專利名稱：耐鹽生香酵母篩選方法
技術領域：
本發明屬于食品工業領域，特別是涉及一種耐鹽生香酵母的篩選方法和工藝。
背景技術：
醬油是以糧油和其副產品為原料，經過釀造工藝制成的，具有特殊色香味有助于 促進食欲的液體調味品，消費量非常大。醬油釀造時，利用微生物所分泌的多種酶對原料進 行協同作用，因而發酵工藝在醬油釀造中對醬油質量極為重要，發酵工藝的好壞，將直接影 響醬油的質量與原料利用率。發酵方法很多，目前基本上可以分為低鹽固態發酵及高鹽稀 態發酵兩類低鹽固態發酵工藝，由于發酵時間短，原料利用率低，成曲質量不理想，產品檔 次不高，口味、香味等遠不能滿足人們生活的需要。高鹽稀態發酵工藝克服了傳統作坊式 生產帶來的種種弊端及產品缺陷，在衛生保障、營養價值、口味色澤等方面均有超前的優越 性。我國目前市場上出售的醬油多以低檔產品為主，隨著人們生活水平的提高，人們越來越 注重醬油的風味以及營養價值，所以高鹽稀態發酵工藝無疑是醬油發酵工藝的所在趨勢， 而高鹽稀態發酵工藝首先需要有好的菌種，因而耐鹽生香酵母菌種選育與篩選工藝也就成 為制造高檔醬油產業的發展的關鍵工藝，是各個醬油企業以及各相關研究機構人們的研究 革:ο、目前全國90%以上的醬油釀造企業是用滬釀3. 042米曲霉菌種釀造醬油的，利用 米曲霉3. 042為出發菌種，誘變選育出一個適合現在我國普遍使用的高鹽稀態發酵工藝的 菌種，改變其遺傳結構和功能，通過篩選，從多種多樣的變異體中篩選出產量高、性狀優良 的耐鹽生香酵母菌種突變株，并且找出發揮這個突變株最佳培養基和培養條件。得到提高 醬油成曲中性蛋白酶活力、醬油成品總氮和氨基酸態氮的含量，提高釀造醬油的外觀、口味 等優良性能的耐鹽生香酵母菌種，且由于此工藝具有速度快、收效大、成本較低，方便可行， 因此具有巨大的市場應用前景。
發明內容
本發明的目的是針對傳統醬油生產中存在的諸多缺點，獲得一種具有高效生香耐 鹽酵母的篩選方法和工藝。本發明采取如下技術方案(1)出發菌種前培養，將米曲霉接入新鮮面，于30°C的培養箱中培養75°C，制備菌 懸液。(2)采用15W的紫外燈30cm處照射菌懸液，誘變菌種。(3)通過實驗確定了米曲霉菌種初篩所用的培養基為雙層酪蛋白平板、初篩選用 透明圈法，篩到比出發菌種優良的菌種。(4)將初篩獲得的菌種，模仿企業生產曲房，用塑料筐盛成曲，放在生產曲房與生 產成曲同步培養進行復篩，使實驗室方法與生產實際結合起來。(5)將得到酵母菌接入發酵培養基中經多次馴化培養，平板分離，使篩選菌種純化。
具體實施方式
；實施例一將米曲霉接入新鮮斜面，于30°C的培養箱中培養75h，到孢子成熟。制備菌懸液， 用滅菌后的生理鹽水洗下斜面孢子，倒入裝有玻璃珠的45ml滅菌后的生理鹽水中，振蕩使 孢子分散。取以上制備好的菌懸液5ml于直徑9cm的平皿中。紫外燈打開預熱20min，以穩 定光波。將盛有菌懸液的平皿放置在離15W紫外線30cm處。打開皿蓋，暴露在紫外光下照 射5min的時間，邊照射邊攪拌，力求使細胞均勻吸收紫外線光波。提高突變率。取0. Iml經 紫外線照射后的菌懸液涂皿，并且以未經紫外線照射過的菌懸液作對照皿，培養后，挑取菌 落，以待篩選。取玻璃珠20-30粒，放入250ml三角瓶中，加入0. 85%生理鹽水50ml，塞上 棉塞，油紙包扎，常壓滅菌，冷卻后無菌操作。從待純化復壯的菌種斜面取一環孢子放入三 角瓶中，振蕩30min。取試管數支，每管加入9ml 0. 85%生理鹽水，塞上棉塞，油紙包扎，經 0. IMPa 20min滅菌。冷卻后進行梯度稀釋，最后制成不同濃度的抱子懸浮液。通過實驗確定 了米曲霉菌種初篩所用的培養基為雙層酪蛋白平板、初篩選用透明圈法，保證k值和菌落 直徑都相對有優勢，篩選到比出發菌種優良的菌種。再將用透明圈法初篩出來的菌種，進行 三角瓶擴大培養，為了跟生產上相似的條件可以進行一次三角瓶擴大培養，32°C 72小時時 間培養，然后接黃豆、面粉制成成曲，檢測蛋酶活力，以塑料筐盛成曲，成曲厚68mm或34mm， 放在曲池上與生產成曲同步培養，使復篩得來的耐鹽生香酵母性蛋白酶活力都較出發菌種 高。將得到酵母菌接入發酵培養基中經多次馴化培養，平板分離，使篩選菌種純化，通過性 能檢測，即得到最佳耐鹽生香酵母菌種。實施例二將米曲霉接入新鮮斜面，于31°C的培養箱中培養73h，到孢子成熟。制備菌懸液， 用滅菌后的生理鹽水洗下斜面孢子，倒入裝有玻璃珠的45ml滅菌后的生理鹽水中，振蕩使 孢子分散。取以上制備好的菌懸液6ml于直徑9cm的平皿中。紫外燈打開預熱23min，以 穩定光波。將盛有菌懸液的平皿放置在離15W紫外線30cm處。打開皿蓋，暴露在紫外光下 照射5min的時間，邊照射邊攪拌，使細胞均勻吸收紫外線光波，提高突變率。取0. 15ml經 紫外線照射后的菌懸液涂皿，并且以未經紫外線照射過的菌懸液作對照皿，培養后，挑取菌 落，以待篩選。取玻璃珠20-30粒，放入250ml三角瓶中，加入0. 85%生理鹽水50ml，塞上 棉塞，油紙包扎，常壓滅菌，冷卻后無菌操作。從待純化復壯的菌種斜面取一環孢子放入三 角瓶中，振蕩30min。取試管數支，每管加入IOml 0. 85%生理鹽水，塞上棉塞，油紙包扎，經 0. IMPa 20min滅菌。冷卻后進行梯度稀釋，最后制成不同濃度的抱子懸浮液。通過實驗確 定了米曲霉菌種初篩所用的培養基為雙層酪蛋白平板、初篩選用透明圈法，保證k值和菌 落直徑都相對有優勢，篩選到比出發菌種優良的菌種。將用透明圈法初篩出來的菌種，進行 三角瓶擴大培養，為了跟生產上相似的條件可以進行一次三角瓶擴大培養，32°C 75小時培 養，然后接黃豆、面粉制成成曲，檢測蛋酶活力，以塑料筐盛成曲，成曲厚68mm或34mm，放在 曲池上與生產成曲同步培養，使復篩得來的耐鹽生香酵母性蛋白酶活力都較出發菌種高。 將得到酵母菌接入發酵培養基中經多次馴化培養，平板分離，使篩選菌種純化，通過性能檢 測，即得到最佳耐鹽生香酵母菌種。
實施例三將米曲霉接入新鮮斜面，于33°C的培養箱中培養70h，到孢子成熟。制備菌懸液， 用滅菌后的生理鹽水洗下斜面孢子，倒入裝有玻璃珠的45ml滅菌后的生理鹽水中，振蕩使 孢子分散。取以上制備好的菌懸液5ml于直徑9cm的平皿中。紫外燈打開預熱25min，以穩 定光波。將盛有菌懸液的平皿放置在離15W紫外線30cm處。打開皿蓋，暴露在紫外光下照 射一定的時間，邊照射邊攪拌，力求使細胞均勻吸收紫外線光波。提高突變率。取0.3ml經 紫外線照射后的菌懸液涂皿，并且以未經紫外線照射過的菌懸液作對照皿，培養后，挑取菌 落，以待篩選。取玻璃珠20-30粒，放入250ml三角瓶中，加入0. 85%生理鹽水50ml，塞上 棉塞，油紙包扎，常壓滅菌，冷卻后無菌操作。從待純化復壯的菌種斜面取一環孢子放入三 角瓶中，振蕩35min。取試管數支，每管加入9ml 0. 85%生理鹽水，塞上棉塞，油紙包扎，經 0. 15MPa 20min滅菌。冷卻后進行梯度稀釋，最后制成不同濃度的抱子懸浮液。通過實驗確 定了米曲霉菌種初篩所用的培養基為雙層酪蛋白平板、初篩選用透明圈法，保證k值和菌 落直徑都相對有優勢，篩選到比出發菌種優良的菌種。將用透明圈法初篩出來的菌種，進行 三角瓶擴大培養，為了跟生產上相似的條件可以進行一次三角瓶擴大培養，30°C 80小時時 間培養，然后接黃豆、面粉制成成曲，檢測蛋酶活力，以塑料筐盛成曲，成曲厚68mm或34mm， 放在曲池上與生產成曲同步培養，使復篩得來的耐鹽生香酵母性蛋白酶活力都較出發菌種 高。將得到酵母菌接入發酵培養基中經多次馴化培養，平板分離，使篩選菌種純化，通過性 能檢測，即得到最佳耐鹽生香酵母菌種。實施例四將米曲霉接入新鮮斜面，于34°C的培養箱中培養68h，到孢子成熟。制備菌懸液， 用滅菌后的生理鹽水洗下斜面孢子，倒入裝有玻璃珠的48ml滅菌后的生理鹽水中，振蕩使 孢子分散。取以上制備好的菌懸液8ml于直徑9cm的平皿中。紫外燈打開預熱30min，以穩 定光波。將盛有菌懸液的平皿放置在離15W紫外線28cm處。打開皿蓋，暴露在紫外光下照 射一定的時間，邊照射邊攪拌，力求使細胞均勻吸收紫外線光波。提高突變率。取0. Iml經 紫外線照射后的菌懸液涂皿，并且以未經紫外線照射過的菌懸液作對照皿，培養后，挑取菌 落，以待篩選。取玻璃珠20-30粒，放入250ml三角瓶中，加入0. 85%生理鹽水60ml，塞上 棉塞，油紙包扎，常壓滅菌，冷卻后無菌操作。從待純化復壯的菌種斜面取一環孢子放入三 角瓶中，振蕩30min。取試管數支，每管加入9ml 0. 85%生理鹽水，塞上棉塞，油紙包扎，經 0. 15MPa 15min滅菌。冷卻后進行梯度稀釋，最后制成不同濃度的抱子懸浮液。通過實驗確 定了米曲霉菌種初篩所用的培養基為雙層酪蛋白平板、初篩選用透明圈法，保證k值和菌 落直徑都相對有優勢，篩選到比出發菌種優良的菌種。將用透明圈法初篩出來的菌種，進行 三角瓶擴大培養，為了跟生產上相似的條件可以進行一次三角瓶擴大培養，32°C 75小時時 間培養，然后接黃豆、面粉制成成曲，檢測蛋酶活力，以塑料筐盛成曲，成曲厚68mm或34mm， 放在曲池上與生產成曲同步培養，使復篩得來的耐鹽生香酵母性蛋白酶活力都較出發菌種 高。將得到酵母菌接入發酵培養基中經多次馴化培養，平板分離，使篩選菌種純化，通過性 能檢測，即得到最佳耐鹽生香酵母菌種。
權利要求
一種耐鹽生香酵母篩選方法，其特征在于利用米曲霉3.042為出發菌種，誘變選育篩選得到適應高鹽稀態發酵工藝的優良菌種。
2.根據權利要求1所述的一種耐鹽生香酵母篩選方法，其特征在于所述的誘變選育 是采用15W的紫外燈在30cm處照射菌懸液而誘變菌種。 根據權利要求1所述的一種耐鹽生香酵母篩選方法，其特征在于所述的篩選工藝 中初篩是用培養基為雙層酪蛋白平板，用透明圈法，得到比出發菌種優良的菌種。
根據權利要求1所述的一種耐鹽生香酵母篩選方法，其特征在于所述的復篩是將 初篩獲得的菌種，模仿企業生產曲房，用塑料筐盛成曲，放在生產曲房與生產成曲同步培養 進行的。 根據權利要求1所述的一種耐鹽生香酵母篩選方法，其特征在于所述的耐鹽生香 酵母菌種是將復篩的酵母菌接入發酵培養基中經多次馴化培養，平板分離，使篩選菌種純 化而得到的。
全文摘要
本發明為一種耐鹽生香酵母篩選方法及其工藝，本發明是高鹽稀態發酵制造醬油工藝中，誘變選育米曲霉3.042出發菌種，通過篩選得到適應高鹽稀態發酵工藝的優良菌種，其方法是采用15W的紫外燈30cm處照射菌懸液而誘變菌種，用透明圈法，初篩到比出發菌種優良的菌種，再通過放在生產曲房與生產成曲同步培養進行復篩，最后將酵母菌經多次馴化培養，平板分離，使篩選菌種純化，得到優質耐鹽生香酵母。
文檔編號C12N15/01GK101831386SQ200910037818
公開日2010年9月15日 申請日期2009年3月11日 優先權日2009年3月11日
發明者余遂賢, 元耿僑, 吳瓊, 朱漢湖, 楊錫沛 申請人:開平市調味品技術創新中心