專利名稱：：一種低產蛋白酶a的啤酒酵母的篩選方法
技術領域：
：本發明涉及一種低產蛋白酶A啤酒酵母的篩選方法，屬于生物與發酵工程領域。
背景技術：
：純生啤酒的泡沫穩定性衰減問題已成為其質量保證的難題，同時又是世界范圍內的研究重點。由于純生啤酒是不經過熱處理而采用物理方式除菌，所以純生啤酒中含有啤酒酵母自身分泌的蛋白酶A，其可能消化有助于啤酒泡沫穩定性的蛋白質，同時產生沒有起泡性能的多肽，導致最終成品啤酒中泡沫穩定性變弱。蛋白酶A對啤酒泡沫的負面影響已經引起國內外許多研究者的研究興趣，尤其在國內純生啤酒高速發展的情況下，殘留在啤酒中的蛋白酶A的活性問題更引起人們的重視。通過以下三種途徑可以降低蛋白酶A對純生啤酒泡沫的影響第一種途徑是工藝控制，限制酶的產生和分泌。酵母在處于不利的生理條件下時蛋白酶A分泌會增多，例如氮缺乏、高乙醇濃度、高二氧化碳含量、高的滲透壓。控制好這些工藝條件，可以有效地降低蛋白酶A在發酵液中的活性，從而減少在成品酒中的活性。第二種途徑是用抑制劑對啤酒進行后修飾。通過添加酵母蛋白酶A的抑制劑抑制發酵結束后已分泌的蛋白酶A活力，從而降低蛋白酶A在貨架期對啤酒泡沬穩定性的影響，例如，中國發明專利申請CN101298586A所公開的一種降低啤酒發酵過程中蛋白酶分泌量的方法。第三種途徑是通過遺傳育種的方法選育低產蛋白酶A啤酒酵母菌株，主要包括基因工程技術及誘變育種、雜交育種等方法，例如，中國發明專利申請CN1948462A所公開的一種啤酒酵母工程菌及其制備方法與應用。通過工藝控制，增加工藝來實現對酵母分泌蛋白酶A活性的控制，增耗人力物力。通過添加抑制劑降低蛋白酶A活性，目前的研究還比較少，并不是很成熟。在啤酒釀造時，只有選用產蛋白酶A活性低的酵母菌株，才能從根本上解決純生啤酒泡沫衰減問題。因此選育低產蛋白酶A菌種對于改善純生啤酒泡沬性能至關重要。無論是應用常規的物理和化學誘變方法還是通過基因工程的方法，最終都將涉及到從改造后的菌株中分離出低產蛋白酶A菌株的問題。
發明內容本發明的目的在于提供一種低產蛋白酶A啤酒酵母的篩選方法。蛋白酶A是酵母中目前所知的唯——種在酸性pH范圍內水解酸變性血色素(acid-denaturedhemoglobin)的酶，本發明利用蛋白酶A的這一特性從大量的誘變菌中篩選出產蛋白酶A低的酵母菌落，從而將上游的菌株改造技術與最終的菌株分離獲得結合起來，在菌體經過改造處理后，快速地分離獲得目的菌株，減少選育過程的盲目性，增強預見性，提高育種效率。本發明所述的低產蛋白酶A啤酒酵母的篩選方法，包括以下步驟(1)將被篩選啤酒酵母菌株涂布YPD平板，28'C培養2-3天；(2)挑選生長旺盛的菌落接種至甘油平板，28。C培養3天，激活蛋白酶A活性；(3)將酸變性血紅蛋白覆蓋液均勻倒于甘油平板，37。C放置2-3天；(4)在甘油平板中加入三氯醋酸平鋪，根據水解圈大小判斷蛋白酶A的酶活高低，將水解圈小的菌株篩選出來，獲得要篩選的目標菌株。其中，所述YPD平板的成分為2%(w/v)葡萄糖；2%(w/v)蛋白胨；1%(w/v)酵母浸粉；2%(w/v)瓊脂。所述甘油平板的成分為2%(w/v)甘油；1%(w/v)蛋白胨；1%(W/V)酵母浸粉；2%(W/V)瓊脂。所述酸變性血紅蛋白覆蓋液的成分為1.5%(w/v)瓊脂；0.3%(w/v)，pH值為3.0的酸變性血紅蛋白；0.22%(v/v)TritonX-100;0.05M,pH值為4.5的磷酸二氫鉀緩沖液。所述三氯醋酸的濃度為10%(v/v)，添加量優選為1-2ml。所述酸變性血紅蛋白覆蓋液通過以下步驟制得A.配制0.1M,pH值為3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖液；B.配制3°/。(w/v)的血紅蛋白溶液，用4M的HC1溶液調節pH值至1.0，放置1.5小時并同時在紫外燈下照射30-40分鐘后，用O.IM的NaOH溶液調節pH值至3.0，然后用步驟A所制得的甘氨酸-鹽酸緩沖液進行稀釋，制得in/。(w/v)，pH值為3.0的酸變性血紅蛋白溶液；C.配制0.05M，pH值為4.5的磷酸二氫鉀緩沖液，121'C下滅菌15min;D.將瓊脂粉、Triton-X100溶解于0.05M，pH值為4.5的磷酸二氫鉀緩沖液中，煮沸至瓊脂溶解，然后冷卻(但不要凝固)；E.將步驟B所制得的酸變性血紅蛋白溶液與步驟D所制得的混合溶液按照體積比為3:7的比例混合均勻。在本發明中，被篩選啤酒酵母菌株可以是經過基因修飾的或者未經基因修飾自然篩選的啤酒酵母。在本發明中，各種溶液的制備均使用經過反滲透處理的去離子水。本發明所述的低產蛋白酶A啤酒酵母的篩選方法可應用于純生啤酒的釀造。4本發明所述的低產蛋白酶A啤酒酵母的篩選方法，能夠從經過菌株改造的大量酵母菌中快速而高效地獲得低產蛋白酶A的酵母菌株，因而減少了選育過程的盲目性，增強了預見性，提高了育種效率。該方法的建立為工業發酵生產低產蛋白酶A的酵母菌株的改造和篩選提供了有效手段，在啤酒發酵工業中具有廣闊的推廣和應用前景。具體實施例方式實施例l:酸變性血紅蛋白覆蓋液的制備配制O.IM，pH值為3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖液稱取3.75gGly，2.97gNaCl，定容到500ml;配制0.1MHCL溶液200ml;取配好的HCl溶液89ml,Gly-NaCl溶液411ml，混勻；將pH計的電極插入所配溶液中，用0.1MNaOH溶液微調pH至3.0。配制1%(w/v),pH值為3.0的酸變性血紅蛋白溶液稱取0.3g血紅蛋白溶于10ml蒸餾水中，用4MHCl溶液調pH至1.0;放置1.5h,放置的同時在紫外燈下照30-40分鐘，滅菌；再用0.1MNaOH溶液調pH至3.0;調好后用所制得的甘氨酸-鹽酸緩沖液補足體積到30ml，備用。配制0.05M，pH值為4.5的磷酸二氫鉀緩沖液稱取3.403gKH2P04，定容至500ml，此時的pH值約為4.58，用HCl調pH至4.50，121。C下滅菌15min。將1.5g瓊脂粉，220ulTriton-XlOO溶于70ml0.05MpH值為4.5的磷酸二氫鉀緩沖液中，水浴加熱煮沸至瓊脂溶解，然后冷卻，但不要凝固。最后，將該溶液與30ml酸變性血紅蛋白溶液混合均勻，即制得酸變性血紅蛋白覆蓋液。實施例2選取啤酒企業分離得到的6號啤酒酵母，對其進行誘變。誘變后的菌液涂布YPD平板，每板約100個菌落，28'C培養2-3天，至菌落可見；挑取生長旺盛的菌落轉移至甘油平板培養3-4天，激活蛋白酶A活性；將10ml酸變性血紅蛋白覆蓋液均勻倒于甘油平板，覆蓋菌落，37'C放置2-3天；在甘油平板中加入lml濃度為10°/。(v/v)的三氯醋酸平鋪。觀察菌落周圍產生的透明水解圈，篩選水解圈小于6號啤酒酵母出發菌株的5株誘變菌株。對篩選出的誘變菌株進行發酵培養挑取上述篩選出的菌種一環；接入10mL麥汁培養液中，28'C培養24小時；再將活化好的試管中菌液全部接入裝有300mL無菌麥汁的三角瓶中，用發酵栓密封，12。C發酵9天，每天稱重，記錄每日失重量，當單日失重量在0,2克以內表明發酵結束。待發酵結束后，檢測發酵液蛋白酶A活力。實施例3對購于中國食品發酵工業研究院微生物菌株平臺(CICC)的啤酒酵母1894進行誘變。5誘變后的菌液涂布YPD平板，每板約100個菌落，28。C培養2-3天，至菌落可見；挑取生長旺盛的菌落轉移至甘油平板培養3-4天，激活蛋白酶A活性；將10ml酸變性血紅蛋白覆蓋液均勻倒于甘油平板，覆蓋菌落，37'C放置2-3天；在甘油平板中加入lml濃度為10%(v/v)的三氯醋酸平鋪。觀察菌落周圍產生的透明水解圈，篩選水解圈小于啤酒酵母1894出發菌株的4株誘變菌株。對篩選出的誘變菌株進行發酵培養挑取上述篩選出的菌種一環；接入10mL麥汁培養液中，28。C培養24小時；再將活化好的試管中菌液全部接入裝有300mL無菌麥汁的三角瓶中，用發酵栓密封，12'C發酵9天，每天稱重，記錄每日失重量，當單日失重量在0.2克以內表明發酵結束。待發酵結束后，檢測發酵液蛋白酶A活力。實施例4對自中國食品發酵工業研究院釀酒部獲取的釀酒酵母菌株yy進行誘變處理，此酵母菌株具備低產蛋白酶A的性質。誘變后的菌液涂布YPD平板，每板約100個菌落，28'C培養2-3天，至菌落可見；挑取生長旺盛的菌落轉移至甘油平板培養3-4天，激活蛋白酶A活性；將10ml酸變性血紅蛋白覆蓋液均勻倒于甘油平板，覆蓋菌落，37i:放置2-3天；在甘油平板中加入lml濃度為10%(v/v)的三氯醋酸平鋪。觀察菌落周圍產生的透明水解圈，篩選水解圈小于釀酒酵母yy出發菌株的3株誘變菌株。對篩選出的誘變菌株進行發酵培養挑取上述篩選出的菌種一環；接入10mL麥汁培養液中，28。C培養24小時；再將活化好的試管中菌液全部接入裝有300mL無菌麥汁的三角瓶中，用發酵栓密封，12t:發酵9天，每天稱重，記錄每日失重量，當單日失重量在0.2克以內表明發酵結束。待發酵結束后，檢測發酵液蛋白酶A活力。實施例5:蛋白酶A活力的檢測方法取1500pL磷酸氫二鉀一檸檬酸緩沖液(pH=5.3)于一玻璃試管中，加入1368jiL去離子水，加入待測樣品120nL，最后加入12pLlmM熒光底物。試樣混合均勻，放入30°C水浴鍋中，反應30min后，放入8(TC滅活5min，快速冷卻到室溫，用熒光分光光度計測量熒光強度，激發波長XeF328nm，發射波長Xen^393nm。待測樣品先進行除氣(成品啤酒)或者先經雙層濾紙過濾(發酵液)，空白樣品為去離子水。蛋白酶A活力以熒光值計算。蛋白酶A活力降低率按照以下公式計算出發菌株酶活的相對值=出發菌株的酶活力值一空白酶活力值誘變菌株酶活的相對值=誘變菌株的酶活力值一空白酶活力值誘變菌株酶活的降低率(％)=(出發菌株酶活的相對值一誘變菌株酶活的相對值)/出發菌株酶活的相對值X100%按照上述檢測方法，分別對實施例2、3、4中所篩選得到的誘變菌株的蛋白酶A活力進行檢測，并分別計算其蛋白酶A活力降低率，計算結果見表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>檢測結果表明，本發明所述的低產蛋白酶A啤酒酵母的篩選方法，能夠從經過誘變處理的大量酵母菌中快速而高效地篩選出低產蛋白酶A的酵母菌株。權利要求1、一種低產蛋白酶A啤酒酵母的篩選方法，包括以下步驟(1)將被篩選啤酒酵母菌株涂布YPD平板，28℃培養2-3天；(2)挑選生長旺盛的菌落接種至甘油平板，28℃培養3天，激活蛋白酶A活性；(3)將酸變性血紅蛋白覆蓋液均勻倒于甘油平板，37℃放置2-3天；(4)在甘油平板中加入三氯醋酸平鋪，根據水解圈大小判斷蛋白酶A的酶活高低，將水解圈小的菌株篩選出來，獲得要篩選的目標菌株。2、根據權利要求1所述的低產蛋白酶A啤酒酵母的篩選方法，其特征在于，所述酸變性血紅蛋白覆蓋液含有以下成分1.5%(w/v)瓊脂；0.3%(w/v)，pH值為3.0的酸變性血紅蛋白；0.22%(v/v)TritonX-100;0.05M，pH值為4.5的磷酸二氫鉀緩沖液。3、根據權利要求2所述的低產蛋白酶A啤酒酵母的篩選方法，其特征在于，所述酸變性血紅蛋白覆蓋液通過以下步驟制得A.配制0.1M，pH值為3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖液；B.配制3%(w/v)的血紅蛋白溶液，用4M的HCl溶液調節pH值至1.0，放置1.5小時并同時在紫外燈下照射30-40分鐘后，用O.IM的NaOH溶液調節pH值至3.0，然后用步驟A所制得的甘氨酸-鹽酸緩沖液進行稀釋，制得1%(w/v)，pH值為3.0的酸變性血紅蛋白溶液；C.配制0.05M，pH值為4.5的磷酸二氫鉀緩沖液，121。C下滅菌15min;D.將1.5%(w/v，以終體積計算)瓊脂粉、0.22%(v/v，以終體積計算)Triton-X100溶解于0.05M，pH值為4.5的磷酸二氫鉀緩沖液中，煮沸至瓊脂溶解，然后冷卻；E.將步驟B所制得的酸變性血紅蛋白溶液與步驟D所制得的混合溶液按照體積比為3:7的比例混合均勻。4、根據權利要求1所述的低產蛋白酶A啤酒酵母的篩選方法，其特征在于所述三氯醋酸的濃度為10%(v/v)，添加量為1-2ml。5、根據權利要求1至4的其中之一所述的低產蛋白酶A啤酒酵母的篩選方法，其特征在于所述被篩選啤酒酵母菌株是經過基因修飾的或者未經基因修飾自然篩選的啤酒酵母菌株。6、權利要求1所述的低產蛋白酶A啤酒酵母的篩選方法在釀造純生啤酒中的應用。全文摘要本發明公開了一種低產蛋白酶A啤酒酵母的篩選方法，包括以下步驟(1)將被篩選啤酒酵母菌株涂布YPD平板，28℃培養2-3天；(2)挑選生長旺盛的菌落接種至甘油平板，28℃培養3天，激活蛋白酶A活性；(3)將酸變性血紅蛋白覆蓋液均勻倒于甘油平板，37℃放置2-3天；(4)在甘油平板中加入三氯醋酸平鋪，根據水解圈大小判斷蛋白酶A的酶活高低，將水解圈小的菌株篩選出來，獲得要篩選的目標菌株。該方法能夠從經過菌株改造的大量酵母菌中快速而高效地獲得低產蛋白酶A的酵母菌株，減少了選育過程的盲目性，增強了預見性，提高了育種效率，在啤酒發酵工業中具有廣闊的推廣和應用前景。文檔編號C12N1/18GK101481661SQ200910036880公開日2009年7月15日申請日期2009年1月22日優先權日2009年1月22日發明者孔祥誠,宋緒磊,琳李,李惠萍,王德良申請人:廣州珠江啤酒股份有限公司