專利名稱：連續酶解與超濾分離偶聯制備麥胚蛋白ace抑制肽的方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，具體涉及功能食品生產技術和生物制藥領域，特指連續酶
解與超濾分離偶聯術制備小麥胚芽蛋白ACE抑制肽方法。
背景技術：
血管緊張素轉化酶(ACE)對機體血壓和心血管功能起著重要的調節作用。ACE抑制劑 通過抑制ACE從而阻止血管緊張素I轉化為具有強烈收縮血管作用的血管緊張素II ，同時 阻止ACE對具有舒張血管作用舒緩激肽的降解，從而達到降血壓的目的。
小麥胚芽是面粉加工中的主要副產物，也是小麥中營養最豐富的部分，其含量在小麥 籽粒中約為2%-3%，其中含有極其豐富的優質蛋白質、脂肪、維生素、淀粉等物質。 目前從小麥胚芽中提取小麥胚芽油已經商業化生產，并得到消費者的青睞。脫脂后的 小麥胚芽粕蛋白質含量約為30%左右，其氨基酸組成合理，具有較高的營養價值。目 前麥胚蛋白主要用做功能性配料。小麥胚芽蛋白中疏水性氨基酸的含量高，占總氨基酸 的47%左右，根據ACE抑制肽定量構效模型(QSAR)表明，末端疏水性氨基酸是高活性 ACE抑制肽的一個重要的組成條件，因此麥胚蛋白是開發ACE抑制肽良好的蛋白資源。
目前國內外對麥胚蛋白ACE抑制肽的研究報道有1999年日本的Toshiro Matsui等人酶 解麥胚蛋白得到16種ACE抑制肽，它們對原發性高血壓大鼠(SHR)有降血壓效果；2003 年我國辛志宏等研究發現3， 000 Dalton以下的脫脂麥胚蛋白酶解物對S冊有良好降壓作用。 以上報道表明麥胚ACE抑制肽產品具有降血壓功能，對其開發生產很有前景。
但是現有的麥胚ACE抑制肽的研究工作主要是通過間歇酶解法，然后進行下游分離， 間歇酶解法存在著以下一些重要缺陷酶解效率低下、單位酶資源利用率低；產物過度降 解，降低了產物活性；工藝不連續和純化方法繁瑣。這些問題嚴重制約了該產品的生產和 市場化進程。
發明內容
本發明的目的是用連續酶解與超濾分離偶聯技術制備小麥胚芽蛋白ACE抑制肽及用途。
本發明上述目的是通過以下技術手段來實現脫脂小麥胚芽粉進行粉碎、用中溫淀粉
酶法提取麥胚蛋白。對麥胚蛋白溶液進行均質，再對麥胚蛋白溶液采用蛋白連續酶解與超 濾分離偶聯的技術進行麥胚降血壓肽的制備與分離，最后通過濃縮與干燥得到粉狀的麥胚 降血壓肽產品。將脫脂小麥胚芽粉按照8%-12%的濃度溶于水，在pH值8-9. 5下攪拌0. 5h-lh，離心 獲得上清液調節pH值到6. 0-7. 5采用中溫淀粉酶在60°C-7(TC下酶解120 -240min，加酶 量為1%-2.5%(w/v);酶法降解淀粉后，調節pH到4-4.5，得到沉淀，用水溶解稀釋，調 節pH值至中性，噴霧干燥或冷凍干燥。將提取的小麥胚芽胚芽蛋白配置成底物濃度為1%-3% 的溶液，用均質機進行均質，隨后進行酶膜耦合水解，采用加酶量為麥胚蛋白重量的2%-8% (w/w) ,pH為6-9,溫度37'C-5(TC。酶解反應液送入到超濾裝置，產物溶液透過超濾膜， 沒有反應的底物和酶溶液繼續回到反應器中反應，超濾膜的截留分子量為l-5kDa，超濾壓 力維持在0.3-1.5kg/cm2，出肽速率為5-12ml/rain。同時根據透過產物的量，補充麥胚溶 液進入反應釜，根據反應釜中pH的變化，通過自動裝置動態進行pH的調節，維持在所需 的pH值附近。透過液用真空濃縮裝置濃縮至固形物含量30%左右，用噴霧干燥進行干燥， 得到粉狀的麥胚ACE抑制肽產品。
本發明所具有的優點是采用連續酶解與超濾分離偶聯技術，將產物不斷在線分離避 免其過度酶解，同時酶得到循環利用，提高了單位酶的利用率。此外，避免了間歇操作中 的滅酶操作，實現了制備麥胚蛋白ACE抑制肽工藝的連續性。
圖1是本發明利用連續酶解與超濾分離偶聯技術制備小麥胚芽蛋白ACE抑制肽的方法 的工藝流程；
圖2本發明連續酶解與超濾分離偶聯技術制備小麥胚芽蛋白ACE抑制肽的采用的裝 置l-加堿器；2-補料泵；3-原料釜；4-恒溫水浴鍋；5-酶解反應器；6-恒溫水浴槽；7-循 環泵；8-出肽閥門；9-超濾膜組件；10-機密酸度計。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步闡述。 實施例1
將脫脂小麥胚芽粉按照10% (w/v)的濃度加入水中，在pH值9.5下攪拌0.5h，離心 獲得上清液調節pH值到7. 0，采用中溫淀粉酶在70。C下酶解180min，加酶量為3免(w/v); 酶法降解淀粉后，調節pH到4.5，得到沉淀，用水溶解稀釋，調節pH值至中性，噴霧干燥。
稱取5kg麥胚蛋白，加入50倍重量的去離子水，攪拌溶解，配置成2%的溶液，均質后加入麥胚蛋白質量的8°/。 (w/w)的堿性蛋白酶,維持反應液pH值為9.0，在40'C進行酶解 反應。酶解反應液送入到超濾裝置，產物溶液透過超濾膜，沒有反應的底物和酶溶液繼續 回到反應器中反應，超濾膜的截留分子量為5kDa，超濾壓力維持在1.2kg/cm2,出肽速率 為12ml/min。同時根據透過產物的量，補充相同濃度麥胚溶液進入反應釜，根據反應釜中 pH的變化，通過自動裝置動態進行pH的調節，維持在pH9.0。透過液用真空濃縮裝置濃 縮至固形物含量30%左右，用噴霧干燥進行干燥，得到粉狀的麥胚ACE抑制肽產品，用高 效液相色譜法測定ACE的ICs。值(使測定時的ACE5(^的活性受到抑制所需要的ACE抑制肽 濃度，ACE抑制肽的ICs。值越低，其對ACE的抑制效果越高)，即分別用O.lmol/L pH8.3 硼酸緩沖液(含0.3mol/L NaCl)配置稀釋成不同濃度樣品與三肽(馬尿酸_組氨酸-亮氨 酸)反應30min，以高效液相色譜測定反應各自生成的馬尿酸的量，計算不同濃度ACE抑 制肽對ACE的抑制率，根據抑制肽的濃度與相應的抑制率回歸模型，求出抑制率達50%時 的ACE抑制濃度。經測定此實例ACE的ICs。值為0. 875mg/mL。 實施例2
將脫脂小麥胚芽粉8% (w/v)的濃度加入水中，在pH值8. 5下攪拌0. 5h，離心獲得 上清液調節pH值到6. 5，采用中溫淀粉酶在6(TC下酶解240min，加酶量為l%(w/v);酶 法降解淀粉后，調節pH到4，得到沉淀，用水溶解稀釋，調節pH值至中性，噴霧干燥。
稱取5kg麥胚蛋白，加入100倍重量的去離子水，攪拌溶解，配置成1%的麥胚溶液， 均質后加入堿性蛋白酶，加酶量為麥胚蛋白質量的6% (w/w)，維持反應液pH值為8.0，在 5(TC進行酶膜耦合反應。酶解反應液送入到超濾裝置，產物溶液透過超濾膜，沒有反應的 底物和酶溶液繼續回到反應器中反應，超濾膜的截留分子量為3kDa，超濾壓力維持在0. 3kg / cm2，出肽速率為6ml/min。同時根據透過產物的量，補充相同濃度麥胚溶液進入反應釜， 根據反應釜中pH的變化，通過自動裝置動態進行pH的調節，維持在所需的pH值附近。 透過液用真空濃縮裝置濃縮至固形物含量30%左右，用噴霧干燥進行干燥，得到粉狀的麥 胚ACE抑制肽產品，經測定其對ACE的ICs。值為0. 778mg/mL。 實施例3
將脫脂小麥胚芽粉12% (w/v)的濃度加入水中，在pH值9.5下攪拌0.5h，離心獲得 上清液調節pH值到7. 5，采用中溫淀粉酶在7(TC下酶解120min，加酶量為2. 5%(w/v); 酶法降解淀粉后，調節pH到4，得到沉淀，用水溶解稀釋，調節pH值至中性，噴霧干燥。
稱取5kg麥胚蛋白，加入100倍重量的去離子水，攪拌溶解，配置成1%的麥胚溶液， 均質后加入中性蛋白酶，加酶量為麥胚蛋白質量的4%，維持反應液pH值為7.0，在45。C進行酶膜耦合反應。酶解反應液送入到超濾裝置，產物溶液透過超濾膜，沒有反應的底物和 酶溶液繼續回到反應器中反應，超濾膜的截留分子量為lkDa，超濾壓力維持在1. 0kg / cm2, 出肽速率為9ml/rain同時根據透過產物的量，補充相同濃度麥胚溶液進入反應釜，根據反 應釜中pH的變化，通過自動裝置動態進行pH的調節，維持在所需的pH值附近。透過液 用真空濃縮裝置濃縮至固形物含量30%左右，用噴霧干燥進行干燥，得到粉狀的麥胚ACE 抑制肽產品，經測定其對ACE的ICs。值為0.801mg/mL。 實施例4
將脫脂小麥胚芽粉按照10% (w/v)的濃度加入水中，在pH值9.0下攪拌0.5h，離心 獲得上清液調節pH值到6. 0,釆用中溫淀粉酶在70'C下酶解180min，加酶量為1% (w/v); 酶法降解淀粉后，調節pH到4，得到沉淀，用水溶解稀釋，調節pH值至中性，噴霧干燥。
稱取5kg麥胚蛋白，加入100倍重量的去離子水，攪拌溶解，配置成1%的麥胚溶液， 均質后加入胰凝乳蛋白酶，加酶量麥胚蛋白質量的為8%，維持反應液pH值為7.0，在37 'C進行酶膜耦合反應。酶解反應液送入到超濾裝置，產物溶液透過超濾膜，沒有反應的底 物和酶溶液繼續回到反應器中反應，超濾膜的截留分子量為lkDa，超濾壓力維持在1.5kg / cm2，出肽速率為8ml/min。同時根據透過產物的量，補充相同濃度麥胚溶液進入反應釜， 根據反應釜中pH的變化，通過自動裝置動態進行pH的調節，維持在所需的pH值附近。 透過液用真空濃縮裝置濃縮至固形物含量30%左右，用噴霧干燥進行干燥，得到粉狀的麥 胚ACE抑制肽產品，經測定其對ACE的ICs。值為0. 903mg/mL。
權利要求
1、連續酶解與超濾分離偶聯法制備小麥胚芽蛋白血管緊張素轉換酶(ACE)抑制肽的方法，其特征在于按照下述步驟進行(1)先從粉碎的脫脂小麥胚芽粕中提取小麥胚芽蛋白；(2)對麥胚蛋白溶液進行均質，再對麥胚蛋白溶液采用蛋白酶解與超濾分離偶聯技術進行麥胚ACE抑制肽的制備與分離；(3)通過濃縮與干燥得到粉狀的麥胚ACE抑制肽產品。
2、 根據權利要求1所述的連續酶解與超濾分離偶聯法制備小麥胚芽蛋白ACE抑制肽 的方法，其特征在于小麥胚芽蛋白提取的方法為將脫脂小麥胚芽粉按照8%-12%的濃度 溶于水，在pH值8-9. 5下攪拌0. 5h-lh，離心獲得上清液調節pH值到6.0-7.5;加中溫 淀粉酶在60°C-70。C下酶解120 -180rain，加酶量以重量與體積比為1%-3%;酶法降解淀 粉后，調節pH到4-4.5,得到沉淀，用水溶解稀釋，調節pH值至中性，噴霧干燥或冷凍 干燥得小麥胚芽分離蛋白。
3、 根據權利要求1所述的連續酶解與超濾分離偶聯技術制備小麥胚芽蛋白ACE抑制 肽的方法，其特征在于:將分離得到的小麥胚芽蛋白進配制成底物濃度為1%-3%的溶液， 加入以小麥胚芽蛋白重量計的2%-8%的蛋白酶,調節pH為6-9，溫度37'C-5(TC，控制產 物不斷透過超濾膜，同時以相同速度補充小麥胚芽蛋白溶液進入反應釜，沒有反應的底物 和蛋白酶溶液繼續回到反應釜中反應，超濾膜的截留分子量為1-5kDa，超濾壓力維持在 0.3-1.5 kg/cm2，出肽速率為5-12ral/min。根據反應釜中pH的變化，通過自動裝置動態 進行pH的調節，維持反應在所需的pH值附近。
4、 根據權利要求1所述的連續酶解與超濾分離偶聯技術制備小麥胚芽蛋白ACE抑制 肽的方法，其特征在于將超濾透過液真空濃縮至固形物含量30%,用噴霧干燥進行干燥， 得到粉狀的麥胚ACE抑制肽產品。
5、根據權利要求1或權利要求3所述的連續酶解與超濾分離偶聯技術制備小麥胚芽蛋 白ACE抑制肽的方法，其特征在于其中選用的蛋白酶為胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶 K、堿性蛋白酶、中性蛋白酶或者由其任意構成的復合蛋白酶。
6、根據權利要求1所述采用連續酶解與超濾分離偶聯法所制備得到小麥胚芽蛋白血 管緊張素轉換酶(ACE)抑制肽的用途，其特征在于用于制備具有抑制體內血管緊張轉 換酶ACE的活性的藥物或保健食品。
全文摘要
連續酶解與超濾分離偶聯法制備小麥胚芽蛋白血管緊張素轉換酶(ACE)抑制肽的方法，該方法按照下述步驟進行將脫脂小麥胚芽粉進行粉碎，用中溫淀粉酶法提取麥胚蛋白；對麥胚蛋白溶液進行均質后采用蛋白連續酶解與超濾分離偶聯的技術進行麥胚降血壓肽的制備與分離，最后通過濃縮與干燥得到粉狀的麥胚降血壓肽產品。該方法可以使產物不斷在線分離避免其過度酶解，同時酶得到循環利用，提高了單位酶的利用率；此外，避免了間歇操作中的滅酶操作，實現了制備麥胚蛋白ACE抑制肽工藝的連續性。通過該方法制備得到麥胚蛋白ACE抑制肽可用于制備具有抑制體內血管緊張轉換酶ACE的活性的藥物或保健食品。
文檔編號A23L1/305GK101514355SQ20091003001
公開日2009年8月26日 申請日期2009年3月31日 優先權日2009年3月31日
發明者何榮海, 王振斌, 趙偉睿, 馬海樂, 琳 駱 申請人:江蘇大學