專利名稱：：腺相關病毒載體及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物醫學領域，具體涉及一種具有抑制乙型肝炎病毒復制能力和肝癌細胞生長和轉移的腺相關病毒載體及其構建方法和應用。
背景技術：
：乙型病毒性肝炎是我國最主要的傳染病，據統計目前乙肝病毒攜帶者約1.5億，占全國總人口的百分之十以上。大量臨床和亞臨床乙肝患者的存在，不僅嚴重損害了人民群眾的身體健康，造成巨大的社會勞動力喪失及社會健康成本增加。同時，許多資料證實，乙肝病毒也是引起原發性肝細胞癌的主要原因之一。而肝細胞癌是預后最差的惡性腫癌之一，目前無有效的治療方法，五年生存率低于5%。乙肝疫苗的應用，對未感染乙肝病毒的人群起到了有效的保護作用，但對感染者無治療作用。目前對乙肝患者僅有的治療手段為a干擾素和類核苷物，"Lamivudine"和"Adefovirdipivoxil",但臨床效果仍不理想。siRNA現象為近年生物學上一革命性的發現，它通過特異性地與靶基因結合，選擇性抑制耙基因表達，從而干擾靶基因的功能。目前的研究證實，siRNA技術可以應用到許多病毒性疾病，如HBV、HCV,HIV等，干護L相關病毒的復制，以及腫瘤性疾病，如肝癌、鼻咽癌、肺癌等，或選擇性殺傷腫瘤細胞，增強機體的免疫能力，達到治療病毒性疾病或腫瘤的目的。乙型肝炎病毒為雙鏈DNA病毒，其基因物質相對于突變頻繁的HIV等病毒，十分保守，突變少。乙型肝炎病毒少突變的生物學特性特別適合siRNA治療。各國實驗室對乙肝病毒進行了大量的體外及動物體內siRNA抑制有效性研究，是利用siRNA干擾技術進行人體臨床試驗準備最充足的一個病毒。由于siRNA干擾在動物體內實驗的結果令人十分舞，加之目對病毒性疾病、腫瘤性疾病缺乏有效的治療措施，siRNA千擾技術纟皮廣泛應用于病毒性疾病及惡性紳瘤的治療方面，因此，僅在美國就有115家商業性公司從事siRNA方面的研究("www.researchandmarkets.com),在眾多公司中，Sirna、RNAiTechnologies、OligoEngine、Ambion和Stratagen為其中的i"交佼者。干擾素(interferon)的發現和研究已有五十多年的歷史。干擾素為脊推動物在外源性抗原的刺激下免疫系統所產生的一組糖蛋白。不同亞型干擾素對外源性抗原如病毒、病菌，內源性的腫瘤細胞有著不同程度的非特異性的殺傷和抑制作用，已被應用于臨床，并被證實是有效的。近年來，隨著高效干擾素(RECOMBINANTSUPERCOMPOUNDINTERFERON,rSIFN-co)的發現和其對病毒、腫瘤細胞的高效殺傷作用，引起醫學界對干擾素抗病毒和抗腫瘤的再認識。高效干擾素是根據不同類型干擾素氨基酸順序的保守性，人工產生的一種新的干擾素，有別于普通干擾素，可產生超強的抗病毒及抗腫瘤作用。目前在國內外都有高效干擾素進入臨床試驗階段。但都為利用基因工程技術在大腸桿菌等原核細胞中表達、進而純化的干擾素。腺相關病毒(AAV)載體是目前唯——個被美國食品和藥物管理局(FDA)批準可以用于臨床基因治療的載體，AAV載體最大的特點是不致病，十分安全；根據血清型的不同，可選^^性感染不同類型的組織或細胞；可以較長時間穩定表達所攜帶的基因；通常情況下重組的AAV以核外染色體形式存在，野生型AAV的整合部位也很清楚,不會誘發被感染的細胞癌變。但是，AAV載體的生產和純化技術復雜，要求很高的技術和經驗，較難推廣。因此，需要發明一種新的腺相關病毒載體以解決上述問題。
發明內容本發明的目的是提供一種ll^目關病毒載體，充分結合shRNA、a干擾素和腺相關病毒載體三方面的優勢，能夠抑制乙型肝炎病毒的復制能力和肝癌細胞生長和轉移。6本發明還提供了一種腺相關病毒載體的制備方法和應用。本發明提供了一種腺相關病毒載體，包括編碼針對乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的編碼基因shRNA和人工a干擾素編碼基因。作為本發明腺相關病毒載體的優選實施方式，所述的腺相關病毒的載體非選擇性或選擇性在肝組織或肝癌細胞中表達。作為本發明腺相關病毒載體的優選實施方式，所述的腺相關病毒的載體包括各種血清型，特別是1型、2型、8型及嵌合型。作為本發明腺相關病毒載體的優選實施方式，所述的編碼針對乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的編碼基因shRNA的序列為AGTAATTTTTGGAAA(SEQIDN0.2)或AAACTTTTTTGGAAA(SEQIDN0.3)。作為本發明腺相關病毒載體的優選實施方式，所述的人工a干擾素編碼基因的序列為atggccttgacctttgctttactggtggccctcctggtgctcagctgcaagtcaagctgctctgtgggctgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtaacaggagggccttgatcctcctggcacagatgaggagaatctctcccttctcctgcttgaaggacagacatgactttggatttccccaggaggagtttgacggcaaccagttccaaaaggctcaagctatctctgtcctccatgagatgatccagcagaccttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgcttgggatgagtctctcctagaaaaattctacactgaactctaccagcagctgaatgacctggaagcctgtgtgatacaggaagtgggggtggaagagactcccctgatgaacgtggactccattctggctgtgaaaaaatacttccaaagaatcactctctatctgactgagaagaaatacagcccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatctttttctttgtcaacaaacttgcaagaaagattaagaagaaaggaatga(SEQIDN0.5)或其互補序列。作為本發明腺相關病毒載體的優選實施方式，所述的人工a干擾素的氨基AQAISVLHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTEL(SEQIDN0.4)。本發明提供了一種腺相關病毒的載體的制備方法，包括如下步驟(1)設計合成抗乙型肝炎病毒的siRNA;(2)構建表達抗乙型肝炎病毒的siRNA的真核表達載體和病毒表達載體，在真核表達載體和病毒表達載體中表達抗乙型肝炎病毒的siRNA;(3)設計合成針對乙型肝炎病毒的a干擾素；(4)構建表達抗乙型肝炎病毒的a干擾素的真核表達載體和病毒表達載體，其特征在于采用可以在多種組織中表達的啟動子(包括人巨細胞病毒基因啟動子CMV或人延長因子基因thehumanelongationfactor啟動子，EFl)，選擇性在肝細胞中表達的啟動子(包括白蛋白Albumin基因啟動子)，以及選擇性在肝癌細胞中表達的啟動子(曱胎蛋白基因啟動子AFP),調控a干擾素非選擇性或選擇性在肝細胞、或肝癌細胞中表達；(5)將步驟(2)得到的抗乙型肝炎病毒的siRNA和步驟(4)得到的抗乙型肝炎病毒和肝癌細胞的a干擾素的基因與IM目關病毒的載體重組，得到抗乙型肝炎病毒的siRNA和抗乙型肝炎病毒及肝癌細胞的a干擾素的腺相關病毒載體。本發明涉及一種腺相關病毒載體在抑制乙肝病毒復制和肝癌細胞生長和轉移方面的應用，所述的腺相關病毒載體包括編碼針對乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的編碼基因(shRNA)和人工a干擾素編碼基因。本發明一種腺相關病毒載體在制備抗肝癌生長和轉移藥物的應用，所述的腺相關病毒載體包括編碼針對乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的編碼基因(shRNA)和人工a干擾素編碼基因。本發明一種腺相關病毒載體，充分結合shRNA、a干擾素和腺相關病毒載體三方面的優勢，能夠抑制乙型肝炎病毒的復制能力和肝癌細胞生長和轉移圖l為本發明腺相關病毒載體實施例l中含有千擾乙型肝炎病毒表面抗原表達的siRNA的表達盒的示意圖；圖2-1為本發明腺相關病毒載體實施例1中聯合表達針對HBVS抗原siRNA及人工a干擾素的腺相關病毒載體結構示意圖；圖2-2為本發明腺相關病毒載體實施例1中聯合表達針對HBVS抗原siRNA及人工a干擾素的另一個A泉相關病毒載體結構示意圖；圖2-3為本發明腺相關病毒載體實施例1中聯合表達針對HBVS抗原siRNA及人工a干擾素的另一個腺相關病毒載體結構示意圖；圖2-4為本發明腺相關病毒載體實施例1中聯合表達針對HBVS抗原siRNA及人工a干擾素的另一個腙4目關病毒載體結構示意圖；圖3為本發明腺相關病毒載體實施例3的Luc基因在肝區表達的示意圖。具體實施方式為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實施手冊中所述的條件。本發明中所用的"核酸"或"多核苷酸"是指任何長度的含嘌呤和嘧啶的聚合物，可以是多核糖核苷酸，可以是多脫氧核糖核苷酸，或是混合的多核糖-多脫氧核糖核苦酸。它包括單鏈和雙鏈分子，例如DNA-DNA,DNA-RNA和RNA-RNA雜合體，以及通過與氨基酸主鏈共軛堿基形成的"蛋白質核酸"(PNA)。它還包括含有修飾堿基的核酸。這里所用的核S臾序列的"互補序列"是指參與與原始序列沃森-克里克堿基配對的反義序列。本發明旨在構建一種含有針對乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的編碼基因(shRNA)順序和新型oc干擾素的腺相關病毒載體，賦予這種新型腺相關病毒9載體具有抑制乙肝病毒復制及抑制肝癌細胞生長和轉移的能力，以及構建該載體的具體方法和該載體的用途。實施例1構建本發明的腺相關病毒載體的方法1、能夠千擾乙型肝炎病毒表面抗原編碼基因表達的siRNA把序列的設計和篩選我們首先確定以19-22個堿基作為siRNA靶序列長度，篩選原則是能夠特異地與編碼乙型肝炎病毒表面抗原基因所轉錄mRNA配對并結合，并能夠選擇性使之降解，導致乙型肝炎病毒表面抗原基因表達產物下調及失活。我們根據乙肝病毒中表面抗原編碼基因的堿基順序，尋找了多個長度分別為19,20,21，22個堿基的乾序列。最有效的能夠干擾乙型肝炎病毒表面抗原表達的靶位點UUACUAGUGCCAUUUGUUC和siRNA序歹'J:AAUGAUCACGGUAAACAAG(SEQIDNO.l)。2、編碼干擾乙型肝炎病毒表面抗原表達的siRNA的人工基因的設計與合成為了讓siRNA能夠人工產生且穩定，我們采用了shRNA的方式。shRNA由編碼針對siRNA靶序列的正義和反義順序組成，在正義和反義順序間加入了與正義和反義順序不配對的堿基順序，我們選擇了7-9個堿基，使人工合成的siRNA編碼基因能夠自行折疊并配對，形成發卡樣結構，保證其穩定性。即shRNAl:SEQIDN0.2TAGTAATTTTTGGAAA)或shRNA2:SEQIDN0.3GTAAACTTTTTTGGAAA)。為了保證雙鏈shRNA順序能夠有效產生，我們除了設計編碼shRNA的人工基因順序，還在其3，端加入了終止信號，5，端加入了啟動子。我們分別采用了HI及U6RNA聚合酶III兩種不同的啟動子。我們在設計編碼shRNA的人工基因順序時還在shRNA順序與啟動子間加入了兩種不同順序的堿基，我們發現不同的堿基順序明顯影響shRNA的效率及其對靶基因表達的抑制作用。3、表達干擾乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的表達載體的構建。我們利用表達載體介導編碼shRNA的人工基因轉移，并在表達HBVS抗原的細胞內檢測shRNA的表達效率和功能。為了方便制備并穩定、高效產生shRNA，我們將編碼針對HBVS抗原的shRNA的人工基因插入到表達載體pSilencer3.1-H1及pSilencer2.1U6(Ambion公司商業產品)中，構建表達針對HBVS抗原的shRNA的表達載體pSilencer3.1-Hl-HBVSAg-shRNA及pSilencer2.1U6-HBVSAg-shRNA。為了鑒定表達載體產生siRNA干擾HBVS抗原表達的效率，我們同時共轉染編碼HBVS抗原的表達質粒和pSilencer3.1-Hl-HBVSAg-shRNA或pSilencer2.1U6-HBVSAg-shRNA。并以單獨轉染編碼HBVS抗原的表達質粒的細胞作為對照，ELISA檢測細胞培養液中HBVS抗原的表達水平，確定哪個siRNA順序及載體最有效，為后續構建腺相關病毒載體奠定J^出。4、構建并包裝單獨表達針對HBVS抗原siRNA的腺相關病毒。用限制性內切酶從已鑒定有功能的pSilencer3.1-Hl-HBVSAg-shRNA或pSilencer2.1U6-HBVSAg-shRNA載體上切下編碼針對HBVS抗原siRNA的完整表達盒，并插入到腺相關病毒穿梭質粒(pAAV-MCS,Stratagene公司商業產品)中，經酶切鑒定正確，并轉染培養細胞證實能表達siRNA并干擾HBVS抗原表達后，與編碼腺相關病毒rep和cap蛋白的質粒或腺病毒或單皰病毒一起轉染或感染包裝細胞，制備攜帶針對HBVS抗原siRNA的1型、2型、2/1嵌合型、以及8型重組腺相關病毒載體。5、設計新型人工ct干擾素蛋白順序。分析已知的各種人a干擾素的氨基酸順序，選出高度保守順序和變異順序，根據變異順序在不同干擾素中出現的頻率，確定變異順序用哪個氨基酸。設計新型人工a干擾素蛋白順序(SEQIDN0.4)如下6、設計新型人工ot干擾素編碼基因順序。在獲得新型人工a干擾素蛋白順序的基礎上，根據真核細胞對氨基酸編碼子的偏好，選擇編碼各氨基酸的密碼子，設計出編碼人工a干擾素基因的cDNA順序。為了便于人工oc干擾素分泌到生產細胞外，以擴大其作用和療效，人工a干擾素還包括了信號肽順序，使得細胞內產生的干擾素能夠源源不斷產生并自動轉移到細胞外發揮作用。也使得人工a干擾素生產細胞免受人工a干擾素的影響，可以長期存活。此外，為了提高人工a干擾素的轉錄和表達效率，我們還在人工基因的5，端加入了cozak順序。人工a干擾素編碼基因的cDNA序列為atggccttgacctttgctttactggtggccctcctggtgctcagctgcaagtcaagctgctctgtgggctgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtaacaggagggccttgatcctcctggcacagatgaggagaatctctcccttctcctgcttgaaggacagacatgactttggatttccccaggaggagtttgacggcaaccagttccaaaaggctcaagctatctctgtcctccatgagatgatccagcagaccttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgcttgggatgagtctctcctagaaaaattctacactgaactctaccagcagctgaatgacctggaagcctgtgtgatacaggaagtgggggtggaagagactcccctgatgaacgtggactccattctggctgtgaaaaaatacttccaaagaatcactctctatctgactgagaagaaatacagcccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatctttttctttgtcaacaaacttgcaagaaagattaagaagaaaggaatga(SEQIDN0.5)或其互補序列。7、人工合成全長oc干擾素基因。按上述方法設計出人工a干擾素基因的cDNA順序后，人工合成了全長a干擾素基因。為了便于進一步構建真核表達載體或腺相關病毒載體，我們在人工合成全長a干擾素基因時，還在其5，和3，端加入了限制性內切酶識別順序和保護i威基。8、構建表達人工a干擾素的真核表達載體并鑒定人工a干擾素的表達效率。將人工合成的a干擾素編碼基因順序插入到真核表達載體內，構建受CMV、EF1、Albumin、AFP、以及其他真核啟動子調控表達的人工a干擾素真核表達載體(圖2-1、2-2、2-3、2-4)。并將所構建的載體轉染培養的細胞，收集細胞培養液，ELISA檢測細胞培養液中是否含有a干擾素及a干擾素的含量，確定人工a干擾素編碼基因是否有效。9、構建并包裝單獨表達人工a干擾素的重組lM目關病毒載體。用限制性內切酶從人工ct干擾素真核表達載體上將人工a干擾素基因連同啟動子和polyA序列一同切下，將完整的人工oc干擾素基因表達盒插入到腺相關病毒穿梭載體上，構建含人工a干擾素基因的腺相關病毒載體，然后與編碼腺相關病毒rep和cap蛋白的質粒或腺病毒或單皰病毒一起轉染或感染包裝細胞，制備攜帶人工ot干擾素基因的l型、2型、2/l嵌合型、以及8型重組腺相關病毒載體。10、構建并包裝聯合表達針對HBVS抗原的siRNA及人工a干擾素的重組腺相關病毒載體。用限制性內切酶乂人人工a干擾素真核表達載體上將人工a干擾素基因連同啟動子和polyA序列一同切下，將完整的人工oc干擾素基因表達盒插入到表達能夠干擾乙型肝炎表面抗原表達的AAV載體中，構建聯合表達抗乙型肝炎病毒表面抗原siRNA和人工a干擾素基因的腺相關病毒載體，然后與編碼腺相關病毒rep和cap蛋白的質粒或腺病毒或單皰病毒一起轉染或感染包裝細胞，制備攜帶抗乙型肝炎病毒表面抗原siRNA和人工cc干擾素基因的1型、2型、2/l嵌合型、以及8型重組ll^目關病毒載體。實施例2不同的shRNA人工基因干擾乙型肝炎病毒表面抗原表達的效率存在差異。我們分別構建了以Hl或U6作為啟動子、攜帶編碼不同的、針對乙型肝炎病毒表面抗原編碼基因的siRNA的人工基因，即shRNAl:SEQIDN0.2TAGTAATTTTTGGAAA)或shRNA2:SEQIDN0.3GTAAACTTTTTTGGAAA)的真核表達載體，我們命名為pSilencer3.1陽Hl陽HBVSAg-shRNAl、pSilencer3.1隱Hl-HBVSAg畫shRNA2、pSilencer3.1-U6陽HBVSAg-shRNAl、pSilencer3.1-U6-HBVSAg-shRNA2。為了檢測兩種人工基因對乙型肝炎病毒表面抗原表達的干擾效率。我們利用脂質體，分別將2jtig編碼乙肝病毒表面抗原的表達質粒(陽性對照)，以及2pg編碼乙肝病毒表面抗原的表達質粒和2|ig編碼干擾乙肝病毒表面抗原表達的shRNA的表達質粒(實驗組)轉染培養在6孔板中的239細胞，分別于24及48小時后收集細胞培養液，ELISA檢測培養液中乙肝病毒表面抗原的含量。檢測結果如表1:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>0.412上述結果表明盡管siRNA的靶序列相同，但含有人工基因順序2(shRNA2)的表達質粒能更明顯抑制乙肝病毒表面抗原的表達，二種人工基因的抑制效果存在明顯差異。實施例3表達載體選擇性在肝臟內表達。采用水動力轉染(Hydrodynamictransfection)的方式，將溶于2ml生理鹽水內的20貼編碼螢火蟲熒光蛋白(Luc)報告基因的表達質粒從小白鼠尾靜脈注射,分別于24、48和96小時后，采用小動物成像系統觀察報告基因表達量和部位，可見Luc基因可在肝區高水平表達(見圖3)。實施例4攜帶編碼人工a干擾素基因的表達載體在體外培養的細胞中高水平表達人工a干擾素。由脂質體介導，將2貼編碼人工a干擾素基因的表達載體轉染培養在6孔板中的293細胞，分別于24及48小時后收集細胞培養液，ELISA才企測培養液中人工a干擾素的含量。檢測結果如表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>上述結杲表明編碼人工a干擾素基因的表達載體在體外培養的細胞中能高水平表達新型人工a干擾素。實施例5聯合表達針對HBVS抗原siRNA及人工a千擾素的表達栽體在體外抑制HBVS抗原表達并高水平表達a干擾素。由脂質體介導，分別將2pg編碼乙肝病毒表面抗原的表達質粒,以及2[ig編碼乙肝病毒表面抗原的表達質粒和2ng編碼干擾乙肝病毒表面抗原表達的siRNA的人工基因和人工a干擾素的表達質粒共轉染培養在6孔板中的239細胞，分別于24及48小時后收集細胞培養液，ELISA^r測培養液中乙肝病毒表面抗原和人工a干擾素的含量。檢測結果如表3、表4:表3HBVS抗原檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表4a干擾素含量檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>上述結果表明聯合表達針對HBVS抗原siRNA及人工a干擾素的表達載體在體外能抑制HBVS抗原表達并高水平表達a干擾素。實施例6聯合表達針對HBVS抗原siRNA及人工a干擾素的表達載體在體內抑制HBVS抗原表達并高水平表達a干擾素。采用水動力轉染的方式，分別將20叫編碼乙肝病毒表面抗原的表達質粒,以及20嗎編碼乙肝病毒表面抗原的表達質粒和20昭編碼千擾乙肝病毒表面抗原表達的siRNA的人工基因和人工a干擾素的表達質粒作小白鼠尾靜脈注射，分別于24及48小時后眼眶取血，分離血清，ELISA檢測血清中乙肝病毒表面抗原和人工a干擾素的含量。檢測結果如表5、表6:表5血清HBVS抗原檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表6血清a千擾素含量檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>20昭(1:4稀釋)最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。SEQUENCELISTING<120>腺相關病毒載體及其制備方法和應用<160>5<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>1aaugaucacgguaaacaag19<210>2<211>66<212>DNA<213>人工序列<400>2gatecccccttactagtgccatttgttcttcaagagagaacaaatggcactagtaatttt60tggaaa66<210>3<211>66<212>DNA<213>人工序列<400>3gatccgttactagtgccatttgttcttcaagagagaacaaatggcactagtaaac臓60tggaaa66<210>4<211>189<212>PRT<213>人工序列<400>4MetAlaLeuThrPheAlaLeuLeuValAlaLeuLeuValLeuSerCys1-51015LysSerSerCysSerValGlyCysAspLeuProGinThrHisSerLeu202530宏森源沛f川倩吳，黃>李，黃，GlyAsnArgArgAlaLeulieLeuLeuAlaGinMetArgArglieSer354045ProPheSerCysLeuLysAspArgHisAspPheGlyPheProGinGlu505560GluPheAspGlyAsnGinPheGinLysAlaGinAlalieSerValLeu65707580HisGluMetlieGinGinThrPheAsnLeuPheSerThrLysAspSer859095SerAlaAlaTrpAspGluSerLeuLeuGluLysPheTyrThrGluLeu100105110TyrGinGinLeuAsnAspLeuGluAlaCysVallieGinGluValGly115120125ValGluGluThrProLeuMetAsnValAspSerlieLeuAlaValLys130135140LysTyrPheGinArglieThrLeuTyrLeuThrGluLysLysTyrSer145150155160ProCysAlaTrpGluValValArgAlaGlulieMetArgSerPheSer165170175LeuSerThrAsnLeuGinGluArgLeuArgArgLysGlu180185<210>5<211>570<212>DNA<213>人工序列<400>5atggccttgacctttgctttactggtggccctcctggtgctcagctgcaagtcaagctgc60tctgtgggctgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtaacaggagggccttgatcctc120ctggcacagatgaggagaatctctcccttctcctgcttgaaggacagacatgactttgga180tttccccaggaggagtttgacggcaaccagttccaaaaggctcaagctatctctgtcctc240catgagatgatccagcagaccttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgcttgg300g3tgagtctctcctagaaaaattctacactgaactctaccagcagctga3tgacctggaa360gcctgtgtgatacaggaagtgggggtggaagagactcccctgatgaacgtggactccatt420ctggctgtgaaaaaatacttccaaagaatcactctctatctgactgagaagaaatacagc480ccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatcttUtctttgtcaacaaac540ttgcaagaaagattaagaagaaaggaatga570權利要求1、一種腺相關病毒載體，包括編碼針對乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的編碼基因的shRNA和人工a干擾素編碼基因。2、根據權利要求1所述的腺相關病毒的載體，其特征在于，所述的&i相關病毒的載體非選擇性或選擇性在肝組織或肝癌細胞中表達。3、根據權利要求1所述的腺相關病毒的載體，其特征在于，所述的腺相關病毒的人工a干擾素編碼基因由啟動子調控。4、根據權利要求3所述的^M目關病毒的載體，其特征在于，所述的啟動子為人巨細胞病毒基因啟動子(CMV)、人延長因子基因啟動子(EF1)、白蛋白Albumin基因啟動子或曱胎蛋白基因啟動子(AFP)。5、根據權利要求1所述的糾目關病毒的載體，其特征在于，所述的腺相關病毒的載體的血清型為1型、2型、8型或嵌合型。6、根據權利要求1所述的腺相關病毒的載體，其特征在于，所述的編碼針對乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的編碼基因shRNA的序列為AGTAATTTTTGGAAA(SEQIDNO.2)或AAACTTTTTTGGAAA(SEQIDN0.3)。7、根據權利要求1所述的^4目關病毒的載體，其特征在于，所述的人工a干擾素編碼基因的cDNA序列為atggccttgacctttgctttactggtggccctcctggtgctcagctgcaagtcaagctgctctgtgggctgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtaacaggagggccttgatcctcctggcacagatgaggagaatctctcccttctcctgcttgaaggacagacatgactttggatttccccaggaggagtttgacggcaaccagttccaaaaggctcaagctatctctgtcctccatgagatgatccagcagaccttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgcttgggatgagtctctcctagaaaaattctacactgaactctaccagcagctgaatgacctggaagcctgtgtgatacaggaagtgggggtggaagagactcccctgatgaacgtggactccattctggctgtgaaaaaatacttccaaagaatcactctctatctgactgagaagaaatacagcccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatctttttctttgtcaacaaacttgcaagaaagattaagaagaaaggaatga(SEQIDN0.5)或其互補序列。8、根據權利要求4所述的ll^目關病毒的載體，其特征在于，所述的人工a干擾素的氨基蔣列為MALTFALLVALLVLSCKSSCSVGCDLPRLRRKE(SEQIDN0.4)。9、根據權利要求1所述的腺相關病毒的載體，人工a干擾素編碼基因由不同啟動子調控，人工a干擾素編碼基因非選擇性或選擇性在肝組織或肝癌細胞中表達。10、一種腺相關病毒的載體的制備方法，包括如下步驟(1)設計合成抗乙型肝炎病毒的siRNA;(2)構建表達抗乙型肝炎病毒的siRNA的真核表達載體和病毒表達載體，在真核表達載體和病毒表達載體中表達抗乙型肝炎病毒的siRNA;(3)設計合成針對乙型肝炎病毒和肝癌細胞的a干擾素；(4)構建表達抗乙型肝炎病毒和肝癌細胞的a干擾素的真核表達載體和病毒表達載體，采用在多種組織中表達的啟動子、選擇性在肝細胞中表達的啟動子和選擇性在肝癌細胞中表達的啟動子，所述的啟動子調控a干擾素非選擇性或選擇性在肝細胞或肝癌細胞中表達；(5)將步驟(2)得到的抗乙型肝炎病毒的siRNA和步驟(4)得到的抗乙型肝炎病毒和肝癌細胞的a干擾素的基因與腺相關病毒的載體重組，得到抗乙型肝炎病毒的siRNA和抗乙型肝炎病毒及肝癌細胞的a干擾素的腺相關病毒載體。11、根據權利要求10所述的一種月^f目關病毒的載體的制備方法，其特征在于，所述的在多種組織中表達的啟動子為人巨細胞病毒基因啟動子CMV或人延長因子基因啟動子，選擇性在肝細胞中表達的啟動子為白蛋白Albumin基因啟動子，選擇性在肝癌細胞中表達的啟動子為曱胎蛋白基因啟動子AFP。12、一種腺相關病毒載體在制備抑制乙肝病毒復制的藥物的應用，所述的腺相關病毒載體包括編碼針對乙型肝炎病毒表面抗原編碼基因的shRNA和人工a千擾素編碼基因。13、一種腺相關病毒載體在制備抗肝癌生長和轉移藥物的應用，所述的腺相關病毒載體包括編碼針對乙型肝炎病毒表面抗原編碼基因的shRNA和人工a干擾素編碼基因。全文摘要本發明提供了一種腺相關病毒載體，包括能夠有效干擾乙型肝炎病毒表面抗原表達的靶位點及相關順序，編碼針對乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的編碼基因(shRNA)順序，人工a干擾素編碼基因和由不同啟動子調控人工a干擾素編碼基因的表達盒。該腺相關病毒載體，充分結合了shRNA、a干擾素和腺相關病毒載體三方面的優勢，能夠抑制乙型肝炎病毒的復制能力和肝癌細胞增殖。本發明還提供了一種腺相關病毒載體的制備方法和應用。文檔編號C12N15/86GK101643749SQ200910040168公開日2010年2月10日申請日期2009年6月11日優先權日2009年6月11日發明者吳沛宏,李川源,倩黃,黃亞森申請人:吳沛宏;黃亞森;李川源;黃倩