專利名稱：一種生物發酵提純他克莫司的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，具體涉及生物發酵，生物制藥，發酵產物的提取、 分離和純化方法，特別涉及一種生物發酵提純他克莫司的方法。
背景技術：
他克莫司(tacrolimus, FK506)是由日本藤澤藥品工業公司探索研究所于 1984年自日本筑波山土壤中分離的筑波鏈霉菌(S&印towj;cM ) No.9993的發酵液中提取得到的一種新型二十三元大環內酯聚酮免疫抑制劑。臨 床研究表明，其免疫抑制活性是環孢菌素A的10 100倍。目前已廣泛應用于肝 臟、骨髓移植、對其他藥物耐藥腎移植的排斥防治、白塞氏病、變應性皮炎、銀 屑病、魚鱗病、斑禿、類風濕性關節炎、牛皮癬、多發性硬化病、糖尿病等多種 自身免疫疾病的治療。自在中國上市的短短時間內，市場份額迅速上升，已成為 肝臟及腎臟移植后排斥反應的臨床一線藥物。
他克莫司的合成方法主要有①生物發酵法。主要由筑波鏈霉菌 C，ow少t^加A:w6aem7i)、 吸zK鏈霉菌(5fr，omycey/z少gmsrc;pz'cm)生物發 酵得到。KinoT.等1984年首次從筑波鏈霉菌中分離出他克莫司。②有機合成法。 Todd K. Jones等1990年在歐洲專利EP378, 318中首次公布了他克莫司的有機合 成方法。由于他克莫司是二十三元大環內酯，有機合成過程中工藝步驟繁多，反 應條件苛刻，合成成本昂貴。因此主要用生物發酵法制備他克莫司。
國內在他克莫司提純方面的研究起步較晚。從90年代中后期華北制藥和華 東制藥對他克莫司產生菌進行了初步誘變選育，上海農藥所公開了一株新的他克 莫司產生菌及生產方法，發酵產物他克莫司的平均濃度為150ug/mL，但對于如 何分離提取產物并未具體說明。國外分離提純他克莫司主要有兩種方法①分別 加工菌絲體和發酵液，如KinoT. "a/. J. Antibiot. 1987, 40, 1249-1255中所述。② 利用疏水性溶劑直接萃取發酵液，如專利WO03/68980中所述。由于發酵液中存 在多種他克莫司類似物，生物效價不高，并且存在于菌絲體和發酵液之中，有效 的分離提純他克莫司很有難度，使得國內在發酵液中提純他克莫司的主要技術研 究方面尚屬空白。
發明內容
本發明的目的在于針對上述現有技術中存在的缺陷或不足，提供一種采用生 物發酵提純他克莫司的方法。本發明的技術方案為利用自主篩選鑒定的鏈霉菌S加/^mj;cM sp. NJYH2618，通過微生物發酵培養出含他克莫司的發酵液，他克莫司發酵液經種 子的培養、接種前準備及接種、多階段溶氧控制、分批補料發酵階段得到，具體 培養方法見本發明人申請的專利(申請號為200810234807.6);并采用菌絲體抽 提、發酵液萃取、大孔樹脂吸附、硅膠柱層析及冷卻結晶技術得到他克莫司純品。 本發明操作方便、工藝簡單、成本低廉，適合工業化生產。
本發明的具體技術方案 一種生物發酵提純他克莫司的方法，其特征在于利 用自主篩選鑒定的鏈霉菌S加; tofl^cM sp. NJYH2618，通過微生物發酵培養出含 他克莫司的發酵液，采用菌絲體抽提、發酵液萃取、大孔樹脂吸附、硅膠柱層析 及冷卻結晶技術得到他克莫司純品。
具體步驟如下-
1) 用發酵過濾后的菌絲體5 10倍體積的有機溶劑抽提2 3次鏈霉菌S^^om;;cM sp. NJYH2618發酵過濾后的菌絲體，得菌絲體抽提液并分離殘留物；
2) 用發酵上清液1~2倍體積的疏水性溶劑萃取鏈霉菌泣r印tom;;cM sp. NJYH2618 發酵上清液，控制溶液溫度和pH值，得疏水性萃取液；
3) 合并菌絲體抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液經超濾膜過濾后，進入 裝有大孔樹脂的床層進行吸附，其中大孔樹脂體積與合并液體積比為1: 5~1: 20，用l-4倍大孔樹脂體積的有機溶劑迸行沖洗，并用1/3~1倍大孔樹脂體積的 有機溶劑進行解吸，控制溶液溫度和pH值，得解吸液；
4) 真空濃縮解吸液，并用K4倍解吸液體積的乙酸乙酯或丙酮提取解吸液，無 水硫酸鈉或無水硫酸鎂脫水，再次真空濃縮；將真空濃縮后的濃縮液經與濃縮液 體積比為l: 10~1: 20的甲醇-水混合溶液溶解，在反相硅膠柱中用和濃縮液體 積比為l: 2~1: 7的硅膠進行層析分離，用2~3倍硅膠體積的洗脫劑進行洗脫， 收集含他克莫司的活性組分；
5) 真空濃縮含他克莫司的活性組分，并將活性組分溶于2 5倍體積的結晶溶劑 中冷卻結晶得到他克莫司。
上述的步驟l)中有機溶劑為丙酮、乙酸乙酯或甲醇。上述的步驟2)中疏 水性溶劑為丙酮、乙酸乙酯或甲苯。步驟3)中沖洗的有機溶劑為體積濃度 45~55%丙酮或甲醇；解吸的有機溶劑為體積濃度70~80%丙酮或甲醇；步驟4) 中洗脫劑為體積濃度50~75%甲醇或乙醇；上述的步驟5)中結晶溶劑為乙腈、 甲醇或乙醇。
上述步驟2)中萃取過程中控制溶液溫度為15~35°C， pH6-12;步驟3)中沖 洗和解吸過程中控制溶液溫度為15~35°C， pH6-12;步驟4)中用乙酸乙酯或丙 酮提取解吸液的次數為2-3次；混合溶液中甲醇和水的體積比為1: 1.5;步驟5)中結晶溫度為5~25°C，結晶時間為15~60小時。
所述的鏈霉菌為本實驗室自主篩選，其分類命名為鏈霉菌，菌種的拉丁學名 是&r印to/^ceysp.，分類株NJYH2618，并保藏于中國普通微生物菌種保藏管 理中心，其簡稱為CGMCC，登記入冊的編號是CGMCCNo.2519，保藏時間是 2008年5月26日(見本發明人申請的專利，申請號為200810234807.6)。
有益效果
釆用本發明的生物發酵提純他克莫司的方法，利用自主篩選鑒定的鏈霉菌 5^印to，c^sp.NJYH2618，通過微生物發酵培養出含他克莫司的發酵液，采用 菌絲體抽提、發酵液萃取、大孔樹脂吸附、硅膠柱層析及冷卻結晶技術得到他克 莫司純品，純度〉98%，收率83%~93%。本發明操作方便、工藝簡單、成本低廉， 適合工業化生產。
具體實施例方式
本發明提供一種生物發酵提純他克莫司的方法，下面列舉實施例予以進一步 說明。本發明實施例所用的發酵液見本發明人申請的專利(申請號為 200810234807.6)實施例3所發酵得到的發酵液，并將發酵液進行過濾，得發酵 過濾后的菌絲體和發酵上清液； 實例1:
1) 用5倍體積的丙酮抽提2次鏈霉菌Sf^^ow少c^ sp. NJYH2618發酵過濾后的 菌絲體，得菌絲體抽提液并分離殘留物；
2) 用等體積的乙酸乙酯萃取鏈霉菌S/w; tow少c^ sp. NJYH2618發酵上清液，溫 度為25'C， pH7.5，得疏水性萃取液；
3) 合并菌絲體抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液經截留分子量為1000 的聚醚砜超濾膜，去除蛋白質和多糖等大分子物質，再進入裝有D101大孔樹脂 的床層進行吸附，其中大孔樹脂體積與合并液體積比為1: 5，用2倍大孔樹脂 體積的體積濃度45%丙酮沖洗，并用1/3倍大孔樹脂體積的體積濃度70%丙酮解 吸，溫度為25。C， pH7.5，得解吸液；
4) 真空濃縮解吸液并用2倍體積的乙酸乙酯提取2次解吸液，無水硫酸鈉脫水， 再次真空濃縮；將濃縮后的濃縮液經與濃縮體積比為1: 10的甲醇-水(l: 1， V/V)溶解，用硅膠-提取液(1: 2， V/V)的反相硅膠柱層析分離，2倍硅膠體 積的體積濃度50%甲醇作為洗脫劑，結合高效液相檢測收集含他克莫司的活性組 分；
5) 真空濃縮高效液相檢測的活性組分，將活性組分溶于2倍體積的乙腈中，冷 卻于1(TC下保持約24小時，純度>98%，收率85%。實例2:
1) 用8倍體積的丙酮抽提2次鏈霉菌S^戶tomj;cM sp. NJYH2618發酵過濾后的 菌絲體，得菌絲體抽提液并分離殘留物；
2) 用1.5倍體積的丙酮萃取鏈霉菌5^印tow少CM.sp.NJYH2618發酵上清液，溫 度為25。C， pH8.0，得疏水性萃取液；
3) 合并菌絲體抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液經截留分子量為1000 的聚醚砜超濾膜，去除蛋白質和多糖等大分子物質，再進入裝有SP207大孔樹 脂的床層進行吸附，其中大孔樹脂體積與合并液體積比為1: 10，同2倍大孔樹 脂體積的體積濃度50%甲醇沖洗，并用1/2倍大孔樹脂體積的體積濃度75%甲醇 解吸，溫度為25"C， pH8.0，得解吸液；
4) 真空濃縮解吸液并用3倍體積的乙酸乙酯提取解吸液2次，無水硫酸鎂脫水， 再次真空濃縮；將濃縮后的濃縮液經與濃縮體積比為1: 15的甲醇-水(l: 1， V/V)溶解，用硅膠-提取液(1: 5， V/V)的反相硅膠柱層析分離，2.5倍硅膠 體積的體積濃度60%甲醇作為洗脫劑，結合高效液相檢測收集含他克莫司的活性 組分。
5) 真空濃縮高效液相檢測的活性組分，將活性組分溶于3倍體積的甲醇中，冷 卻于5。C溫度下保持約20小時，純度>98%，收率92%。
實例3:
1) 用10倍體積的乙酸乙酯抽提2次鏈霉菌S/r印tomyc^ sp. NJYH2618發酵過濾 后的菌絲體，得菌絲體抽提液并分離殘留物；
2) 用2倍體積的丙酮萃取鏈霉菌S加; toff^c"sp.NJYH2618發酵上清液，溫度 為25'C， pH7.0，得疏水性萃取液；
3) 合并菌絲體抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液經截留分子量為1000 的聚醚砜超濾膜，去除蛋白質和多糖等大分子物質，再進入裝有D315大孔樹脂 的床層進行吸附，其中大孔樹脂體積與合并液體積比為1: 20，用4倍大孔樹脂 體積的體積濃度55%丙酮沖洗，并用與大孔樹脂體積的相同體積濃度80%丙酮 解吸，溫度為25。C， pH7.0，得解吸液；
4) 真空濃縮解吸液并用4倍體積的丙酮提取3次解吸液，無水硫酸鈉脫水，再 次真空濃縮；將濃縮后的濃縮液經與濃縮液體積比為1: 20的甲醇-水(l: 1.5， V/V)溶解，用硅膠-提取液(1: 7， V/V)的反相硅膠柱層析分離，3倍硅膠體 積的體積濃度75%乙醇作為洗脫劑，結合高效液相檢測收集含他克莫司的活性組 分；
5) 真空濃縮高效液相檢測的活性組分，將活性組分溶于5倍體積的乙醇中'冷 卻于15。C溫度下保持約48小時，純度>98%'收率88%。
權利要求
1. 一種生物發酵提純他克莫司的方法，其特征在于利用自主篩選鑒定的鏈霉菌Streptomyces sp.NJYH2618，通過微生物發酵培養出含他克莫司的發酵液，采用菌絲體抽提、發酵液萃取、大孔樹脂吸附、硅膠柱層析及冷卻結晶技術得到他克莫司純品。
2. 根據權利要求1所述的方法，具體步驟如下-1)用發酵過濾后的菌絲體5~10倍體積的有機溶劑抽提2 3次鏈霉菌S/re;^w;;c^ sp.NJYH2618發酵過濾后的菌絲體，得菌絲體抽提液并分離殘留物；2) 用發酵上清液1~2倍體積的疏水性溶劑萃取鏈霉菌Srrwtom^^ sp. NJYH2618 發酵上清液，控制溶液溫度和pH值，得疏水性萃取液；3) 合并菌絲體抽提液和疏水性萃取液得合并液，合并液經超濾膜過濾后，進入裝有大孔樹脂的床層進行吸附，其中大孔樹脂體積與合并液體積比為1: 5~1:20，用1 4倍大孔樹脂體積的有機溶劑進行沖洗，并用1/3~1倍大孔樹脂體積的有機溶劑進行解吸，控制溶液溫度和pH值，得解吸液；4) 真空濃縮解吸液，并用1 4倍解吸液體積的乙酸乙酯或丙酮提取解吸液，無 水硫酸鈉或無水硫酸鎂脫水，再次真空濃縮；將真空濃縮后的濃縮液經與濃縮液 體積比為l: 10 1: 20的甲醇-水混合溶液溶解，在反相硅膠柱中用和濃縮液體 積比為l: 2~1: 7的硅膠進行層析分離，用2 3倍硅膠體積的洗脫劑進行洗脫， 收集含他克莫司的活性組分；5) 真空濃縮含他克莫司的活性組分，并將活性組分溶于2 5倍體積的結晶溶劑 中冷卻結晶得到他克莫司。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟l)中有機溶劑為丙酮、 乙酸乙酯或甲醇；步驟3)中沖洗的有機溶劑為體積濃度45~55%丙酮或甲醇； 解吸的有機溶劑為體積濃度70~80%丙酮或甲醇；步驟4)中洗脫劑為體積濃度 50~75%甲醇或乙醇。
4. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟2)中疏水性溶劑為丙酮、 乙酸乙酯或甲苯。
5. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟5)中結晶溶劑為乙腈、 甲醇或乙醇。
6. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟2)中萃取過程中控制溶液溫度 為15 35。C， pH6-12;步驟3)沖洗和解吸過程中控制溶液溫度為15~35°C， pH 6-12;步驟4)中用乙酸乙酯或丙酮提取解吸液的次數為2-3次；甲醇和水混合 溶液中甲醇和水的體積比為1: 1.5;步驟5)中結晶溫度為5~25°C，結晶 時間為15~60小時。
全文摘要
本發明公開了一種采用生物發酵提純他克莫司的方法，利用自主篩選鑒定的鏈霉菌Streptomyces sp.NJYH2618，通過微生物發酵培養出含他克莫司的發酵液，采用菌絲體抽提、發酵液萃取、大孔樹脂吸附、硅膠柱層析及冷卻結晶技術得到他克莫司純品，純度＞98％。本發明操作方便、工藝簡單、成本低廉，適合工業化生產。
文檔編號C12P17/18GK101481715SQ200910029010
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月20日 優先權日2009年1月20日
發明者楊文革, 胡永紅, 林 陳 申請人:南京工業大學