專利名稱：一種利用核酸檢測技術鑒別白酒真偽的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用核酸檢測技術鑒別白酒真偽的方法，屬于生物高技術領域。在 白酒防偽方面具有非常重要的意義。
二背景技術：
白酒是我國獨有的傳統產品，歷史悠久。近些年來，對白酒的需求量尤其是對名優 產品的需求量愈來愈大，如何鑒別真假名優白酒已受到人們的廣泛重視。目前白酒的防 偽主要采用在酒類產品的瓶口、瓶蓋、外包裝、標識、封口等處使用防偽包裝和防偽印 刷技術。這些防偽措施雖然起到一定的防偽作用，但與公眾的心理希望及市場管理的需 求都還有一定的距離。它們本身具有卓越的防偽功能，或者還有完善的電話、網絡系統 作為支持，但存在的核心問題是，這些技術實施的對象并不是酒品本身，而是酒品的身 外之物，相對于酒品而言，僅僅是附屬品或寄生物，與酒品并無直接的、內在的、必然 的聯系。它能起到的作用僅是為酒品制作了一套鐵甲和頭盔，當遇到狡詐險惡的制假者 采用偷梁換柱的方法，假酒真包裝時，這種僅是將防偽單元附加在防偽主題上，重表不 重里思維下的防偽策略，就必然會給制假者留下可乘之機，最終導致假冒偽劣產品攪亂 市場秩序。針對酒品本身的內涵防偽技術主要是利用紅外光譜、氣相色譜和質譜檢測技 術建立各種名優白酒的指紋圖譜，由于不同的白酒生產廠家所處的地域、氣候、微生物 環境、水質環境不同及生產工藝的差別，生產出的白酒的成份有所不同，根據這些成份 的不同采用紅外光譜、氣相色譜和質譜進行指紋的鑒定。這種內涵防偽技術需要事先建 立各種白酒的標準指紋圖譜，這就需要嚴格控制生產質量，保證不同批次之間的差異縮 小到最小，主要化學成份不發生變化。DNA防偽技術以其自然物質復雜編碼的特點和運 用專有技術能夠及時檢測鑒定但又無法復制和破譯的優勢，越來越受到防偽業的青睞， 被用作打擊假冒偽劣產品的銳利新武器。DNA防偽技術即可針對產品包裝也可針對產品 "自身"進行防偽，當其針對產品包裝進行防偽時同樣存在假酒真包裝的問題，因此本 發明采用向白酒中加入DNA,然后檢測白酒中加入的DNA,建立針對白酒"自身"的 內涵防偽技術，這種內涵防偽技術是專業防偽技術，能為各白酒生產廠家、各級質量監 督及市場監管部門提供技術支持，讓他們在維權執法中主動、迅速、準確的采取行動， 保護企業和消費者的合法權益。三
發明內容
技術問題
本發明的目的在于針對目前白酒防偽技術中存在的問題提供一種鑒別白酒真偽的方法。
技術方案
本發明提供一種利用核酸檢測技術鑒別白酒真偽的方法。 上述利用核酸檢測技術鑒別白酒真偽的方法為
(1) 向白酒中加入一種DNA溶液。
(2) 采用乙醇沉淀的方法提取酒中所加入的DNA。
(3) 以提取的DNA作為模板，以相應的引物進行PCR反應，取PCR產物7pL，采 用質量比2.0X的瓊脂糖凝膠含0.005XGOLDView， 0.5xTBE電泳緩沖液，120V恒壓電 泳40min,紫外燈下觀察電泳結果。
(4) 真偽鑒別標準電泳結果出現目的條帶且大小與所加入的DNA片斷設計值相符 即為真酒，不出現目的條帶或大小不相符即為假酒。
有益效果
本發明提供一種利用核酸檢測技術鑒別白酒真偽的方法。為各白酒生產廠家、各級 質量監督市及場監管部門提供技術支持，讓他們在維權執法中主動、迅速、準確的采取 行動，保護企業及消費者的合法權益。
四
圖1為加入短小芽孢桿菌CGMCCNo.2337基因組DNA的各種度數白酒樣品和不加 短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA的各種度數白酒樣品的PCR擴增產物電泳 檢測結果。M為DNA分子量標準(2000bp、 1000bp、 750bp、 500bp、 250bp、 100bp); 1為加入短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA的38°白酒；2為未加入短小芽孢 桿菌CGMCC No.2337基因組DNA的38°白酒；3為加入短小芽孢桿菌CGMCC No.2337 基因組DNA的45°白酒；4為未加入短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA的45 °白酒；5為加入短小芽孢桿菌CGMCCNo.2337基因組DNA的52。白酒；6為未加入 短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA的52°白酒;7為加入短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA的55°白酒；8為未加入短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組 DNA的55。白酒；9為加入短小芽孢桿菌CGMCCNo.2337基因組DNA的65°白酒；10為未加入短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA的65°白酒；11為短小芽孢桿 菌CGMCC No.2337基因組DNA樣品。 五具體實施例方式
實施例一以向白酒中加入雞基因組DNA為例鑒別白酒真偽
1按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明提取 雞肉中基因組DNA。
2向500mL白酒中加入lmg雞基因組DNA溶液。
3提取白酒中雞基因組DNA。
(1) 取含有雞基因組DNA的白酒40(^L置于1.5mL離心管中，加入3.0mol/L的醋酸 鈉溶液40pL，充分混勻。
(2) 加入90(VL冰冷的無水乙醇，再加入lmol/L的氯化鎂溶液14^L，充分混勻。然 后至于冰上lh。
(3) 0°C, 12000r/min，離心20min，回收雞基因組DNA。
(4) 用自動微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(5) 力[]70(^L的70^的乙醇，于4。C， 12000r/min，離心20min。
(6) 用自動微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(7) 將離心管于室溫下敞口放置在實驗臺上，直至殘留的液體揮干。
(8) 將雞基因組DNA沉淀溶于10pLpH 8.0的TE溶液中，充分漂洗管壁。
4以從酒中提取的雞基因組DNA為模板，以序列表中SEQ ID NO.l和SEQ ID N0.2 引物進行PCR反應，擴增目的條帶為261bp。
25nLPCR反應體系為2xPCRMix (天根生化科技有限公司)12.5pL， 1Opmol/L上、 下游引物各lpL，模板DNA5pL，補水至25^L。
循環參數為94°C，預變性5min。 94'C變性30s， 55。C退火30s, 72。C延伸lmin， 重復10個循環，每個循環退火溫度降0.5'C;然后94'C變性15s， 5(TC退火30s， 72'C延 伸lmin，重復20個循環；最后72'C延伸5min。
5取PCR產物7jiL，采用質量比2.0X的瓊脂糖凝膠含0.005XGOLDView， 0.5xTBE 電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳結果。電泳結果出現261bp的目 的條帶即為真酒，不出現目的條帶或大小不相符即為假酒。
實施例二以向白酒中加入大豆基因組DNA為例鑒別白酒真偽
1按照新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明提取大豆新
5鮮嫩葉片中的大豆基因組DNA。
2向500mL白酒中加入lmg大豆基因組DNA溶液。 3提取白酒中大豆基因組DNA。
(1) 取含有大豆基因組DNA的白酒400pL置于1.5mL離心管中，加入3.0mol/L的醋 酸鈉溶液40pL，充分混勻。
(2) 加入卯OpL冰冷的無水乙醇，再加入lmol/L的氯化鎂溶液14pL，充分混勻。然 后至于冰上lh。
(3) 0°C， 12000r/min，離心20min，回收大豆基因組DNA。
(4) 用自動微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(5) 加700fiL的70X的乙醇，于4。C， 12000r/min,離心20min。
(6) 用自動微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(7) 將離心管于室溫下敞口放置在實驗臺上，直至殘留的液體揮干。
(8) 將大豆基因組DNA沉淀溶于10pLpH8.0的TE溶液中，充分漂洗管壁。
4以從酒中提取的大豆基因組DNA為模板，序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID N0.4 引物進行PCR反應，擴增目的條帶為436bp 。
25pLPCR反應體系為2xPCRMix (天根生化科技有限公司)12.5pL， 1Onmol/L上、 下游引物各lpL，模板DNA5pL，補水至25tiL。
循環參數為94°C,預變性5min。 94卩變性30s， 55t)退火30s， 72'C延伸lmin， 重復10個循環，每個循環退火溫度降0.5。C;然后94'C變性15s， 5(TC退火30s， 72"C延 伸lmin，重復20個循環；最后72。C延伸5min。
5取PCR產物7nL，采用質量比2.0%的瓊脂糖凝膠含0.005%GOLDView， 0.5xTBE 電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳結果。電泳結果出現436bp的目 的條帶即為真酒，不出現目的條帶或大小不相符即為假酒。
實施例三以向白酒中加入酵母基因組DNA為例鑒別白酒真偽
1按照酵母基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明提取酵母基因組 DNA。
2向500mL白酒中加入IO嗎酵母基因組DNA溶液。 3提取白酒中酵母基因組DNA。
(1)取含有酵母基因組DNA的白酒400nL置于1.5mL離心管中，加入3.0mol/L的醋 酸鈉溶液40pL，充分混勻。(2) 加入900pL冰冷的無水乙醇，再加入lmol/L的氯化鎂溶液14pL，充分混勻。然 后至于冰上lh。
(3) 0°C， 12000r/min，離心20min，回收酵母基因組DNA。
(4) 用自動微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(5) 加700nL的70X的乙醇，于4。C， 12000r/min，離心20min。
(6) 用自動微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(7) 將離心管于室溫下敞口放置在實驗臺上，直至殘留的液體揮干。
(8) 將酵母基因組DNA沉淀溶于10pLpH8.0的TE溶液中，充分漂洗管壁。
4以從酒中提取的酵母基因組DNA為模板，以序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID N0.6引物進行PCR反應，擴增目的條帶為730bp 。
25pLPCR反應體系為2xPCRMix (天根生化科技有限公司)12.5pL, 1Onmol/L上、 下游引物各lpL，模板DNA5piL,補水至25iiL。
循環參數為94°C，預變性5min。 94。C變性30s， 55。C退火30s， 72。C延伸lmin， 重復10個循環，每個循環退火溫度降0.5。C;然后94。C變性15s， 50。C退火30s， 72。C延 伸lmin，重復20個循環；最后72。C延伸5min。
5取PCR產物7nL，采用質量比2.0%的瓊脂糖凝膠含0.005%GOLDView， 0.5xTBE 電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min,紫外燈下觀察電泳結果。電泳結果出現730bp的目 的條帶即為真酒，不出現目的條帶或大小不相符即為假酒。
實施例四以向白酒中加入短小芽孢桿菌CGMCCNo.2337基因組DNA為例鑒別白酒真 偽
1按照細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明提取短小芽孢桿 菌CGMCC No.2337基因組DNA。
2向500mL白酒中加入l昭短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA溶液。 3提取白酒中短小芽孢桿菌CGMCCNo.2337基因組DNA。
(1) 取含有短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA的白酒400^iL置于1.5mL離 心管中，加入3.0mol/L的醋酸鈉溶液40pL，充分混勻。
(2) 加入900pL冰冷的無水乙醇，再加入lmol/L的氯化鎂溶液14nL,充分混勻。然 后至于冰上lh。
(3) (TC， 12000r/min，離心20min，回收短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA。
(4) 用自動微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。(5) 力口 700nL的70%的乙醇，于4。C， 12000r/min，離心20min。
(6) 用自動微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(7) 將離心管于室溫下敞口放置在實驗臺上，直至殘留的液體揮干。
(8) 將短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA沉淀溶于lOpL pH 8.0的TE溶液 中，充分漂洗管壁。
4以從酒中提取的短小芽孢桿菌CGMCC No.2337基因組DNA為模板，以序列表中 SEQ ID NO.7和SEQ ID N0.8引物進行PCR反應，擴增目的條帶為U69bp 。
25pLPCR反應體系為2xPCRMix (天根生化科技有限公司)12.5pL, 1Onmol/L上、 下游引物各lpL，模板DNA5pL，補水至25nL。
循環參數為94°C,預變性5min。 94。C變性30s， 55。C退火30s, 72。C延伸lmin， 重復10個循環，每個循環退火溫度降0.5'C;然后94。C變性15s, 5(TC退火30s， 72'C延 伸lmin，重復20個循環；最后72'C延伸5min。
5取PCR產物7pL，采用質量比2.0X的瓊脂糖凝膠含0.005XGOLDView， 0.5xTBE 電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳結果。電泳結果出現1169bp的目 的條帶即為真酒，不出現目的條帶或大小不相符即為假酒。
實施例五以向白酒中加入犬細小病毒基因組DNA為例鑒別白酒真偽
1按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明提取犬細
小病毒基因組DNA。
2向500mL白酒中加入lpg犬細小病毒基因組DNA溶液。 3提取白酒中犬細小病毒基因組DNA。
(1) 取含有犬細小病毒基因組DNA的白酒400pL置于1.5mL離心管中，加入3.Omol/L 的醋酸鈉溶液40nL,充分混勻。
(2) 加入900nL冰冷的無水乙醇，再加入lmol/L的氯化鎂溶液14pL，充分混勻。然 后至于冰上lh。
(3) 0'C， 12000r/min,離心20min，回收犬細小病毒基因組DNA。
(4) 用自動微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(5) 加700iiL的70W的乙醇，于4。C， 12000r/min,離心20min。
(6) 用自動微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(7) 將離心管于室溫下敞口放置在實驗臺上，直至殘留的液體揮干。
(8) 將犬細小病毒基因組DNA沉淀溶于lOpLpH 8.0的TE溶液中，充分漂洗管壁。4以從酒中提取的犬細小病毒基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.9和SEQ ID NO.10 進行PCR反應，擴增目的條帶為448bp。
25laLPCR反應體系為2xPCRMix (天根生化科技有限公司)12.5pL， 10[imol/L上、 下游引物各1HL,模板DNA5pL，補水至25nL。
循環參數為94°C，預變性5min。 94'C變性30s， 55'C退火30s， 72'C延伸lmin， 重復10個循環，每個循環退火溫度降0.5'C;然后94。C變性15s， 50'C退火30s， 72'C延 伸lmin，重復20個循環；最后72'C延伸5min。
5取PCR產物7pL，采用質量比2.0%的瓊脂糖凝膠含0.005%GOLDView， 0.5xTBE 電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳結果。電泳結果出現448bp的目 的條帶即為真酒，不出現目的條帶或大小不相符即為假酒。
實施例六以向白酒中加入pUC57質粒DNA為例鑒別白酒真偽
1向500mL白酒中加入lng pUC57質粒DNA (Fermentas International Inc.)溶液。 2提取白酒中pUC57質粒DNA。
(1)取含有pUC57質粒DNA的白酒400pL置于1.5mL離心管中，加入3.0mol/L的 醋酸鈉溶液4(^iL，充分混勻。
(2〉加入900pL冰冷的無水乙醇，再加入lmol/L的氯化鎂溶液14pL，充分混勻。然 后至于冰上lh。
(3) 0'C， 12000r/min，離心20min，回收pUC57質粒DNA。
(4) 用自動微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(5) 力n 700laL的70X的乙醇，于4。C, 12000r/min,離心20min。
(6) 用自動微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(7) 將離心管于室溫下敞口放置在實驗臺上，直至殘留的液體揮干。
(8) 將pUC57質粒DNA沉淀溶于10pLpH 8.0的TE溶液中，充分漂洗管壁。
3以從酒中提取的pUC57質粒DNA為模板，以SEQ ID NO.ll和SEQ ID N0.12進 行PCR反應，擴增目的條帶為174bp 。
25pLPCR反應體系為2xPCRMix (天根生化科技有限公司)12.5pL， 1Onmol/L上、 下游引物各lpL，模板DNA5^iL，補水至25pL。
循環參數為94'C，預變性5min。 94'C變性30s， 55。C退火30s， 72'C延伸lmin， 重復10個循環，每個循環退火溫度降0.5'C;然后94。C變性15s， 50。C退火30s， 72。C延 伸lmin，重復20個循環；最后72'C延伸5min。
94取PCR產物7pL,采用質量比2.0%的瓊脂糖凝膠含0.005%GOLDView， 0.5xTBE 電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳結果。電泳結果出現174bp的目 的條帶即為真酒，不出現目的條帶或大小不相符即為假酒。
實施例七以向白酒中加入豬基因組DNA片段為例鑒別白酒真偽
1按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明提取 豬肉中基因組DNA。
2以提取的豬的基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14進行PCR 反應，擴增目的條帶為600bp 。 25^LPCR反應體系為2xPCRMixl2.5pL， 1Opmol/L上、 下游引物各1HL，模板DNAlpL，補水至25pL。循環參數為94°C， 2預變性min。 94°C 變性15s， 55。C退火30s， 68。C延伸lmin，重復10個循環；94。C變性15s， 50。C退火30s， 68。C延伸lmin,重復10個循環；94。C變性15s， 45。C退火30s， 68。C延伸lmin，重復10 個循環；68。C延伸5min。
3按照普通DNA產物純化試劑盒(天根生化科技有限公司)說明回收PCR產物。
4向500mL白酒中加入10ngPCR產物。
5提取白酒中PCR產物。
(1) 取含有PCR產物的白酒400pL置于1.5mL離心管中，加入3.Omol/L的醋酸鈉溶 液4(HiL，充分混勻。
(2) 加入900pL冰冷的無水乙醇，再加入lmol/L的氯化鎂溶液14|_iL，充分混勻。然 后至于冰上lh。
(3) 0°C， 12000r/min,離心20min，回收PCR產物。
(4) 用自動微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(5) 力B70(HiL的70X的乙醇，于4。C， 12000r/min，離心20min。
(6) 用自動微量移液器小心移出上清液，吸盡附于管壁的所有液滴。
(7) 將離心管于室溫下敞口放置在實驗臺上，直至殘留的液體揮干。
(8) 將PCR產物沉淀溶于10pLpH 8.0的TE溶液中，充分漂洗管壁。
6以從酒中提取的PCR產物為模板，以SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16進行PCR 反應，擴增目的條帶為364bp 。
25pLPCR反應體系為2xPCRMix(天根生化科技有限公司)12.5pL， 10^mol/L上、 下游引物各1HL，模板DNA5pL，補水至25pL。
循環參數為94°C，預變性5min。 94。C變性30s， 55'C退火30s, 72。C延伸lmin,重復10個循環，每個循環退火溫度降0.5t:;然后94。C變性15s， 5(TC退火30s， 72。C延 伸lmin，重復20個循環；最后72。C延伸5min。
7取PCR產物7pL，采用質量比2.0%的瓊脂糖凝膠含0.005%GOLDView， 0.5x丁BE 電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳結果。電泳結果出現364bp的目 的條帶即為真酒，不出現目的條帶或大小不相符即為假酒。序列表
<110>南京農業大學
<120> —種利用核酸檢測技術鑒別白酒真偽的方法
<130> 說明書
<160> 16
<170> Patentin version 3.1
<210> 1
<211> 22
<212> DNA <213>人工合成
<400> 1
tggacttaac actgctattg cc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 2
ctctctacct tggagggctg a 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213>人工合成
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<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 4
gagtcccgtg gcagcagag 19
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<211> 28
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<210> 6
<211> 24
<212> DNA
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<210> 7
<2H> 30
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 7
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<210> 8
<211> 26
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<213>人工合成
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tcggatcctt agttagaagc tgcttg 26
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 9
cacaagcggc aagcaatc 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 10
gcggcgtcag aagggtta 18 <210> 11 <211> 24<212> DNA <213>人工合成 <400> 11
cgccagggtt ttcccagtca cgac <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213>人工合成 <400> 12
gagcggataa caatttcaca cagg <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213>人工合成 <400> 13
tgtcttcttc ctcagtggtc gtgct <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213>人工合成 <400> 14
ccaatcagca ggctcatggt acaa <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213>人工合成 <400> 15
ggctgcactg cttgaaggca c <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213>人工合成 <400> 16
ggctctgggc tccatgaggg
權利要求
1.一種利用核酸檢測技術鑒別白酒真偽的方法，其特征在于(1)向白酒中加入一種DNA溶液。(2)采用乙醇沉淀的方法提取酒中所加入的DNA。(3)以提取的DNA作為模板，以相應的引物進行PCR反應，取PCR產物7μL，采用質量比2.0％的瓊脂糖凝膠含0.005％GOLDView，0.5×TBE電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳結果。(4)真偽鑒別標準電泳結果出現目的條帶且大小與所加入的DNA片斷設計值相符即為真酒，不出現目的條帶或大小不相符即為假酒。
2. 如權利要求l所述的鑒別白酒真偽的方法，其特征在于所述DNA來自動物、 植物、微生物或人工合成的基因組DNA或基因片段。
3. 如權利要求1所述的鑒別白酒真偽的方法在所有品牌白酒真偽鑒別方面的應用。
全文摘要
本發明涉及一種利用核酸檢測技術鑒別白酒真偽的方法，屬于生物高技術領域。向白酒中加入一種DNA溶液，然后提取酒中所加入的DNA，采用PCR反應檢測目的基因，根據電泳結果中擴增產物的有無及大小判斷白酒的真偽。該方法具有快速、簡單、準確、特異性強、靈敏度高的特點。適合為各白酒生產廠家、各級質量監督、市場監管部門提供技術支持，讓他們在維權執法中主動、迅速、準確的采取行動，保護企業和消費者的合法權益。
文檔編號C12Q1/68GK101665825SQ200910035889
公開日2010年3月10日 申請日期2009年10月9日 優先權日2009年10月9日 公開號200910035889.發明者姚大偉, 楊德吉, 許家榮, 新 鄭 申請人:南京農業大學