專利名稱：：一種產生誘導多能干細胞的細胞類型及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及細胞領域，特別涉及一種可高效誘導產生誘導多能干細胞(iPS)的細胞類型及其制備方法和應用。
背景技術：
：干細胞(stemcells)是人體及其各種組織細胞的初始來源，其最顯著的生物學特征是既有自我更新和不斷增殖的能力，又有多向分化的潛能。干細胞根據不同的來源分為成體干細月包(somaticstemcells)和胚胎干細月包(embryonicstemcells,ES細胞)。成體干細胞包括骨髓間充質干細胞、胰腺干細胞、神經干細胞等成體組織中存在的。1981年,ES細胞的分離和培養首先在小鼠中獲得成功，是至今研究最廣泛、最成熟的干細胞體系。而人的干細胞的代始于1998年，美國威斯康辛大學(UniversityofWisconsin)科學家湯姆森(JamesA.Thomson)帶領研究團隊首次從人類胚胎組織中提取培養出胚胎干細胞(EmbryonicStemCell,ESCell)抹，并且證實此林細胞具有全能干細胞特征，此項研究論文發表在1998年11月6日出版的頂級學術期刊Science上面。(詳見Thomson,J.A"J.Itskovitz國Eldor,S.S.Shapiro,M.A.Waknitz,J.J.Swiergiel，V.S.Marshall,andJ.M.Jones."Embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts."Science282(1998):1145-1147。Thomson等人，從人胚泡中獲取胚胎干細胞系，科學，282(1998):1145-1147。)這篇論文標志著一個時代的到來，而湯姆森也被人稱作"干細胞研究之父"。hES(人胚胎干細胞)細胞研究的應用前景主要是再生醫學領域，在組織工程學領域中以hES細胞作為種子細胞，可為臨床上細胞、組織或器官的移植治療提供大量的材料。通過控制hES細胞分化培養環境、轉染能夠促進ES細胞定向分化的關鍵分子基因等體外誘導分化策略，可獲得特異性的組織細胞類型。這類細胞用于移植治療，將給糖尿病、帕金森氏病、脊髓損傷、白血病、心肌損傷、腎衰竭、肝硬化等疾病的治療帶來新的希望。然而，一直以來，hES細胞研究面臨著許多難題和爭議，主要包括以下幾個方面(l)供體卵母細胞的來源困難，hES細胞建系效率低。此外，SCNT技術的不成熟必將需要進一步耗費更多的人類卵母細胞，故而其來源難以得到保證。(2)免疫排斥反應,除非采用SCNT技術，否則患者對hES細胞分化而來的各種細胞和組織仍然存在免疫排斥反應。(3)hES細胞具有成瘤性，移植到受體的體內后有發展為腫瘤的可能性，即使采用SCNT技術、給移植細胞設置自殺基因等應對措施，也不一定能夠很好地解決這個問題(4)體外保持hES風險。同樣，慢病毒轉染技術可能也存在類似的風險。為避開hES細胞和治療性克隆研究的倫理學爭論，需要找到一種替代途徑,以便將人類的體細胞直接轉化為多潛能干細胞，為患者提供"個性化"的自體干細胞。2003年，Gurdon研究小組發現，將已完全分化的小鼠胸腺細胞或成人外周血淋巴細胞的細胞核注入爪蟾卵母細胞后，哺乳動物細胞核的分化標志物喪失,而哺乳動物干細胞中最具特征性的標志物Oct4則呈高表達，提示哺乳動物細胞核可直接被兩棲動物卵母細胞核泡所重構從而表達0ct4(ByrneJA等人，Nucleiofadultmammaliansomaticcellsaredirectlyreprogrammedtooct-4stemcellgeneexpressionbyamphibianoocytes.CurrBiol2003;13:1206-1213。ByrneJA等人,當代生物學，2003;13:1206-1213)。2006年，日本京都大學Yamanaka研究小組采用體外基因轉染技術，從24個因子中篩選出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4個轉錄因子，通過逆轉錄病毒將上述4個轉錄因子導入胚胎小鼠成纖維細胞或成年小鼠尾部皮膚成纖維細胞,在小鼠ES細胞的培養條件下獲得了Fbxl5+的多潛能干細胞系，該細胞系在細胞形態、生長特性、表面標志物、形成畸胎瘤等方面與小鼠ES細胞非常相似，而在基因表達語、DNA甲基化方式及形成嵌合體動物方面卻不同于小鼠ES細胞,故將其命名為誘導的多能性干細胞(iPS細胞)。Yamanaka研究小組利用相同的技術，將上述同樣的4個轉錄因子導入到人皮膚成纖維細胞中，也成功獲得了iPS細胞。原^人類成纖維細胞樣滑膜細胞和源自新生兒成纖維細胞的細胞系同樣也可^t重構成為iPS細胞。這類iPS細胞在細胞形態、增殖能力、表面抗原標志、基因表達譜、多潛能干細胞特異性基因的表觀遺傳學狀態、端粒酶活性等方面與hES細胞相似，并且在體外培養時和在小鼠體內畸胎瘤形成中均可分化為3個胚層的不同細胞類型(TakahasWKetal,Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Cell2007;131:861-872。TakahashiK等人，利用特定因子誘導成人成纖維細胞到多能干細胞，細胞，2007;131:861-872)。與此同時，威斯康辛大學Thomson研究小組也報道了成功誘導胎兒成纖維細胞轉化為具有hES細胞基本特征的人類iPS細胞，所不同的是他們使用慢病毒作為載體，并在14個候選基因中選擇了Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等4個基因進行轉導(YuJetal，Inducedphiripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells.Science2007;318:1917-1920。俞君英等人，從人的體細胞誘導成為多能干細胞系，科學，2007;318:1917-1920)。這一被學界稱為生物科學"里程碑"的重大突破有望幫助科學家繞過克隆技術的倫理、道德紛爭，為醫學應用打開大門。ParkIH等人(Reprogrammingofhumansomaticcellstopluripotencywithdefinedfactors.Nature2008;451:141-146。利用特定因子將人的體細胞重編程為多潛能細胞，自然，2008;451:141-146)利用來自胎兒、新生兒及成人的皮膚或肺部的原代成纖維細胞，其中包括來自1名健康男性皮膚活檢得到的成纖維細胞，采用Yamanaka研究小組的策略也獲得了相同的結果。他們還發現Oct4和Sox2在誘導重構為iPS細胞過程中是必需的，正是這兩個轉錄因子維持了人類iPS細胞的多潛能性，而Klf4和c-Myc的作用是改變染色質的結構，從而有利于Oct4和Sox2的結合，以提高誘導的效率。此外，這項研究的重要意義在于將取自皮膚活檢的成纖維細胞誘導為iPS細胞。上述研究表明，從活檢人類皮膚組服細胞移植治療中存在的免疫排斥反應。2008年10月，JuanCarlosIzpisiiaBelmonte領導的小組(JuanCarlosIzpisiiaBelmonteetal.Efficientandrapidgenerationofinducedpluripotentstemcellsfromhumankeratinocytes.NatureBiotechnology.2008.26:1276-1284;胡安.卡洛斯.伊茲皮索阿'貝爾蒙特等人，人的角質細胞可被高效快速地誘導為多能干細胞，自然-生物技術，2008.26:1276-1284)利用一根頭發上的角質細胞成功高效誘導出iPS細胞，大大推動了iPS的醫學應用進程。鑒于導入c-Myc基因可使嵌合體小鼠的腫瘤發生率高達20%,可能會阻礙其未來的臨床應用。因此，Yamanaka研究小組新近報道，小鼠和人類皮膚成纖維細胞轉染c-Myc以外的其余3個基因，在調整培養條件后也可得到iPS細胞。去除c-Myc基因盡管可使未來臨床應用的安全性顯著提高，但形成iPS細胞的效率卻明顯降低。雖然嵌合體小鼠在100天內沒有腫瘤發生，但逆轉錄病毒的再激活仍有導致腫瘤發生的潛在風險。同樣，慢病毒轉染技術可能也存在類似的風險。針對這一風險，科學家一直在努力尋找一種可以表達外源基因但外源基因非整合到基因組上的方法。2009年3月5日，Cell報道RudolfJaenisch研究小組利用Cre-重組酶系統使誘導成功的帕金森病人iPS細胞無外源因子，使iPS的臨床應用又推進了一步，但是這種方法的缺點是仍有載體存留在基因組中(RudolfJaenisch等人，帕金森病人來源的誘導多能干細胞無外源因子.細胞.2009.136:964-977)。隨后這一缺陷被另一組科學家克服。2009年3月26日，Science即出現俞君英等通過一種非整合質粒EpisomalVector成功誘導出無外源基因也無載體整合到基因組上的iPS(俞君英等人，無載體也無外源基因序列的人的誘導多能干細胞.科學.2009.324:797-801)。他們用一種叫做核轉染的方法將這些質粒介入到人包皮細胞中，在質粒中的基因所表達的蛋白質會將細胞重新編程并使其成為iPS細胞。這些iPS細胞在接著的幾輪細胞分裂中會開始失去7這些質粒，這樣研究人員就可以分離出不含質粒的細胞。這一發現非常重要，它是人們向iPS細胞的臨床應用邁出了關鍵性的一步。這一方法雖然臨床應用的安全性大大提高，但是重編程過程中培養條件有待優化。不同的細胞類型在重編程效率不同，相同的細胞類型在不同的培養條件下重編程效率也不同。重編程效率太低，在以后的研究中有待克服。盡管已經證明了病毒轉導一系列外源因子可以使得人的成纖維細胞的后生和轉錄狀態重置成多能胚胎干細胞(ES細胞)的狀態(TakahashiK,YamanakaS.Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Cell.2007;131:861-872。TakahashiK和YamanakaS等人，利用特定因子誘導成人成纖維細胞到多能干細胞，細胞，2007;131:861-872。YuJunying,JamesA.Thomsonetal,Science.2007;318:1917-1920;俞君英，湯姆森等人，從人的體細胞誘導成為多能干細胞系，科學，2007;318:1917-1920),并且隨著科學的發展，無外源因子整合到基因組和既無載體也無外源因子整合的基因組的人iPS技術出現(RudolfJaenisch等人，帕金森病人來源的誘導多能干細胞無外源因子.細胞.2009.136:964-977;),但是由人成纖維細胞得到的iPS細胞效率極低，整合型外源因子得到的iPS細胞的效率約0.01-0.02%;非整合型如俞君英最新的報道無外源因子也無載體序列插入基因組得到的iPS的效率更低，約百萬分之三到六。于是人們開始尋找具有更高重編程能力的細胞類型，2008年10月，JuanCarlosIzpisiiaBelmonte領導的小組利用一根頭發上的角質細胞成功高效誘導出iPS細胞，報道稱其效率較成纖維細胞提高約100倍。
發明內容為克服上述誘導iPS效率極低的問題，本發明的第一個目的在于提供一種用可以高效產生誘導多能干細胞(iPS)的細胞類型，該細胞類型為骨膜細胞。本發明的第二個目的在于提供一種可高效誘導產生誘導多能干細胞(iPS)的細胞類型的誘導重編程方法，包括如下步驟(a)將包含多能性干細胞因子的cDNA導入骨膜細胞；(b)在適宜步驟(a)中所述的骨膜細胞生長的培養基上進行骨膜細胞培養。上述誘導重編程方法，還可以包括如下步驟(c)初步鑒定多能性干細胞克隆。優選的，上述步驟(a)中的cDNA通過病毒載體感染所述骨膜細胞。優選的，所述病毒載體為逆轉錄病毒載體。更優選的，所述逆轉錄病毒載體為pMX。優選的，上述步驟(a)中的多能性干細胞因子包括Sox2、Oct4和Klf4,其中，所述Sox2可以替換為Soxl,所述Klf4可以替換為Klf5或Klf2。所述多能性干細胞因子還包括C-myc、L-Myc或N-Myc中的任一種。更優選的，上述步驟(a)中的多能性干細胞因子為Sox2、Oct4、C-myc和Klf4。優選的，所述骨膜細胞為哺乳動物骨膜細胞。更優選的，所述骨膜細胞為人骨膜細胞。本發明的第三個目的在于，提供一種可高效誘導產生誘導多能干細胞(iPS)的細胞類型在經誘導重編程而產生多能性干細胞中的用途，特別是通過將多能性干細胞因子的cDNA導入骨膜細胞后骨膜細胞被誘導重編程為多能性干細胞的用途。上述多能性因子可以是任何來源的，優選為人的多能性因子以及其變體，如Sox2，NCBI登錄號為NM—003106.2;Oct4,NCBI登錄號為NM—002701.4;Klf4,NCBI登錄號為NM—004235.4;c-Myc,NCBI登錄號為NM—002467.3;Soxl,NCBI登錄號為NM—005986.2;Klf2,NCBI登錄號為NM—016270.2;Klf5，NCBI登錄號為NM—001730.3。C-Myc還可以被換為其突變體l-myc(登錄號為NM_001033081.1);或者n-Myc(登錄號為NM_005378.4)。與現有技術公開的其它可以被誘導為iPS的細胞不同，骨膜細胞不僅可以誘導形成iPS，而且誘導重編程的效率遠大于成纖維細胞，人骨膜細胞在轉錄人的四個外源因子Sox2，Oct4,Klf4,c-Myc后，可以高效誘導為iPS細胞，效率約為2.2%左右，與成纖維細胞相比效率提高超過IOO倍，略高于角質細胞；而且產生的這些誘導多能性干細胞多能性標記物的表達水平與人胚胎干細胞相近，同時外源因子沉默。這對于今后通過使用誘導的多能性細胞，而非直接從人體提取的胚胎干細胞，利用組織再生醫學建立疾病模型，進行藥物篩選，控制定向分化提供了更加有效且更加具有針對性的手段。本發明發現略高于已報道的角質細胞。圖1是顯孩i鏡下觀察骨膜細胞及其誘導得到的hES樣克隆形態圖；圖2是骨膜iPS細胞AP染色結果及誘導iPS細胞效率計算；圖3是骨膜iPShES標志物表達水平鑒定及外源因子表達水平檢測結果圖，圖3-A是骨膜iPS中人胚胎干細胞標志物(Oct4，Sox2,Nanog,Lin28,Sal14,TDGF1，DPPA4)的表達水平檢測結果圖；圖3-B是骨膜iPS中人胚胎干細胞標志物(Rexl,TERT，DPPA2，NODAL，LEFTY1)表達水平檢測結果圖；圖3-C是骨膜iPS中外源因子(Sox2，Klf4，Oct4,c-Myc)表達水平檢測結果圖。具體實施例方式l.定義和技術除非另外指明，本發明的實踐將使用分子生物學、微生物學、細胞生物學、免疫學和重組DNA的傳統技術，其屬于本領域技術范圍。參見分子克隆實驗指南，第3版(2002),Sambrook，Fritsch和Maniatis編著；現代分子生物學實驗方法(F.M.Ausubel等人編著(1987));酶學方法(AcademicPress,Inc.);PCR2:實用方法，M丄MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor編著，(1995);抗體，Harlow和Lane編著，(I988);動物細胞培養實驗室手冊，R丄Freshney編著，(1987);千細胞手冊，巻2,W.FrenchAnderson等人編著。本發明中使用的一些術語具有下列定義的含義在說明書和權利要求書中使用的，單數型"一個"，和"這個，，包括復數參考，除非上下文另有清楚的表述。例如，術語"(一個)細胞"包括復數的細胞，包括其混合物。所有的數字標識，例如pH、溫度、時間、濃度和分子量，包括范圍，都是10近似值，其以0.1的增量變動(+)或(-)。要了解，雖然不總是明確的敘述所有的數字標識之前都加上術語"約"。也要了解，雖然不總是明確的敘述，本發明中描述的試劑4義僅是示例，其等價物是本領域已知的。本發明所述的"誘導的多能性干細胞(iPS細胞)"是這樣的細胞，其在ES細胞培養條件下，與ES細胞在細胞形態、生長特性、表面標志物表達、移植到皮下可形成包含3個胚層組織細胞結構的畸胎瘤等方面與人ES細胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表達譜、染色質狀態等方面也與人ES細胞幾乎完全相似。本發明所述的骨膜細胞是來自哺乳動物的骨膜細胞，其來自骨膜。骨膜覆蓋骨表面，是一種非均質結締組織結構，具有骨受傷后促進骨形成的潛能。骨膜分為外部"纖維層(fibrouslayer)"和內部"生發層(cambiumlayer)"(或"成骨層")。纖維層含有成纖維細胞，而生發層則含有骨祖細胞。培養的骨膜細胞的形態學特征呈梭形錐形及多角形，作為成骨細胞特征的表形標志，富含堿性磷酸酶活性，合成I型膠原，表達骨鈣素和骨橋蛋白基因等典型特征。這些特征可作為成骨細胞的鑒定及其成骨作用和發揮代謝調節作用的評價標準。本發明所述的骨膜細胞可以來源于任何動物(包括人)，優選是哺乳動物，更優選是人。各種動物來源的骨膜細胞可以從動物中容易地分離，例如從新生小鼠中分離；或者從人骨相關手術后的骨廢棄物中分離得到；本發明所述的術語"誘導重編程"是指將體細胞去分化為多能性干細胞的過程。優選地，通過將維持干細胞多能性所需的多能性因子cDNA導入體細胞可以誘導體細胞去分化成為多能性干細胞(TakahashiK和YamanakaS等人，利用特定因子誘導成人成纖維細胞到多能干細胞.細胞2007;131:861-872;俞君英等人，從人的體細胞誘導成為多能干細胞系.科學.2007;318:1917-1920)。其中，優選地，所述的多能性因子包括Oct4、Sox2(任選地，Soxl)、C-myc(任選地L-Myc或N-Myc),以及Klf4(任選地，Klf5或Klf2)。最優選地，所述多能性因子為Oct4、Sox2、C-myc以及Klf4。具體地，所述多能性因子為Sox2,NCBI登錄號為NM_003106.2;Oct4，NCBI登錄號為NMJ)02701.4;Klf4，NCBI登錄號為NM—004235.4;c-Myc,NCBI登錄號為NM—002467.3;Soxl，NCBI登錄號為NM—005986.2;Klf2,NCBI登錄號為NM—016270.2;Klf5，NCBI登錄號為NM—001730.3。C-Myc還可以被換為其突變體L-myc(登錄號為NM_001033081.1);或者N-Myc(登錄號為NM—005378.4)。將所述多能性因子cDNA導入體細胞的方法可以是本領域技術人員熟知的多種技術，包括病毒感染、脂質體轉染、電穿孔、粒子轟擊等各種將DNA轉入細胞的方法。優選地，使用包含cDNA的病毒載體進行轉染，所述病毒載體包括慢病毒載體、逆轉錄病毒載體等多種病毒載體。優選地逆轉錄病毒載體(例如pMX載體)，如實施例中所述的。本發明所述的"適宜被導入多能性干細胞因子cDNA的骨膜細胞的生長條件"是本領域的常規干細胞培養條件，并且包括一些適宜各個具體細胞系，但是不影響細胞基本性質的修飾，培養方法以及培養條件參見W.FrenchAnderson等人，干細胞手冊，巻2。本發明的用人骨膜細胞高效生成誘導的多能性干細胞的方案優選實施例的過程如下，圖1為骨膜細胞及其誘導得到的hES樣克隆形態；圖2為為骨膜iPS細胞AP染色結果及誘導iPS細胞效率計算；圖3為通過Real-Time的方法檢測骨膜iPShES標志物表達水平鑒定及外源因子表達水平。2.實施例為使本發明更加容易理解，下面將進一步闡述本發明的具體實施例。下列實施例舉例了發明人的標準實驗室實踐，用于示例本發明的模式，而不應將本發明理解為限定于這些實施例的范圍。這些實施例，根據本發明公開和本領域技術人員的普遍水平，技術人員將理解下列僅用于示例，可以在不超過本發明的范圍內進行各種變動、修飾和改造。其中所涉及的技術，除非特別說明，均是本領域技術人員熟知的分子生物學、細胞生物學、生物化學等各個12領域的常規技術。實施例1.細胞的制備和培養由外科手術得到廢棄物中分離骨膜，lxPBS洗滌一次，然后用外科手術剪將骨膜剪成約lmmS的小組織塊平鋪于60mm培養亞中，所述培養亞用0.1%的明膠(Gelatin)預包被處理。用高葡萄糖DMEM(Dulbcco'sModifedEagleMedium)培養基(4.5g/L的葡萄糖，HyClone公司)培養所得到的細胞，培養基中包含10%胎牛血清(HyClone公司)、非必須氨基酸(1%，Gibco)、2mML-谷氨酰胺(Gibco公司)、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100|ig/ml)。在多能干細胞誘導過程中使用人胚胎干細胞培養基。將人胚胎干細胞(hES)和用于擴增的誘導的多能干細胞(inducedpluripotentstemcells,iPS細胞)培養在用絲裂霉素(10|ig/ml)處理的MEF(小鼠胚胎成纖維細胞)上，并且培養在含20%血清替代物(KSR)的人胚胎干細胞培養基中。在純化RNA或DNA之前，去除滋養層細胞，在Matrigel上傳2代，此過程用mTeSRTMl(StemCell公司)培養。實施例2.病毒載體感染骨膜細胞根據實施例1所述的方法，在p6孔培養板中按每孔約6xl(^個細胞接種人的骨膜細胞，在37。C、5%(302的常規培養條件下培養過夜，用收集的病毒上清液感染培養的骨膜細胞。所述病毒上清液是通過用包含人Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的cDNA的反轉錄病毒pMX載體(Addgene公司)按常規方法轉染293T細月包(Lipofectamine2000，Invitrogen7厶司)獲^尋的(參見Sambrook,Fritsch和Maniatis,分子克隆實驗指南，第3版(2002))。實施例3.感染細胞的繼續培養和克隆篩選在感染后第2天，將感染后的骨膜細胞的培養基，替換為實施例1中所述的人胚胎干細胞培養基，在37。C、5%<:02的常規培養條件下培養7天，每天更換一次培養基，用0.25。/。胰蛋白酶-EDTA(Gibco)于37。C消化為單細胞懸液，將消化后的細胞按每培養亞約10000個細胞的密度接種到100mm培養皿中，所述培養jn按實施例l中描述的方法，預先用滋養層細胞包被。接種后的細胞在37°C、5。/。C02的常規培養條件下培養14天，顯微鏡;險可見ES樣克隆(如圖1所示)，其中A為骨膜細胞感染SKOM前的形態，B和B'為骨膜細胞在感染SKOM后26天在滋養層上形成典型的hES樣克隆形態，B'為B圖放大16倍后的形態，下同；C和C'為骨膜細胞hES樣克隆^^取至新的滋養層上傳代擴增仍保持很好的hES樣形態，該圖為傳代2代后的形態，使用KSR培養基；D和D'是骨膜細胞hES樣克隆在Matrigel預包被的6孔平板上生長形態，此處所用培養基為mTeSRTMl。使用玻璃針分割邊緣光滑，細胞核清晰，人胚胎干細胞樣的單個克隆(見圖1),然后用玻璃管吸取這些分割開的克隆接種到12孔板的單個孔中，每個孔接種一個ES樣克隆，一共4兆取12個。所述12孔板按實施例1中描述的方法，預先用滋養層細胞包被。接種后的細胞在KSR培養基中，37°C、5%(:02的常規培養條件下培養。這些挑取出的克隆具有典型的hES致密形態，在12孔板培養一周后，每孔選擇部分克隆進行AP染色，結果為100。/。AP染色陽性(圖2，未顯示所有克隆)其中，A圖是骨膜細胞感染SKOM26天后形成hES樣克隆，AP染色陽性。B圖是挑取hES樣克隆傳代擴增，培養一周后AP染色陽性；C和D分別為骨膜細胞感染SKOM34和38天后，將100mm培養皿AP染色，計數AP陽性克隆數目為分別219個和212個，第7天時向100mm培養皿共種下10000個SKOM感染的骨膜細胞，計算誘導iPS細胞效率分別為219/10000=2.19和212/10000=2.12%;E和F示例計數時選擇的克隆在顯樣M竟下的形態。AP染色后，依據克隆形態及AP結果對hES樣的克隆計數，我們這種方法的總體效率為大約2.2%,與傳統用成纖維細胞KSR培養基培養的0.01~0.02%的效率相比超過100倍，與角質細胞得到的效率相近。在這12個骨膜iPS克隆候選中，我們選擇了6個做進一步分析。實施例4.實時定量Real-TimePCR鑒定iPS中hES標志物的表達使用Trizol(Takara公司)試劑，按照制造商說明提取總RNA。用M-MLV(Takara公司)試劑盒進行逆轉錄，并使用SYBRPremixExTaq試劑盒(Takara公司)，ABI7300熒光定量PCR儀(ABI公司)進行Real-TimePCR。所有上述PCR條件均使用常規PCR條件，按照制造商說明進行。其中鑒定hES各標志物使用引物列表如表1所示，表1為鑒定hES標志物表達Real-TimePCR所用引物。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>如圖3-A,B所示，使用本申請的方法獲得的iPS表達與胚胎干細胞Hl均表iii目同的多能性因子，包括內源性的Oct4與Sox2，而這些因子在未經誘導的骨膜細胞中均沒有可檢測到的表達或較低表達。實施例5實時定量Real-TimePCR檢測iPS中外源因子的表達水平所有RNA提取及Real-TimePCR操作均同實施例4.檢測外源因子表達水平的Real-Time引物如表2所示。其中pMXRTFn2(SEQIDNO:38)為位于逆轉錄載體上的引物，hSox2exoRTRl(SEQIDNO:35)，hKlf4exoRTRl(SEQIDNO:36)，hOct4exoRTRl(SEQIDNO:34),hcMycexoRTRl(SEQIDNO:37)分別為位于四個外源因子SKOM上的引物。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>結果如圖3-C所示。由圖3-C可見，所選的6個iPS克隆在內源因子被激活之后，外源因子基本沉默，其中iPS-4，5,6接近完全沉默。最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。序列表<120>—種可高效誘導產生誘導多能干細胞(iPS)的細胞類型及其制備方法和應用<160>29<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>18<212>DNA<213>HsDPPA2-F<400>1gcctttttgatgcaagcc18<210>1<211>18<212>DNA<213>HsDPPA2-R<400〉2atgggaaaatgcaggcag18<210>1<211>18<212>DNA<213>HsDPPA4-Fl<400>3tggagaaggcaaaaggca18<210>1<211〉18<212>DNA<213>HsDPPA4-Rl<400〉4tgctgatgttcctggcaa<210>1<211>19<212〉DNA<213>HsFGF4-F<400>5tctatggctcgcccttctt<210〉1<211>19<212〉DNA<213>HsFGF4畫R<400>6aacatgccggggtacttgt<210>1<211〉18<212>DNA<213>HsGATA6-F<400>73acccgtgtgcaatgctt<210>1<211>19<212>DNA<213>HsGATA6-R<400〉8ttggagtcatgggaatgga<210>1<211〉20<212>DNA<213>HsLEFTYl-F<400>9ttggggactatggagctcag<210>1<211>19<212>DNA<213>HsLEFTYl-R<400>10agttctcggcccacttcat<210>1<211>17<212〉DNA<213>HsLI腦誦F<400>11gcggccaaaaggaaaga<210>1<211>18<212>DNA<213>HsL證8-R<400>12昭cttgcattccttggC31920191718<210>1<211>19<212>DNA<213>薩ODAL-F<糊>13tcctgttggggaggagttt<210>1<211〉18<212>DNA<213〉薩ODAL隱R<400〉14ttcactggggcacaacaa<210>1<211〉18<212>DNA<213>HsSALL4-F<400>15aagcaacatggctgcaca<210>1<211>18<212>DNA<213>HsSALL4-R<■>16ttattgttcgccccgtgt<210>1<211>1819181818<212>DNA<213〉HsTDGFl-F2<400>17tcctttggctgttttggc<210>1<211>19<212>DNA<213〉HsTDGFl-R2<400>18ccggc犯cteatcccagtt<210>1<211>18<212>DNA<213>HsTERT-F2<400〉19acatttttcctgcgcgtc<210>1<211〉19<212>DNA<213>HsTERT-R2<400>20tcagcttgagcaggaatgc<210〉1<211>20<212>DNA<213>hREXl-Fo說明書第19/21頁181918<400>21tcgctgagctgaaacaaatg20<210>1<211〉<212>DNA<213>hREXl-Re<400〉22cccttcttgaaggtttacac20<210>1<211>20<212>DNA<213>hNANOG-Fo<400>23tgaacctcagctacaaacag、20<210>1<211>20<212>DNA<213>hNANOG-Re<400>24tggtggtaggaagagtaaag20<210>1<211>18<212>DNA<213>hOct4exoRTRl<400>25ccaggtccgaggatcaac18<210>1<211>18<212>DNA<213>hSox2exoRTRl<400>26gggctgtttttctggttg<210>1<211>18<212>DNA<213>hKlf4exoRTRl<400>27ggaagtcgcttcatgtgg<210>1<211>20<212>DNA<213>hcMycexoRTRl<400〉28cctcgtcgcagtagaaatac<210>1<211>20<212>DNA<213>pMXRTFn2<400>29gggtggaccatcctctagac18182020權利要求1、一種可高效誘導產生誘導多能干細胞(iPS)的細胞類型，其特征在于，所述細胞類型為骨膜細胞。2、一種可高效誘導產生誘導多能干細胞(iPS)的細胞類型的誘導重編程方法，其特征在于，包括如下步驟(a)將包含多能性干細胞因子的cDNA導入骨膜細胞；(b)在適宜步驟(a)中所述的骨膜細胞生長的培養基上進行骨膜細胞培養。3、如權利要求2所述的誘導重編程方法，其特征在于，還包括如下步驟(c)初步鑒定多能性干細胞克隆。4、如權利要求2所述的誘導重編程方法，其特征在于，所述步驟(a)中的cDNA通過病毒載體導入所述骨膜細胞。5、如權利要求4所述的誘導重編程方法，其特征在于，所述病毒載體為逆轉錄病毒載體。6、如權利要求5所述的誘導重編程方法，其特征在于，所述逆轉錄病毒載體為pMX。7、如權利要求2所述的誘導重編程方法，其特征在于，所述步驟(a)中的多能性干細胞因子包括Sox2、Oct4和Klf4，其中，所述Sox2可以替換為Soxl,所述Klf4可以替換為Klf5或KlQ。8、如權利要求7所述的誘導重編程方法，其特征在于，所述多能性干細胞因子還包括C-myc、L-Myc或N-Myc中的任一種。9、如權利要求2所述的誘導重編程方法，其特征在于，所述步驟(a)中的多能性干細胞因子為Sox2、Oct4、Klf4和C-myc。10、如權利要求2所述的誘導重編程方法，其特征在于，所述骨膜細胞為哺乳動物骨膜細胞。11、如權利要求2所述的誘導重編程方法，其特征在于，所述骨膜細胞為人骨膜細胞。12、一種可高效誘導產生誘導多能干細胞(iPS)的細胞類型在經誘導重編程而產生多能性干細胞的用途。全文摘要本發明公開了一種可高效產生誘導多能干細胞(iPS)的細胞類型，該細胞類型為骨膜細胞。還公開了一種高效誘導產生誘導多能干細胞(iPS)的細胞類型的誘導重編程方法，包括如下步驟將包含多能性干細胞因子的cDNA導入骨膜細胞；在適宜培養基上進行骨膜細胞培養，還可初步鑒定多能性干細胞克隆。本發明還提供了一種高效誘導產生誘導多能干細胞(iPS)的細胞類型在經誘導重編程而產生多能性干細胞中的用途。本發明中，骨膜細胞可誘導形成iPS，而且與成纖維細胞相比，誘導重編程的效率提高超過100倍，效率約為2.2％左右，略高于角質細胞；為建立疾病模型，進行藥物篩選，控制定向分化提供了更加有效且更加具有針對性的手段。文檔編號C12N5/10GK101671650SQ20091004023公開日2010年3月17日申請日期2009年6月15日優先權日2009年6月15日發明者楊佳銀,秦大江,米蓋爾·埃斯特班,裴端卿申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院