011～1012cfu/g；第八步 用濕度為50～60％的恒濕空氣將凍干粉的溫度恢復到常溫，在濕度為50～60％的環境中，用氣流包裝機進行鋁塑包裝，氣流分裝機所用的無菌干燥空氣的濕度不應高于20％。
2、 根據權利要求l所述的直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，其特征在于第三步工作發酵劑與生產培養基的體積比為3: 100。
3、 根據權利要求l所述的直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，其特征在 于所述第三步中NaOH溶液的濃度為l 2mol/L。
4、 根據權利要求l所述的直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，其特征在 于所述第三步中pH為6.8。
5、 根據權利要求l所述的直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，其特征在 于所述第五步中海藻糖為10份，脫脂奶粉為10份，氯化鈉為0.9份。
6、 根據權利要求l所述的直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，其特征在 于第一步或第二步的發酵溫度為30。C，培養時間為24h。
7、 根據權利要求l所述的直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，其特征在 于所述第三步發酵溫度為37。C。
8、 根據權利要求1所述的直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法，其特征 在于第六步的淺盤厚度為40 50mm。
全文摘要
本發明公開了一種直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉及其制備方法。該方法將干酪乳桿菌鼠李糖亞種經過“兩步法”擴大培養，盡量使細胞處于同步生長時期，然后在生產培養基中，用NaOH溶液在線控制pH為6.0～6.8，于35℃～37℃培養16h～24h，離心后收集菌泥，加入保護劑溶液，于-40℃～-65℃下預凍0.5h～2.0h，使其在容器壁上厚度為5～15mm，干燥制成直投式凍干粉。該凍干粉的活菌數達10¹¹～10¹²cfu/g，并具有復水性好、色澤好、流動性好、易于貯運、方便生產等特點。用該凍干粉可直接用于發酵生產醬腌菜、香腸、酸奶、L-乳酸、玉米粉、豆粕、花生粕和用作益生菌制劑等。
文檔編號A23L1/36GK101580809SQ20091004026
公開日2009年11月18日 申請日期2009年6月16日 優先權日2009年6月16日
發明者劉冬梅, 暉 吳, 湯石生, 蕾 邢 申請人:華南理工大學