一種鎖核苷酸(lna)增敏的eb病毒熒光定量pcr試劑盒及其檢測方法和應用的制作方法

專利名稱：一種鎖核苷酸(lna)增敏的eb病毒熒光定量pcr試劑盒及其檢測方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種鎖核苷酸(LNA)增敏的EB病毒熒光定 量PCR檢測試劑盒及其檢測方法和應用，適用于各種組織、細胞、血液及其它體液中的EB病 毒核酸的定量檢測。
背景技術：
EB病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)是一種重要的感染人類的DNA病毒。EBV是 DNA病毒，屬皰疹病毒γ亞科，與單純皰疹病毒I型(HSV-I)和II型(HSV-2)、巨細胞病 毒(CMV)、水痘-帶皰疹病毒(VZV)和近年發現的人類第6型皰疹病毒同屬人類皰疹病毒 組，相互間在形態上難以區分，增殖方式也類似。EBV基因組全部核苷酸序列的測定已經完 成。該基因組是一雙鏈DNA分子，由170，000 175，000個堿基對(170 175kb)組成，在 細胞內可有兩種存在方式，即以線性分子的形式在一定部位插入細胞染色體DNA (稱為“整 合”)，或以環狀分子的形式游離于細胞DNA之外(稱為“游離體” episome)，類似于細菌的 質粒。這兩種形式可單獨存在或并存，但一般而言，若細胞內有完整的病毒，其基因組多為 整合型；若病毒潛伏，則其基因組多為游離型。基因組兩端有末端重復序列(TR)，可相互連 接形成環狀游離體。基因組內部包括4個內部重復序列(IRl IR4)和5個獨特區(Ul U5)。與EBV感染有關的疾病很多，重要的有傳染性單核細胞增多癥、NPC(鼻咽癌) 和鼻咽以外(例如肺、腮腺、鼻腔鼻竇、扁桃體、胃等處)的淋巴上皮瘤樣癌、鼻型結外NK/ T細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫病、Burkitt淋巴瘤、一些腸病型T細胞淋巴瘤、一些經 典Hodgkin淋巴瘤、一些外周T細胞和B細胞淋巴瘤以及器官移植后的淋巴組織增生癥 (PTLD)等等，特別是與鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)有密切關系。隨著近代 分子生物學的發展，對EBV感染的診斷，從原理到方法都得到了突飛猛進的發展。對病原的 測定(包括病毒分離、DNA雜交及PCR檢測)，由于操作要求高、設備及試劑昂貴等，應用受 到限制，目前EBV感染的血清學檢測指標主要包括血清EB病毒VCA/IgA，EA/IgA等抗體半 定量分析，是目前NPC篩查最常用的手段。但是上述檢測手段靈敏度和特異性低，且不能對 病人體內EB病毒感染的程度進行定量檢測。定量檢測患者血清或體液中EB病毒DNA拷貝 數，能夠準確反應患者EB病毒感染的嚴重程度，也能反映EBV相關腫瘤患者體內瘤荷，對于 腫瘤診斷與臨床分期，療效評價、病人預后等有較好的臨床意義。NPC是一種具有特殊臨床病理特征的惡性腫瘤，對放射治療敏感、易發生復發和遠 處轉移等。放療是NPC首選治療方法，但治療后完全緩解患者仍有約40% 50%出現遠處 轉移和局部復發而導致治療失敗。目前臨床監測NPC患者腫瘤轉移、復發的手段主要依靠 常規體檢，間接鼻咽纖維鏡、胸片(或胸部CT)、腹部B超(或腹部CT)、全身骨ECT等物理 和影像學檢查，但存在敏感性和特異性不足，檢查費用昂貴，發現不及時，原發性腫瘤和鼻 咽轉移性腫瘤鑒別困難等問題，因而尋找可以監測NPC治療后轉移、復發的標志物有現實
3的臨床意義。傳統上，用含病毒淋巴細胞涂片的間接免疫熒光法檢測EB病毒特異性抗體，目前 國外還在使用，主要是檢測VCA-IgA抗體和EA-IgA抗體，需使用熒光顯微鏡。中國自80 年代起，推廣使用了免疫酶法(EIA法)檢測VCA-IgA抗體和EA-IgA抗體，使基層實驗室 僅用普通顯微鏡就能開展檢測工作，這是目前國內的常用方法。這些傳統方法至今仍在大 多數實驗室使用。VCA-IgA檢測通常被用于篩查以排除NPC的診斷，靈敏度> 90%而特異 性< 70% ；相反的，EA-IgA檢測目前被用于NPC的確定性檢測，特異性> 90%而靈敏度 < 80%，兩者在NPC可疑病例診斷時有互補作用。對于NPC疑似病人，VCA-IgA其陰性預 測率達98%，可作為排除NPC的指標，僅有< 10%的假陰性率；VCA-IgA陽性結果由于有> 30%的假陽性率，故不作為充分的NPC預測，因此，陽性樣品通常用EA-IgA作進一步檢測， 兩種試驗陽性的結果可作為NPC結果預測，而VCA-IgA單獨陽性、EA-IgA陰性結果判定為 可疑診斷。因此，在血清學診斷NPC可疑病例時，VCA-IgA檢測通常被用于篩查以排除NPC 的診斷；而EA-IgA被用于預測NPC的確定性檢測。在人群篩查中，VCA-IgA陽性結果的健 康個體與患NPC風險的增加相關，而EA-IgA陽性結果或多種EBV抗體陽性的風險水平比前 者更高。EBV血清學診斷已用于NPC高危人群的篩查和對NPC可疑病例的診斷。它利用NPC 的一個特征，即患者多種EBV抗體的水平較非患者高。根據從70年代后期以來的研究結果， VCA-IgA和EA-IgA特異性的熒光免疫或酶免疫檢測方法被用于滿足不同的需要VCA_IgA 檢測有很高的靈敏度，但缺乏特異性，通常被用于篩查以排除NPC的診斷；相反的，EA-IgA 檢測特異性很高，但缺乏靈敏度，目前被用于NPC的確定性檢測，兩者在NPC可疑病例診斷 時有互補作用。隨著90年代分子生物學的發展，出現了采用不同EBV基因工程重組抗原的 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑，這些檢測方法各自有許多內在的優點，而且在結果判 定的客觀性上大大優于傳統方法。最近，通過不同抗原的聯合檢測，其診斷性能可進一步提 高。而EBV-DNA PCR檢測試劑一般用于預后判斷，有希望成為監測NPC治療后轉移、復發的 指標，因其靈敏度低，不適用于早期診斷。目前，EBV血清學檢測指標主要是檢測VCA-IgA抗 體和EA-IgA抗體，但由于這兩種抗體在體內的半衰期較長，即使體內EBV被清除，仍有較長 時間存在較高濃度，尚無證據顯示可作為監測NPC治療后轉移、復發的指標。上述方法大多數在實驗室水平上與傳統方法作比較，但只有很少的研究評估它們 在實際臨床和應用領域中的性能。Chan等研究表明EBNAl IgA ELISA和zta IgG ELISA 單獨使用時，比傳統方法的VCA-IgA有略低的敏感性，但特異性更高，而比EA-IgA有略低的 特異性，但敏感性更高；然而，當兩種新試驗聯合檢測時，比傳統方法能達到更可靠的血清 學診斷NPC的性能其陰性預測率達99. 1%，可作為NPC排除的有力指標，而陽性預測率達 87%,可作為NPC預測的有力指標。其綜合性能超過VCA-IgA和EA-IgA聯合檢測時的相應 預測值96%和89%。Cheng等進行的一項研究評估了新方法在人群篩查中的性能，研究表 明^NA IIgA,EBNA IIgG ELISA和zta IgG ELISA結合在一起檢測能用于NPC高發區健康 人群篩查的風險評估，檢測結果能把健康人群分為高風險、中度風險和低風險幾類高風險 人群占0.4%，其風險系數(RR) = 138 ；中度風險人群約占15%，其風險系數(RR) = 4 10 ；低風險人群的風險系數(RR) = 0. 3 0. 009。上述兩個研究證實新方法聯合檢測比單 獨使用效果更佳。
近年來有研究證實可以在NPC患者血清/血漿中檢測到腫瘤細胞的EBVDNA， Mutirangura等首次報導用巢式RT-PCR方法，在31 % NPC患者的血漿中檢測到EBV DNA0 國內多篇文獻報道，采用實時定量PCR技術，利用一對特異性引物和特異性熒光探針，結合 PCR技術和熒光檢測技術，實現對EBV病毒的定量檢測。鼻咽癌病人血清中EBV-DNA的拷貝 數與腫瘤負荷、轉移、治療反應等相關；血漿EBV-DNA水平是獨立于鼻咽癌 M分期的，可以 敏感預測病人生存預后的分子標志物；該標志物的檢測目前已經常規應用鼻咽癌病人的診 斷、療效檢測和預后，有希望成為監測NPC治療后轉移、復發的指標。因此，研制更加敏感的 EBV感染的血清學定量檢測診斷試劑乃當務之急。

發明內容
為克服上述技術缺陷，本發明的一個目的在于提供一種能快速、高敏感度的檢測 血清、血漿EBV-DNA的熒光定量PCR檢測試劑盒。本發明的一種鎖核苷酸(LNA)增敏的EB 病毒熒光定量PCR試劑盒，包括LNA (鎖核苷酸)-TaqMan熒光定量反應液、陽性對照樣品， 其中，LNA-TaqMan熒光定量反應液包括正向引物5，-AATTTT TTC TGC TAA GCC CAA CA-3，；反向引物5，-ACGGGT GGG TGT GTG TAG TGT-3，；LNA-TanMan 熒光探針5，-FAM-CCA CCA CAC CCA GGC-MGB3，。所述陽性對照樣品為包含所述EB病毒基因組片段的質粒DNA。本發明的第二個目的在于提供一種鎖核苷酸(LNA)增敏的EB病毒熒光定量PCR 檢測方法，包括如下步驟(1)熒光定量核酸擴增反應體系的配制在反應管中加入正向引物、反向引物和 LNA-TanMan熒光探針、模板DNA、2 X Taqman通用PCR反應混合液，增加ddH20至反應體系為 15 μ 1，混合均勻；(2)熒光定量核酸擴增將所述步驟(1)得到的混合溶液置于熒光定量反應儀上 進行反應；(3)反應結束后，將模板DNA的循環閾值C(t)與標準曲線對照，得到模板DNA中的 EB基因片段拷貝的濃度。所述的正向引物、反向引物和LNA-TanMan熒光探針的序列如下正向引物5，-AATTTT TTC TGC TAA GCC CAA CA-3，；反向引物5，-ACGGGT GGG TGT GTG TAG TGT-3'；LNA-TanMan 熒光探針5，-FAM-CCA CCA CAC CCA GGC-MGB3，。所述的正向引物、反向引物和LNA-TanMan熒光探針的終濃度均為20 μ Μ。上述的LNA-TanMan熒光探針中5'端標記熒光報告基團FAM，3 ‘端標記熒光淬滅 基團BHQl。反應條件為95°C熱啟動8分鐘預變性后；進入擴增循環95°C 30秒，55°C 45秒 循環40次。上述的鎖核苷酸(LNA)增敏的EB病毒熒光定量PCR試劑盒在EB病毒檢測、鼻咽 癌診斷治療、預后判斷、監測鼻咽癌治療后復發和轉移方面的應用。本發明以EB病毒的BamHI-W片段為目標檢測序列，采用LNA技術合成覆蓋EBV基 因BamHI-W核酸片段的鎖核苷酸序列探針，結合熒光定量PCR技術，研制一種快速、高度靈敏的檢測EBV基因熒光定量PCR試劑盒。與血清學檢測EB病毒VCA核EA抗體以及與常規熒光定量PCR檢測EBV-DNA基因 比較，本發明的鎖核苷酸(LNA)增敏的EB病毒熒光定量PCR試劑盒及其檢測方法適用于各 種組織、細胞、血液及其它體液中的EB病毒核酸的定量檢測，且具有以下優勢1、高度靈敏靈敏度達10個基因拷貝數每毫升檢測樣品，10倍優于普通熒光定量 PCR 法。2、檢測時間短，從標本送檢到得出結果可在12個小時以內完成。3、操作過程簡單，并且從PCR反應開始，就是在封閉的體系中完成擴增和實時測 定，大大降低了污染的可能性，因此也就降低了結果偏差的幾率(比較如下所示)。4、本發明的試劑盒和方法對標本DNA獲取的質量要求較低，無論是血清、血漿、石 蠟組織還是新鮮組織，都能取得理想的檢測結果。5、檢測的樣本量大，一次實驗最多可檢測384例。6、安全整個體系中不包含有毒有害物質，對操作員和環境都無危害。本發明的新一代EBV-DNA熒光定量PCR檢測試劑盒，利用目前最先進的鎖核苷酸 技術，使EBV-DNA的定量檢測靈敏度較普通的定量PCR提高10-100倍，一方面，可以用于鼻 咽癌診斷治療、預后判斷、監測鼻咽癌治療后復發和轉移等臨床應用；另一方面可以通過動 態檢測患者體內EBV-DNA水平，評價病人體內EBV感染的程度，從而評價病人免疫力變化動 態。在本發明中提供的兩端都標有熒光發光基團的特異性熒光探針，在探針完整時， 兩基團在空間結構上距離相互靠近，5'端報告基團發出的熒光因為熒光共振能量轉移 (FRET)而被3'端淬滅基團淬滅，所以體系中沒有熒光信號的變化。而一旦它與突變后的 模板特異性的結合，其結合位點在兩條引物之間，隨著引物的延伸，Taq DNA聚合酶在鏈延 伸過程中遇到與模板相結合的探針，其5' -3'外切酶活性就會將探針切斷，熒光報告基 團遠離熒光淬滅基團，這樣就破壞了兩熒光基團之間的FRET，報告基團所釋放出來的熒光 就可以被內置在定量檢測儀內的熒光計檢測到。PCR每經過一個循環，熒光信號也和目的片 段一樣，有一個同步指數增長的過程，熒光信號的強弱就代表了模板DNA的拷貝數的多少。 因此本發明不僅可用于簡單的定性檢測，亦可用做突變樣本具體含量的定量檢測。


圖1是本發明的熒光定量PCR試劑盒檢測鼻咽癌病人血漿EBV-DNA的重復性實驗 的結果圖；圖2為本發明的EBV-DNA熒光定量PCR試劑盒檢測檢測鼻咽癌病人血漿EBV-DNA 濃度的一個優選實施例的結果圖。
具體實施例方式為使本發明更加容易理解，下面將進一步闡述本發明的具體實施例。實施例1 熒光定量PCR試劑盒檢測鼻咽癌病人血漿EBV-DNA的重復性實驗本發明的鎖核苷酸(LNA)增敏的EB病毒熒光定量PCR試劑盒包括LNA(鎖核苷 酸)-TaqMan熒光定量反應液、陽性對照樣品，其中，LNA-TaqMan熒光定量反應液包括
正向引物5，-AATTTT TTC TGC TAA GCC CAA CA-3，；反向引物5，-ACGGGT GGG TGT GTG TAG TGT-3，；LNA-TanMan 熒光探針5，-FAM-CCA CCA CAC CCA GGC-MGB3，。陽性對照樣品為包含所述EB病毒基因組片段的質粒DNA。應用該試劑盒檢測EBV-DNA，按如下步驟進行(1)熒光定量核酸擴增反應體系的配制在反應管中加入正向引物 0. 15 μ 1 (20 μ Μ)、反向引物 0. 15 μ 1 (20 μ Μ)和 LNA-TanMan 熒光探針 0. 2 μ 1 (20 μ Μ)、模板 DNA2. 5 μ 1 (50ng/ μ 1) >2 X Taqman 通用 PCR 反應t昆合液(2氺Taqman universalPCR Master Mix，購自美國應用生物公司)7. 5 μ 1，增加ddH20至反應體系為15 μ 1，混合均勻；(2)熒光定量核酸擴增將所述步驟(1)得到的混合溶液置于熒光定量ΑΒΙ7900 檢測儀上進行反應；反應條件:95°C 8分鐘預變性；95°C 30秒，55°C 45秒，做40個循環。陽 性模板為EBV BamHl-W片段質粒克隆而成，并梯度稀釋成1 X 107、1 X IO6、1 X IO5和1 X IO4 拷貝/μ 1，每次PCR反應各梯度陽性模板均與樣本同時進行擴增，以繪制陽性標準曲線對 樣本定量(見圖1Α)。每次PCR反應均同時做多管陰性對照和空白對照。圖IA示EBV-DNA標準品擴增曲線，可以看到不同濃度標準品(分別為IX 107， 1Χ106，1Χ105，1Χ104拷貝/毫升)呈平行的標準S形擴增曲線，其結果可靠性達到 99. 98%。對5個不同樣品重復檢測；每個樣品同時進行5次重復，結果重復性很好；同時擴 增，結果存在顯著差異的為8% ；不同時間擴增，結果存在顯著差異的為6. 7% (圖1Β)。(3)反應結束后，將模板DNA的循環閾值C(t)與標準曲線對照，得到模板DNA中的 EB基因片段拷貝的濃度。實施例2 本發明的EBV-DNA熒光定量PCR試劑盒檢測檢測鼻咽癌病人血漿 EBV-DNA 濃度圖2為本發明的EBV-DNA熒光定量PCR試劑盒檢測檢測鼻咽癌病人血漿EBV-DNA 濃度的一個優選的結果圖，方法同實施例1中所述的方法。其中，圖2A顯示樣品擴增曲 線清晰，陰性對照無任何擴增；圖2B為對照用的標準曲線。PCR擴增結果用自動分析軟 件SDS (Version 2. 0)進行自動分析。血漿EBV-DNA定量結果按公式換算C = QX (Vdna/ Vpce) X (1/Vext)。其中C為待測血漿中EBV-DNA的濃度(拷貝/ml)，Q為PCR反應得到的 EBV-DNA濃度，Vdna為血漿抽提得到的DNA最終稀釋量，Vpce為加入反應體系的點樣量，Vext 為抽提DNA所用血漿體積。本發明的FQ-PCR法不僅是快速、高效的，而且其結果的判讀非常明確、直觀，結果 可靠、特異的。最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保 護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當 理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質 和范圍。序列表<110><120> 一種鎖核苷酸(LNA)增敏的EB病毒熒光定量PCR試劑盒及其檢測方法和應用
<160>3<170>PatentIn version 3. 2<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1aattttttct gctaagccca aca23<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2acgggtgggt gtgtgtagtg t21<210>1<211>15<212>DNA<213>LNA_TanMan 熒光探針<400>3ccaccacacc caggc1權利要求
一種鎖核苷酸(LNA)增敏的EB病毒熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括LNA(鎖核苷酸) TaqMan熒光定量反應液和陽性對照樣品，其中，LNA TaqMan熒光定量反應液包括正向引物5’ AAT TTT TTC TGC TAA GCC CAA CA 3’；反向引物5’ ACG GGT GGG TGT GTG TAG TGT 3’；LNA TanMan熒光探針5’ FAM CCA CCA CAC CCA GGC MGB 3’。
2.根據權利要求1所述的鎖核苷酸(LNA)增敏的EB病毒熒光定量PCR試劑盒，其特征 在于，所述陽性對照樣品為包含所述EB病毒基因組片段的質粒DNA。
3.一種鎖核苷酸(LNA)增敏的EB病毒熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，包括如下 步驟(1)熒光定量核酸擴增反應體系的配制在反應管中加入正向引物、反向引物和 LNA-TanMan熒光探針、模板DNA、2 X Taqman通用PCR反應混合液，增加ddH20至反應體系為 15 μ 1，混合均勻；(2)熒光定量核酸擴增將所述步驟(1)得到的混合溶液置于熒光定量檢測儀上進行 反應；(3)反應結束后，將模板DNA的循環閾值C(t)與標準曲線對照，得到模板DNA中的EB 基因片段拷貝的濃度。
4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的正向引物、反向引物和 LNA-TanMan熒光探針的序列如下正向引物5，-AAT TTT TTC TGC TAA GCC CAA CA-3，；反向引物5’ -ACG GGT GGG TGT GTG TAG TGT-3'；LNA-TanMan 熒光探針5’ -FAM-CCA CCA CAC CCA GGC-MGB3，。
5.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的正向引物、反向引物和 LNA-TanMan熒光探針的終濃度均為20 μ M。
6.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的步驟(2)的反應條件為95°C 熱啟動8分鐘預變性后；進入擴增循環95°C 30秒，550C 45秒循環40次。
7.權利要求1所述的鎖核苷酸(LNA)增敏的EB病毒熒光定量PCR試劑盒在EB病毒檢 測、鼻咽癌診斷治療、預后判斷、監測鼻咽癌治療后復發和轉移方面的應用。
全文摘要
本發明提供了一種鎖核苷酸(LNA)增敏的EB病毒熒光定量PCR試劑盒，包括LNA(鎖核苷酸)-TaqMan反應液和陽性對照樣品，正向引物5’-AATTTTTTCTGCTAAGCCCAACA-3’；反向引物5’-ACGGGTGGGTGTGTGTAGTGT-3’；LNA-TanMan熒光探針5’-FAM-CCACCACACCCAGGC-MGB3’。本發明還提供了一種鎖核苷酸(LNA)增敏的EB病毒熒光定量PCR檢測方法以及該試劑盒在EB病毒檢測、鼻咽癌診斷治療、預后判斷、監測鼻咽癌治療后復發和轉移方面的應用。本發明的試劑盒快速、靈敏度高、操作過程簡單、檢測的樣本量大、安全。
文檔編號C12Q1/70GK101899528SQ20091003980
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月27日 優先權日2009年5月27日
發明者石大陸 申請人:廣州達健生物科技有限公司